مقالة منهجية

استراتيجية للحساسية، مقياس كبيرة الكمية الايض

DOI:

10.3791/51358

⸱

مايو 27, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Field of Biochemistry, and Molecular Cell Biology, Cornell University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان التنميط المستقلب رصيدا قيما في دراسة التمثيل الغذائي في الصحة والمرض. استخدام العادي على مراحل اللوني السائل إلى جانب عالية الدقة قياس الطيف الكتلي مع تبديل قطبية ودورة العمل السريع، ونحن تصف البروتوكول لتحليل تكوين الأيض القطبية من المواد البيولوجية مع حساسية عالية، ودقة، والقرار.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان التنميط المستقلب رصيدا قيما في دراسة التمثيل الغذائي في الصحة والمرض. ومع ذلك، والمنصات الحالية لديها العوامل التي تحد مختلفة، مثل عمالة كثيفة عينة الاستعدادات، وحدود الكشف منخفضة، وسرعات المسح الضوئي بطيئة أو أسلوب الأمثل مكثفة لكل الأيض، وعدم القدرة على قياس إيجابا وسلبا الأيونات المشحونة في التجارب احدة. وبالتالي، يمكن لبروتوكول الايض الرواية تقدم دراسات الايض. اللوني ماء مقرها أميد-تمكن من تحليل المستقلب القطبية دون أي اشتقاق الكيميائية. عالية الدقة باستخدام MS Q-Exactive (QE-MS) قد تحسنت البصريات أيون، زيادة سرعات المسح الضوئي (256 ميللي ثانية في قرار 70،000)، ولديه القدرة على تنفيذ الإيجابية / السلبية التبديل. يستخدم إستراتيجية استخراج الميثانول الباردة، واقتران عمود أميد مع QE-MS تمكن الكشف قوية من 168 الأيض وآلاف القطبية المستهدفة من الميزات الإضافية في وقت واحد. داتويتم تجهيز خارجا مع البرمجيات المتاحة تجاريا بطريقة ذات كفاءة عالية، وميزات غير معروف المستخرجة من أطياف الشامل يمكن الاستعلام في قواعد البيانات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الايض، الذي يعرف بأنه تجربة يقيس نواتج متعددة في وقت واحد كان، وهي منطقة شديدة الأهمية. يوفر الايض قراءات مباشرة لعلم وظائف الأعضاء الجزيئية وقدمت رؤى في التنمية وأمراض مثل السرطان 1-4. الرنين المغناطيسي النووي (NMR) والغاز اللوني الطيف الكتلي (GC-MS) هي من بين الأكثر شيوعا الصكوك 5-9. NMR، وخاصة استخدمت لتدفق التجارب منذ النظائر الثقيلة المركبات المسمى، مثل C 13 الأيض المسمى، هي NMR-النشطة 10،11. ومع ذلك، يتطلب هذه الاستراتيجية عالية نسبيا نقاء عينة وكمية كبيرة العينة، الأمر الذي يحد من تطبيقاتها في الايض. وفي الوقت نفسه، البيانات التي تم جمعها من NMR تحليل الاحتياجات مكثفة وتخصيص مجمع معقدة NMR أطياف أمر صعب. وقد GC-MS تستخدم على نطاق واسع لنواتج الأيض القطبية والدراسات الدهون، لكنه يتطلب compoun متقلبةس، وبالتالي غالبا ما اشتقاق من نواتج الأيض، الذي ينطوي في بعض الأحيان الكيمياء المعقدة التي يمكن أن يكون مضيعة للوقت ويدخل الضوضاء التجريبية.

