Method Article

Juxtasomal Biocytin وصفها لدراسة بنية وظيفة علاقة فردية القشرية الخلايا العصبية

DOI:

10.3791/51359

⸱

February 25th, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Neurophysiology, Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Neuroscience Campus Amsterdam, VU University Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لفهم بنية الشبكات العصبية، وتوصيف وظيفي والمورفولوجية من الخلايا العصبية الفردية هو ضرورة. هنا، علينا أن نظهر وضع العلامات juxtasomal biocytin، والذي يسمح التسجيلات الكهربية في تكوين الخلية، ولكن الحفاظ على القدرة على تسمية الخلايا العصبية داخل الخلية لإعادة الإعمار آخر مخصص للشجيري والهندسة المعمارية محور عصبي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتميز قشرة الدماغ بواسطة طبقات متعددة وكثيرة متميزة الخلية الأنواع التي معا كشبكة هي المسؤولة عن العديد من الوظائف المعرفية بما في ذلك صنع القرار العليا، والسلوك الحسي موجهة أو الذاكرة. لفهم كيف يمكن لهذه الشبكات العصبية المعقدة أداء مثل هذه المهام، خطوة حاسمة في تحديد وظيفة (أو النشاط الكهربائي) من أنواع الخلايا الفردية داخل الشبكة، تفضيلي عند الحيوان هو أداء مهمة المعرفية ذات الصلة. بالإضافة إلى ذلك، من المهم أيضا لتحديد بنية التشريحية للشبكة والبنية المورفولوجية من الخلايا العصبية الفردية للسماح الهندسة العكسية شبكة القشرية. اختراقات التقنية المتاحة اليوم تسمح تسجيل النشاط الخلوي في اليقظة، تتصرف الحيوانات مع خيار قيمة من آخر مخصص تحديد الخلايا العصبية المسجلة. هنا، علينا أن نظهر تقنية وضع العلامات juxtasomal biocytin، الذي ينطوي على إجراءات تسجيل potentiآل ارتفاعه في تكوين خارج الخلية (أو فضفاضة التصحيح) باستخدام ماصات التصحيح التقليدية. تكوين تسجيل juxtasomal مستقرة نسبيا وقابلة للتطبيق في جميع أنحاء الظروف السلوكية، بما في ذلك تخدير، مخدرا، مستيقظا الثابتة الرأس، وحتى في الحيوان يتحرك بحرية. وهكذا، وهذه الطريقة تسمح ربط الخلايا من نوع إجراءات محددة ارتفاعه المحتملة خلال سلوك الحيوان لإعادة بناء الخلايا العصبية الفردية، وفي نهاية المطاف، والمتناهية الصغر القشرية بأكملها. في هذه المخطوطة الفيديو، وتبين لنا كيف يمكن أن توصف الخلايا العصبية الفردية في تكوين juxtasomal مع biocytin في الفئران مخدرة يوريثان لتحديد آخر مخصص وإعادة الإعمار المورفولوجية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتكون الشبكات العصبية من أنواع خلايا متعددة، وتتميز خصائص المورفولوجية والفسيولوجية محددة للغاية 1-7. نتيجة لذلك، أنواع الخلايا الفردية أداء المهام المتخصصة داخل الشبكة (انظر على سبيل المثال Gentet وآخرون. 8 وBurgalossi وآخرون. 9). نحن ليست سوى بداية لفهم وظائف محددة نوع الخلية عبر الشبكات العصبية والكثير لا يزال يتعين اكتشافها. تحقيقا لهذه الغاية، العديد من المعامل وتنفيذ نهج التجريبية التي تسمح للتحليل الخصائص المورفولوجية من نفس السكان من الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها المعلمات الفسيولوجية 1،10-15. هنا، ونحن لشرح وضع العلامات juxtasomal تقنية 16،17 الذي ينطوي التسجيلات الكهربية باستخدام ماصات التصحيح التقليدية في التكوين (وبالتالي موسع) خارج الخلية في تركيبة مع التثقيب الكهربائي من الخلايا العصبية المسجلة مع biocytin. الالميزة الرئيسية لهذا النهج هو أن طبيعة موسع يضمن أن العمل ارتفاعه المحتملة من الخلايا العصبية الفردية يتم تسجيلها دون تغيير (على سبيل المثال dialyzing) محتوى الخلايا من الخلية. تليها التثقيب الكهربائي، ونهج juxtasomal يوفر خيار آخر تحديد الخلية المخصصة وإعادة الإعمار لربط وظيفة (وظائف الأعضاء) لهيكل (التشكل). عادة والتعمير المورفولوجية ينطوي على إعادة بناء التشكل شجيري ومحور عصبي والتي يمكن أن تمتد إلى العمود الفقري الكمي و / أو حبة الكثافة أو حتى إعادة بناء مورفولوجيا الخلايا العصبية في القرار نانومتر باستخدام المجهر الإلكتروني. تقنية تسجيل juxtasomal يمكن استخدامها لفي الجسم الحي تسجيلات لمختلف أنواع الخلايا عبر الطبقات القشرية أو في المناطق شبه القشرية في مجموعة من الأنواع، على الرغم من أن معظم الدراسات قد طبقت هذه التقنية في القوارض الصغيرة مثل الفئران أو الجرذان. وتركز أبحاثنا على تسجيل ووصفها الخلايا العصبيةمن الفئران القشرة الحسية الجسدية الأولية (S1) وينطوي على تحديد الخلايا العصبية البصرية سجلت 18، شجيري اعادة البناء في تركيبة مع تسجيل دقيق في إطار مرجعية موحدة لعكس مهندس شبكات القشرية 4،19 وإعادة الإعمار مفصلة العمارة محور عصبي لوصف نوع محدد خلية محلية والإسقاط طويل المدى يستهدف 20.