اللوني السائل (LC) بالإضافة إلى الثلاثي مطياف الكتلة رباعي يستخدم رباعي الأولى لاختيار الأيونات الأم سليمة، والتي يتم بعد ذلك مجزأة في رباعية الثانية، في حين يتم استخدام رباعي الثالث لتحديد شظايا مميزة أو الأيونات ابنة. هذا الأسلوب، الذي يسجل الانتقال من الأم إلى أيونات أيونات ابنة محددة، ويطلق متعددة رصد رد فعل (MRM). MRM هو طريقة حساسة جدا ومحددة، وقوية لكل من جزيء صغير من البروتين والكميات 12-15،21. ومع ذلك، MRM لديها حدودها. لتحقيق نوعية عالية يحتاج إلى أسلوب MRM سيتم بناؤها لكل المستقلب. يتكون هذا الأسلوب من تحديد جزء معين وما يقابلها من الطاقة الاصطدام الأمثل، الأمر الذي يتطلب قبل معرفة PROPErties من نواتج الأيض من الفائدة، مثل معلومات التركيب الكيميائي. لذلك، مع بعض الاستثناءات التي تنطوي على خسارة محايدة من شظايا مشتركة، فإنه ليس من الممكن تحديد مستقلبات غير معروفة مع هذا الأسلوب.

في السنوات الأخيرة، وقد تم إطلاق سراح عالية الدقة قياس الطيف الكتلي (HRMS) والصكوك، مثل سلسلة LTQ-orbitrap وExactive، وQuanTof، وTripleTOF 5600 16-18،22. يمكن نظام إدارة الموارد البشرية توفير الشامل لتوجيه الاتهام نسبة (م / ض) من الأيونات سليمة داخل خطأ من عدد قليل من جزء في المليون. وبالتالي، أداة نظام إدارة الموارد البشرية تعمل عن طريق الكشف عن أيونات السلائف (أي وضع المسح الضوئي الكامل) يمكن الحصول على معلومات مباشرة من الهيكلية الشامل الدقيق والتركيب العنصري مما أدى لتحليلها، ويمكن استخدام هذه المعلومات لتحديد نواتج المحتملة. في الواقع، كل المعلومات عن مركب يمكن الحصول عليها مع الشامل الدقيق، وتصل إلى مستوى أيزومرات الهيكلي. أيضا، كاملطريقة مسح لا تتطلب معرفة سابقة من نواتج الأيض و لا يتطلب الأسلوب الأمثل. علاوة على ذلك، لأن جميع الأيونات مع م / ض الوقوع في تفحص نطاق يمكن تحليلها، نظام إدارة الموارد البشرية لديها قدرة غير محدودة تقريبا من حيث عدد الأيض التي يمكن قياسها كميا في شوط واحد مقارنة مع الطريقة MRM. نظام إدارة الموارد البشرية هي أيضا قابلة للمقارنة إلى MRM رباعي الثلاثي في ​​القدرات الكمي نظرا لدورة عمل قصيرة مما أدى إلى عدد مماثل من نقاط البيانات التي يمكن الحصول عليها في MS مسح كامل. وبالتالي، يوفر نظام إدارة الموارد البشرية نهجا بديلا لالايض الكمي. في الآونة الأخيرة، ووصف نسخة محسنة من نظام إدارة الموارد البشرية Q-Exactive مطياف الكتلة (QE-MS) يمكن تشغيلها تحت التبديل بين الأوضاع الإيجابية والسلبية مع دورة مرات سريع بما فيه الكفاية في أسلوب واحد، والذي يوسع نطاق الكشف عن 19. نحن هنا تصف استراتيجية الايض لدينا باستخدام QE-MS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد LC-MS الكواشف، إنشاء طرق اللوني، وإنشاء صك إجراءات التشغيل

  1. إعداد المذيبات LC
    1. إعداد 500 مل مراحل المحمول. (أ) هو خلات الأمونيوم 20 ملي و 15 ملي هيدروكسيد الأمونيوم في 3٪ الأسيتونيتريل / المياه، ودرجة الحموضة 9.0 النهائي؛ وB هو 100٪ أسيتونتريل.
    2. فضفاضة لحد الزجاجة، وضعه في sonicator حمام الماء، ويصوتن لمدة 10 دقيقة دون تدفئة إضافية. (هذه الخطوة هو التأكد من أن كل من أملاح الأمونيوم تذوب تماما وأنه لا توجد فقاعات الهواء المتبقية.)
    3. نقل 250 مل من المذيب لزجاجة 250 مل زجاج للاستخدام LC-MS، والحفاظ على ما تبقى في 4 درجات مئوية.
  2. إعداد الحل معايرة انخفاض نطاق شامل. من المهم استخدام مجموعة مخصصة انخفاض كتلة خليط المعايرة للتطبيقات الايض لضمان الكشف عن أن الجماهير دقيقة في أوزان جزيئية منخفضة.
    1. تزن 5 ملغ من كلا سودىأم فلوروآسيتات وحمض homovanillic وحل لهم في 5 مل من الماء لجعل تركيز النهائي من 1 ملغ / مل. حل ديازينون في الميثانول لجعل تركيز النهائي من 10 ملغ / مل.
    2. لإعداد 1 مل من محلول المعايرة السلبية منخفضة الشامل، وخلط 960 مل من محلول المعايرة الحرارية السلبية مع 20 مل من fluoroaceate الصوديوم ومحلول حمض homovanillic. لجعل 1 مل من محلول المعايرة إيجابية منخفضة الشامل، وخلط 990 مل من محلول المعايرة الحرارية إيجابية و 10 مل من محلول الديازينون. (يجب أن يتم تخزين الحل معايرة انخفاض كتلة في 4 درجات مئوية، ويكون مستعدا جديدة كل 2 أشهر.)
  3. معايرة QE-MS في نطاق كتلة منخفضة
    1. قبل تنفيذ منخفض مجموعة كتلة المعايرة، وإجراء معايرة الكتلة القياسية (م / ض، 150-2،000) في أوضاع كل من الإيجابية والسلبية بناء على تعليمات الشركة المصنعة.
    2. مرة واحدة يمر معايرة الكتلة العادية، وضبط لمسح مجموعة 60-900 م / ض في لوحة التحكم الصكويتم تطبيق CID مصدر 25 فولت لوضع إيجابي و 35 إلكترون فولت لوضع سلبي. (وهذا يعطي إشارات قوية من الكافيين جزء ايون وايون الكبريتات. تم إصلاح مسح مجموعة هنا، وذلك لأن مشاركة م / ض لا ينبغي أن يكون أكبر من 15X بدءا من م / ض)
    3. مرة واحدة المصدر أيون مستقرة، ثم إجراء معايرة حسب الطلب. ملاحظة: يتم تعريف مصدر مستقر وأقل من 10٪ من إجمالي التباين أيون الحالية في وضع إيجابي، وأقل من 15٪ في وضع سلبي. يتم سرد أيونات المعايرة حسب الطلب والمقابلة م / ض في الجدول 1.
  4. إنشاء الأجهزة LC-MS لتحليل المستقلب القطبية. ويقترن LC إلى QE-MS لفصل الأيض والكشف.
    1. تجهيز QE-MS مع بتدفئة التحقيق التأين electrospray (H-ESI). تعيين المعلمات ذات الصلة لضبط التحقيق على النحو المبين: درجة حرارة سخان، و 120 درجة مئوية؛ الغاز غمد، 30؛ الغاز المساعدة، 10؛ اكتساح الغاز، 3؛ رذاذ الجهد، 3.6 كيلو فولت لوضع إيجابية و 2.5 كيلو فولت لوضع سلبي. ضبط درجة الحرارة الشعرية في 320 درجة مئوية، وS-العدسة في 55.
    2. بناء طريقة مسح كامل على النحو التالي: كامل تفحص نطاق: 60-900 (م / ض)؛ القرار: 70،000؛ الحد الأقصى للوقت حقن: 200 ميللي ثانية مع أوقات نموذجية حقن حوالي 50 مللي ثانية؛ التحكم الآلي مكسب (AGC): 3،000،000 الأيونات. هذه الإعدادات تؤدي إلى دورة العمل من حوالي 550 ميللي ثانية لتنفيذ عمليات التفحص في وضع حد سواء الإيجابية والسلبية.
    3. إنشاء الأسلوب اللوني. توظيف عمود أميد (100 × 2.1 مم الهوية، 3.5 ملم) لفصل المركب في درجة حرارة الغرفة 13،15. الطور المتحرك (أ) هو كما هو موضح أعلاه، والطور المتحرك B هو أسيتونتريل. استخدام الانحدار الخطي كما يلي: 0 دقيقة، 85٪ B؛ 1.5 دقيقة، 85٪ B، 5.5 دقيقة، 35٪ B؛ 10min، 35٪ B، 10.5 دقيقة، 35٪ B، 14.5 دقيقة، 35٪ B، 15 دقيقة، 85٪ B، و 20 دقيقة، و 85٪ B. معدل تدفق 0.15 مل / دقيقة 0-10 دقيقة و 15 إلى 20 دقيقة، و 0.3 مل / دقيقة 10،5-14،5 دقيقة.