مقارنة في الجسم الحي تقنيات التسجيل بديلة (الخلايا أو خلية كاملة)، والتسجيلات juxtasomal مستقرة نسبيا، وبالتالي يمكن تطبيقها في جميع أنحاء دول السلوكية بما في ذلك تخدير 21،22، مخدرا 14، 23 مستيقظا الحيوانات الثابتة الرأس، أو التحرك بحرية، وحتى 9 . هنا، وتبين لنا وضع العلامات juxtasomal في S1 من الفئران تخدير يوريثان، على الرغم من أننا نشدد على تطبيق العام لهذه التقنية إلى العديد من الأعمال التحضيرية في الاختيار.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الحيوان

يتم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للقانون الهولندي وبعد تقييم من قبل لجنة أخلاقية المحلية في VU جامعة أمستردام، هولندا.

  1. تخدير الفئران ويستار (P25-P45، ♂ / ♀) مع isoflurane و(2-3٪ في الأكسجين)، وبعد ذلك مع يوريثان (20٪ في كلوريد الصوديوم 0.9٪، 1،6-1،7 جم / كجم) عن طريق الحقن داخل الصفاق. تقييم عمق التخدير عن طريق مراقبة انسحاب قرصة، وردود الفعل جفن، والحركات vibrissae.
  2. إدارة جرعة إضافية من يوريثان (10٪ من الجرعة الأولي) في حال الحيوان لا يصل عمق التخدير كافية أو كلما لاحظت تشنجات vibrissae أثناء التجربة.
  3. وضع الحيوان تخدير على الإطار التجسيمي مجهزة وسادة التدفئة، إدراج التحقيق في درجة الحرارة المستقيم والحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان في 37.5 ± 0.5 درجة مئوية بحلول وسادة التدفئة.
    4. ضع رأس الحيوان في إطار التجسيمي؛ تقليم الشعر على أعلى الرأس باستخدام مقص لجعل الجلد مرئية.
  4. ضخ 100 ميكرولتر 1٪ ليدوكائين (في كلوريد الصوديوم 0.9٪) تحت الجلد لتخدير موضعي في موقع العملية والانتظار 3-5 دقائق. إزالة الجلد تغطي سطح الجمجمة عن طريق خفض في الاتجاه الذيلية-إلى منقاري وتنظيف الأنسجة المتبقية.
  5. تنظيف الجمجمة على نطاق واسع مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم ومسحات ماصة.
  6. تحديد إحداثيات المنطقة المستهدفة على نصف الكرة المخية الأيسر (على القشرة الحسية الجسدية الأولية (S1): 2.5 ملم و 5.5 ملم الخلفي الجانبي لbregma). وضع علامة على موقع على الجمجمة مع الجراحية علامة الجلد من ركلة جزاء.
  7. كشط العظام بلطف بواسطة حفر الأسنان من منطقة الفائدة حتى يصبح شفافا العظام والأوعية الدموية هي واضحة للعيان.
  8. جعل 0.5 مم × 0.5 مم حج القحف عن طريق خفض نافذة في الجمجمة ضعيفة مع مشرط (# 11)، وتجنب الأضرار التي لحقت الأم الجافيةوالأوعية الدموية. اختياري: علم على حواف حج القحف باستخدام الجراحية علامة الجلد القلم لتحسين الرؤية.
  9. تطبيق طبقة رقيقة من superglue على الجمجمة الجافة ثم الاسمنت الأسنان لبناء حمام (أي غرفة تسجيل) إحاطة حج القحف.
  10. تقليم شعيرات في الجانب المقابل لبالضبط 5 ملم من بصيلات الطولي. اختياري: تسليط الضوء على شعيرات قلص مع الماسكارا السوداء.

2. Juxtasomal تسجيلات وصفها Biocytin

  1. جعل ماصات التصحيح من الزجاج البورسليكات مع قطر الحافة داخل ~ 1 ميكرون للحصول على الأقطاب مع المقاومة MΩ 3-5. ملاحظة: مورفولوجيا ماصة مثالية لتسجيل juxtasomal هو تفتق تدريجي مرهف، زاوية المخروط منخفضة، و~ 1 ميكرون طرف (الشكل 1).
  2. اعتمادا على عمق تسجيل (مع الاحترام لسطح حنوني)، ينبغي تعديل أبعاد تفتق من القطب تسجيل. بالغ الأهمية هو أن روقال انه ينبغي أن يكون تفتق قطرها أقل من 75 ميكرون في نقطة الدخول في الدماغ لتجنب الأضرار الميكانيكية أو الإجهاد إلى منطقة التسجيل. هذا يدل على أن للتسجيلات القشرية سطحية، لا بد من تفتق من 300-500 ميكرون مع القطر الخارجي الحد الأقصى من 75 ميكرومتر (الشكل 1A) في حين التسجيلات من الطبقات القشرية العميقة نسبيا تتطلب تفتق أطول من 1،500-1،800 ميكرون، ومرة أخرى مع الخارجي القصوى قطر 75 ميكرومتر (ميكرون في 1،800 من طرف القطب).
  3. تحميل ماصة التصحيح مع الفئران العادية المسابقة (NRR) تستكمل مع 2٪ biocytin (انظر الجدول رقم 1 لإيجاد حلول والكواشف) وجبل ماصة التصحيح على مرحلة الرأس ثابت إلى مياداة مجهرية.
  4. تعيين زاوية حامل القطب إلى 34 درجة فيما يتعلق المستوى السهمي خصيصا لاستهداف العمود D2 من S1 الفئران.
  5. ربط رئيس لمرحلة مكبر للصوت في جسر وضع (أي المشبك الحالي).
  6. وضع التصحيحماصة على مقربة من حج القحف. ملء حوض الاستحمام مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم وتحديد المقاومة القطب الذي يجب أن يكون بين 3-5 MΩ وتقييمها عن طريق تطبيق نبض مربع مع الحقن الحالية إيجابية (1 غ، 200 ميللي ثانية تشغيل / إيقاف).
  7. إنشاء الضغط الزائد من 100-150 م بار، ودفع ماصة التصحيح في 1 ميكرومتر الخطوات أثناء تطبيق الحالية إيجابية البقول مربع (1 غ، 200 ميللي ثانية تشغيل / إيقاف). رصد تغير المقاومة القوية عند إنشاء اتصال مع الأم الجافية. عند هذه النقطة، تعيين إحداثيات مياداة مجهرية ل'صفر' للسماح للقياسات عمق دقيقة.
  8. التقدم في الخطوة 1 ميكرومتر الوضع حتى تخترق ماصة التصحيح الأم الجافية يتبين من انخفاض مفاجئ في مقاومة القطب. إزالة الضغط عقد ماصة.