2. العلاقات العامةeparation العينات المستقلب

  1. إعداد المذيبات استخراج. خلط 40 مل الميثانول (LC-MS الصف) و 10 مل من الماء (LC-MS الصف) في أنبوب 50 مل، ويبقيه في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام. ملاحظة: هذا الإجراء والخطوات التالية يمكن تعديلها لاستخراج عينات الأنسجة البيولوجية والسوائل.
    1. ثقافة القولون HCT السرطان 8 خلايا في ثلاثة أطباق 10 سم أو 6 لوحات جيدة مع متوسط ​​النمو الكامل، 1640 RPMI تستكمل مع 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني و 100،000 وحدة / L البنسلين و 100 ملغم / لتر الستربتوميسين.
    2. عندما تصل خلايا التقاء 80٪، وإزالة بسرعة متوسطة، ووضع طبق أو لوحة على رأس 13،15 الثلج الجاف. إضافة 1 مل الاستخلاص بالمذيبات على الفور (80٪ الميثانول / الماء)، ونقل لوحة إلى -80 ° C الفريزر. لطبق 10 سم، وإضافة 3 مل من الاستخلاص بالمذيبات إلى كل بئر. (في محاولة لإزالة المتوسطة قدر الإمكان لتجنب تأثير قمع أيون بسبب الأملاح المتبقية من المتوسط.)
    3. ترك لوحة لمدة 15 دقيقة. إزالته من الثلاجة، وتتخلص من الخلايا في المذيب على الثلج الجاف. نقل الحل إلى 1.7 مل أنابيب إيبندورف، وأجهزة الطرد المركزي مع سرعة 20،000 XG في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. (إعداد نواتج الأيض الخلوي من ثلاثة أطباق منفصلة لجعل ثلاث عينات تكرار. الغرض من حفظ أنبوبين هو أن يكون واحدا على سبيل الاحتياط.)
    4. نقل طاف لاثنين من أنابيب إيبندورف جديدة، وتجفيفها في فراغ السرعة. وهذا يستغرق حوالي 3-6 ساعة اعتمادا على الفراغ سرعة استخدامها. (العينات ويمكن أيضا أن تجفف بين عشية وضحاها تحت غاز النيتروجين.)
    5. بعد التجفيف، وتخزين الأنابيب من كل عينة في الفريزر -80 درجة مئوية. عندما تصبح جاهزة، إعادة عينة واحدة في 20 مل من الماء (LC-MS الصف)، وحقن 5 مل لLC-MS-التيسير الكمي للتحليل.

3. إعداد عينة من تسلسل

  1. مرة واحدة وقد تم تنفيذ معايرة بشكل صحيح خارج على QE-MS، تتوازن العمود LC لمدة 5 دقائق مع 85٪ A في تدفقمعدل 0.15 مل / دقيقة، وهو الشرط بدءا من التدرج LC.
  2. إعداد تسلسل العينة في ترتيب عشوائي. ملاحظة: في هذه الطريقة، فإنه يوزع التقلبات التي أدخلتها LC-MS لكل عينة ويضمن المقارنة أكثر دقة بين عينات مختلفة. كل 6 عينات، إضافة إلى غسل المدى، والذي يسير على نفس طريقة MS، باستثناء التدرج LC 95٪ A لمدة 10 دقيقة وتليها عمود موازنة 5 دقائق في 85٪ A مع معدل تدفق 0.15 مل / دقيقة. إضافة عينات فارغة (100٪ ماء) يغسل بعد كل شوط لتقييم خلفية النظام وتحمل أكثر المستويات.
  3. حفظ تسلسل ومرة ​​يظهر العمود LC الضغط مستقر، حوالي 400 رطل، بدء تشغيل التسلسل. إذا لم يكن هناك عينة أخرى يتم ليتم تشغيلها بعد هذا التسلسل، ثم تضاف تشغيل المحطة في نهاية تسلسل، والتي لديها معدل تدفق 0 مل / دقيقة في نهاية التدرج واختر "الاستعداد" بعد الانتهاء من التسلسل.
  4. إعادة تشغيل تعيين نفس العينة 12 ساعة بعد المعايرة. (هذا أناق لتقييم تقلب الخطأ الشامل بعد المعايرة.)

4. مشاركة وتحليل الصك التنظيف والصيانة

  1. في نهاية تسلسل، وغسل العمود مع 95٪ A بمعدل تدفق 0.2 مل / دقيقة لمدة 2 ساعة، وإذا لزم الأمر، عكس العمود قبل الغسيل.
  2. إزالة العمود LC والاتصال مباشرة LC إلى مصدر أيون من قبل الاتحاد. إعداد تنظيف المذيبات والماء / الميثانول / حامض الفورميك (ت: ت: ت، 90:10:0.2)، تعيين MS على وضع الاستعداد، ونظام غسيل LC-MS في معدل تدفق 0.1 مل / دقيقة لمدة 1 ساعة لإزالة المتبقي عجلت أملاح أو غيرها من الشوائب. خفض معدل التدفق إذا كان هناك الكثير من الضغوط النظام.
  3. ضبط درجة الحرارة الشعرية عند 50 درجة مئوية، وإزالة القفص أيون. تأخذ بعناية مخروط أيون الاجتياح وأنبوب نقل أيون بعد انخفاض درجة الحرارة الشعرية إلى 50 درجة مئوية. استخدام شبكة الخام، مثل الصنفرة، لإزالة الشوائب المتبقية على سطح مخروط أيون الاجتياح.
  4. وضع نقل أيونأنبوب إلى أنبوب 15 مل الصقر تحتوي على 10 مل 90٪ من المياه / الميثانول مع حمض الفورميك بنسبة 0.1٪. بعد sonicating الأنبوب في sonicator حمام الماء لمدة 20 دقيقة، صب المذيب الداخل، استبدالها مع 10 مل الميثانول النقي ويصوتن لمدة 20 دقيقة أخرى. (إذا لزم الأمر، يمكن أن يتم صوتنة عند 40 درجة مئوية أو درجة حرارة أعلى من ذلك لتحقيق نتائج أفضل التنظيف.)