  9. بحث عن وحدة واحدة في حين تتقدم في 1 ميكرومتر الخطوات. رصد المقاومة الكهربائي بشكل مستمر من خلال تطبيق 200 ميللي ثانية على / قبالة البقول. زيادة في القطب المقاومة typicحليف يشير إلى القرب من الخلايا العصبية واحدة. تقدم القطب حتى إمكانات العمل الإيجابي (ا ف ب) يتم تسجيل الطول الموجي من ~ 2 بالسيارات (أرقام 2A و 2B).
  10. اختياري: قم بتسجيل نمط ارتفاعه عفوية من الخلايا العصبية وتحديد ارتفاعه من قبل، على سبيل المثال، تشتيت نحو caudally شعيرات فردية ل200 ميللي ثانية في زاوية من 3.3 درجة باستخدام جهاز كهرضغطية 18-أثار ضئيلة للغاية.
  11. تقدم القطب حتى المقاومة 25-35 MΩ والمسامير لديهم سعة من 3-8 بالسيارات للحصول على ظروف مثلى من juxtasomal التعبئة. بدء ملء juxtasomal من خلال تطبيق نبضات مربع من الإيجابية الحالية (1 غ، 200 ميللي ثانية تشغيل / إيقاف). ببطء وتدريجيا يزيدون الكمية الحالية من خلال الخطوات من 0.1 غ في حين رصد الموجي AP وتردد (أرقام 2A و 2B).
  12. رصد افتتاح الغشاء كما زيادة واضحة في وتيرة AP أثناء مرحلة على من نبض كتلة (الشكل 2C ). الموجي ارتفاع خلال ملء يبين زيادة العرض وانخفاض بعد فرط الاستقطاب (أرقام 2C و 2D). وتشمل معلمات إضافية زادت الضوضاء أو صغيرة (1-5 بالسيارات) سلبي DC التحول.
  13. زيادة أو نقصان الحالية (1 غ) في حين ملء للحفاظ على استقرار ضخ biocytin. خفض أو وقف نبضات الحالي على زيادة مفاجئة في وتيرة AP لتجنب السمية عن طريق تدفق الزائد من الأيونات خارج الخلية، مثل أيونات الصوديوم. ملاحظة: ستكون كل الخلايا العصبية تستجيب بشكل مختلف للحقن الحالية ووضع العلامات juxtasomal تحتاج المعلمات إلى تعديل تبعا لظروف التسجيل الفردية.
  14. عن كثب رصد إشارة بعد إيقاف الحقن الحالية. الموجي ارتفاع بعد جلسة ملء عادة ما يتم توسيع ويظهر انخفض بشدة بعد فرط الاستقطاب. انتظر استعادة الخلايا العصبية، والتي هي واضحة عندما يعود إلى خصائص ارتفاع الموجي الأصلي (أي وجودطبيعي بعد فرط الاستقطاب، الشكل 2).
  15. تكرار biocytin ملء جلسات بعد الشفاء الكامل من الخلايا العصبية لزيادة الحمل biocytin لتحسين جودة تلطيخ.
  16. سحب ماصة التصحيح في الخطوات من 1 ميكرون حتى يقلل من السعة ارتفاع للحد من أي إجهاد للخلية. الانتظار ما لا يقل عن 1 ساعة لbiocytin لنزع فتيل داخل الخلية بينما تراقب عن كثب درجة حرارة جسم الحيوان والتنفس.

3. Perfusing الحيوان وإزالة الدماغ

  1. إعداد الإعداد التروية، شطف، وتهيئة تحميلها على الأنابيب مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم.
  2. وضع الحيوان على صينية الجراحية وآمن مع الشريط وضع العلامات القياسية. ضمان عمق كاف من التخدير؛ قرصة القدم وردود الفعل جفن يجب أن يكون غائبا.
  3. جعل الإنسي إلى الوحشي شق (5-6 سم) من خلال جدار البطن فقط تحت القفص الصدري والمضي قدما في اتجاه الخلفي الأمامي لفضح القص.سحب القص الأمامية وفصل بعناية الكبد من الحجاب الحاجز.
  4. إجراء شق صغير في الحجاب الحاجز، وقطع من خلال انخفاض أضلاعه ومواصلة شق على طول من تجويف البطن لفضح القلب.
  5. إزالة التأمور.
  6. إدراج الإبرة في البطين الأيسر وإجراء شق في الأذين الأيمن. يروي مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم (~ 8 مل / دقيقة) حتى إزالة اللون من الكبد كاملة.
  7. التبديل إلى ضخ بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) حتى تصلب مخلب الجبهة والفك السفلي هو واضح.
  8. قطع رأس الفأر باستخدام زوج من مقص
  9. إزالة عضلات الرقبة المتبقية وفضح الجمجمة تماما.
  10. ضع مقص في جذع الدماغ على الجانب الظهري وقطع العظم بعناية على طول الدرز السهمي، والحفاظ على موقف الظهرية.
  11. إزالة العظام من كلا الجانبين من الدرز السهمي لفضح الدماغ باستخدام ملقط. إزالة الجافية بعناية لتجنب دamage.
  12. إدراج بعناية ملعقة حادة إلى الجانب البطنية من الدماغ وإزالة الدماغ بلطف.
  13. بعد إصلاح بين عشية وضحاها في الدماغ كله PFA في 4 درجات مئوية. التبديل الدماغ إلى 0.05 M العازلة الفوسفات (PB) وتخزينها في 4 درجات مئوية.

4. تشريح الدماغ في أقسام تماسي

  1. اتخاذ الدماغ من 0.05 M PB ووضعها على ورقة الترشيح التي تواجه الأمامي. استخدام شفرة حلاقة حادة لقطع المخيخ على طول الطائرة الاكليلية وفصل نصفي الكرة الأرضية عن طريق خفض طول الطائرة منتصف السهمي.
  2. تطبيق superglue على منصة تصاعد وجبل نصف الكرة اليسار على المستوى السهمي مع الأمامية التي تواجه الحق. تأمين منصة متزايدة في زاوية من 45 درجة على vibratome ويغرق في الدماغ 0.05 M PB.
  3. تأمين شفرة حلاقة على vibratome وتأكد من أن أول اتصال مع سطح الدماغ في منتصف الطائرة الأمامي الخلفي من نصف الكرة الغربي. قطع 24 100 ميكرونأقسام وجمعها في لوحة 24 أيضا تحتوي على 0.05 M PB.

5. إجراءات النسيجية

  1. أداء بروتوكولات النسيجية لتلطيخ السيتوكروم أوكسيديز 24 و-البيوتين أفيدين طريقة البيروكسيداز وفقا للأساليب الموصوفة سابقا 25. اختياري: تصور biocytin باستخدام تقارن الفلورسنت أفيدين / streptavidin-اليكسا. وهذا يسمح بالإضافة المزدوج تلطيخ مع تقنيات تتبع إلى الوراء أو تقدمي.
  2. أقسام غسيل 5 × 5 دقائق مع 0.05 M PB وإعداد tetrahydrochloride 3،-3'-diaminobenzidine (DAB) التي تحتوي على حل لتلطيخ السيتوكروم أوكسيديز لتصور برميل في طبقة 4 (L4) من S1 (انظر الجدول 2 لحلول و الكواشف). احتضان أقسام 6-12 من الحنون في حل محمى لمدة 30-45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. شطف المقاطع مع 0.05 M PB ل6 × 5 دقائق وإخماد النشاط البيروكسيديز الذاتية التي يحتضنها كل المقاطع في 3٪ H 2 O 2 في 0.05 م PB لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  4. شطف المقاطع مع 0.05 M PB عن 5 × 10 دقيقة. احتضان المقاطع في ABC-الحل (انظر الجدول 3 لحلول والكواشف) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  5. شطف المقاطع مع 0.05 M PB لمدة 5 × 10 دقيقة، وإعداد حل DAB-لتصور الخلايا العصبية مليئة biocytin (انظر الجدول رقم 4 لحلول والكواشف). احتضان المقاطع في حل تصفيتها عن 45-60 دقيقة في RT.
  6. شطف المقاطع مع 0.05 M PB عن 5 × 10 دقيقة. أقسام جبل على الشرائح المجهر وغطاء قابل للانزلاق مع Mowiol (انظر الجدول 5 للحلول والكواشف).
  7. تحديد نوعية وضع العلامات باستخدام المجهر الضوئي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