5. تحليل LC-MS البيانات

  1. لضمان تسلسل عينة تدير على نحو سلس، وبعد الانتهاء من العينتين الأولى في التسلسل، والتحقق من قمم لمستقلبات غير معروفة. استخدام ملف CSV سرد أسماء الأيض، والصيغة الكيميائية محايدة طريقة الكشف عن (إما إيجابية أو سلبية)، وملف الإدخال، ويحتوي على ملف الإخراج استخراج القمم والخطأ الشامل في جزء في المليون. إذا كان شكل ذروة غير طبيعي أو الخطأ الشامل هو خارج من قبل أكثر من 5 جزء في المليون، ثم بقية التسلسل يحتاج إلى وقفه واستكشاف الأخطاء وإصلاحها يحتاج إلى القيام به.
  2. اختيار طريقة "محاذاة الذروةوالإطار استخراج "على البرمجيات المتاحة تجاريا. حدد البيانات الخام من LC-MS وتجميعها. اختيار العينات في منتصف تسلسل تشغيل ك عينة مرجعية اللوني للمحاذاة الذروة. تحميل البذور الإطار بما في ذلك التمثيل الغذائي المعروفة لتحليل نواتج المستهدفة مع البيانات التي تم جمعها والمقابلة البذور الإطار.
  3. إجراء تحليل البيانات في وضع الإيجابية والسلبية بشكل منفصل. استخدام الإعداد الافتراضي لغيرها من المعالم. إيقاف وظيفة البحث قاعدة البيانات وتشغيل سير العمل. تصدير البيانات التي تتم معالجتها بوصفها ورقة اكسل تحتوي على منطقة ذروة كل إطار. مجموعات الأولى من إطارات تتوافق مع نواتج الأيض في القائمة المستهدفة. ملاحظة: للاطلاع على تحليل المستقلب المستهدفة، يتم الحصول على المعلومات الأيض استنادا إلى دراسات سابقة 13،15.
  4. لتحليل المستقلب تشتته، واختيار طريقة "استخراج مكون". تحميل عينات فارغة للالطرح الخلفية. تعيين ذروة كثافة عتبةر 10 5، عرض م / ض من 10 جزء في المليون وإشارة إلى نسبة الضوضاء 3.
  5. استخدام قاعدة البيانات metabolome الإنسان لتحديد المركبات غير معروف. استخدام مرشح السيرة الذاتية لإزالة المكونات مع السير الذاتية كبيرة داخل عينات تكرار. تذهب يدويا من خلال كل مكون واختيار تلك مع ذروة محددة جيدا أو فرق كبير نسبيا في أنواع عينات مختلفة للبحث قاعدة البيانات. تصدير البيانات مع يضرب في قاعدة بيانات. (محاذاة الذروة يمكن تجاوزه إذا كانت النتيجة المحاذاة الذروة منخفض جدا.)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دقة البيانات الايض يعتمد بشكل كبير على أداء أداة LC-MS-التيسير الكمي. لتقييم ما إذا كانت أداة تعمل في حالة جيدة، وإذا كانت طريقة تطبيقها هو الصحيح، يتم استخراج عدة قمم LC المستقلب المعروف من مجموع اللوني ايون (TIC)، كما هو مبين في الشكل 1. مستقلبات القطبية، بما في ذلك الأحماض الأمينية، وسيطة تحلل ، وسيطة TCA، النيوكليوتيدات، والفيتامينات، ATP، NADP + وهلم جرا يكون الاحتفاظ جيدة على العمود وذروة جيدة الأشكال في العمود أميد في ظل ظروف LC الحالي. وفي الوقت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الأكثر أهمية بالنسبة لالتنميط المستقلب ناجحة في الخلايا باستخدام هذا البروتوكول هي: 1) السيطرة على النمو المتوسطة واستخراج الدقيق للخلايا؛ 2) تعديل طريقة LC يعتمد على طريقة MS الإعداد لضمان وجود ما يكفي من (عادة لا يقل عن 10) نقاط البيانات عبر الذروة لتحديد الكميات؛ 3) القيام المعايرة كتلة منخفضة قبل تشغيل عينات؛ 4) عن طريق الحقن لا يزيد عن 5 مل لتجنب الوقت الاحتفاظ تحويل وتوسيع الذروة التي تسببها المياه؛ و5) إعداد وتشغيل عينات للمقارنة في نفس دفعة لتقليل الآثار دفعة واحدة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أنوه ديتليف شومان، جينيفر ساتون (الحرارية فيشر العلمية) وناثانيل سنايدر (جامعة بنسلفانيا) لإجراء مناقشات قيمة حول المعايرة الشامل ومعالجة البيانات. وأيد البحوث التي أعلن عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للسرطان التابع لمعاهد الصحة الوطنية في إطار جائزة عدد R00CA168997. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مزيج المعايرة الإيجابيةThermo Scientific# 88323إنه حساس للضوء. يخزن في درجة حرارة 4 درجات. C
مزيج المعايرة السلبيةThermo Scientific# 88324يخزن في 4 درجات ؛ C
DiazinonSant Cruz Biotechnology#C0413يسبب تهيج العين ، لذا اعمل في غطاء المحرك. يخزن في درجة حرارة 4 درجات.
إدراج إبرة C H-ESIفيشر Scientific# 1303200يمكن استبداله أو تنظيفه بحمض الفورميك / الماء بنسبة 5٪ (إزالة الحلقة المطاطية) إذا كان مسدودا.
باستخدام عمود Xbridge amideWaters#186004860Guard لزيادة عمر العمود.
يوصى

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).
  2. Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).
  3. Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).
  4. Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292 (5518), 929-934 (2001).
  5. Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).
  6. Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).
  7. Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).
  8. Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).
  9. Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507(2008).
  10. Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).
  11. Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).
  12. Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).
  13. Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).
  14. Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).
  15. Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
  16. Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).
  17. Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).
  18. Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).
  19. Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).
  20. Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
  21. Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).
  22. Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Metabolomics ProtocolPolar Metabolite AnalysisAmide Hydrophilic ChromatographyQ Exactive MSCold Methanol ExtractionMetabolite Peak ExtractionData Processing SoftwareUntargeted Metabolite AnalysisTargeted Metabolite DetectionMass Error Calibration

مقالات ذات صلة