معرفة تفصيلية على هيكل 3D من الخلايا العصبية الفردية هو أمر حاسم لتوضيح المبادئ التنظيمية للشبكات العصبية. يتضمن أسلوب لدينا خط أنابيب لتحقيق وضع العلامات biocytin جودة عالية من الإعداد في الجسم الحي، مما يتيح تصنيف الوظائف المخصصة الخلايا العصبية وإعادة الإعمار مفصلة من شجيري والهندسة المعمارية محور عصبي واحد من الخلايا العصبية في ارتفاع القرار. اعتمادا على نوعية وضع العلامات juxtasomal، يتم استرداد الخلايا العصبية مع مختلف DAB-كثافات تتراوح بين خافت لإ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح أسلوب juxtasomal تسجيل في العمل فيفو ارتفاعه المحتملة من وحدات واحدة عبر الظروف السلوكية (تخدير، مستيقظا أو بحرية التحرك الثابت الرأس) مع خيار من الخلايا العصبية المسجلة لآخر مخصص نوع من الخلايا تصنيف و / أو إعادة الإعمار 3D-وصفها biocytin. والميزة الرئيسية هي الحصول على المعلمات الفسيولوجية في تكوين (وبالتالي موسع) خارج الخلية، ولكن أن تكون قادرة على تسمية الخلايا العصبية داخل الخلية مع biocytin 16،17،32. بالإضافة إلى biocytin وضع العلام...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وauthros ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر الأستاذان. Huibert Mansvelder وبيرت Sakmann للحصول على دعم واسع النطاق، والدكتور مارسيل Oberlaender لإجراء مناقشات مثمرة وتوفير تتبع الخلايا العصبية، وبريندان ودر للحصول على المساعدة الفنية. تم الحصول على البيانات باستخدام ntrode السادس لابفيف، قدمت بسخاء من قبل R. برونو (جامعة كولومبيا، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية). وأيد هذا البحث من قبل جمعية ماكس بلانك ومركز العلوم العصبية الحاسوبية لبرنشتاين، توبنغن (بتمويل من الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث (BMBF؛ FKZ: 01GQ1002)) (RTN)، مركز البحوث وNeurogenomics المعرفي (CNCR) ، علم الأعصاب في الحرم الجامعي أمستردام (NCA)، التمويل لCPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 وENC-P3-# شبكة C3) وVU جامعة أمستردام.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
نظام التحكم SM-6Luigs Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 Manipulatorblock X2
Lynx-8 مكبر للصوتNeuralynx
Axoclamp-2B مكبر للصوتAxon Instruments
Osada نموذج EXL-M40Osada، Inc.
الجهاز الكهرضغطيةPhysik InstrumentePL140.10
LabViewNational Instruments, أوستن, تكساس, الولايات المتحدة الأمريكيةLabView برنامج الاستحواذ
Ntrode Virtual Instrument R. Bruno ، جامعة كولومبيا ، نيويورك
مسحات ماصة SugiKettenbach30601
Cytochrome C من قلب الخيولSigmaC2506
Catalase من كبد البقرSigmaC9322
DABSigmaD5637
H2< / sub>O2< / sub>Boom7047
Vectastain قياسي ABC-kitVectorPK6100
Triton X100SigmaT9284
UrethaneSigmaU2500
IsofluranePharmachemie45.112.110
LidocaineSigmaL5647
Simplex Fast DentalCement KemdentACR308 / ACR924
BiocytinMolekula36219518
PFAMerck Millipore8187151000
Trizma baseSigmaT4661
Mowiol 4-88Aldrich81381
الجلسرين من الدرجة التحليليةFluka49767
HEPESSigmaH3375
NaClSigma Aldrich31434
KClسيجما ألدريتش60130
كالوريد الكالسيومسيجما ألدريتش22،350-6
ملغ كلوريد < ساب >2< / فرعي >فلوكا63072

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
  3. Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
  4. Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
  5. Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
  6. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
  7. Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
  8. Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
  9. Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
  10. Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
  11. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  12. Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
  13. Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  14. Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
  15. Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
  16. Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
  17. Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
  18. de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
  19. Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
  20. Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
  21. Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
  22. de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
  23. de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
  24. Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
  25. Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
  26. O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
  27. Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
  28. Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
  29. Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
  30. Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
  31. Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
  32. Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
  33. Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
  34. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Juxtasomal RecordingBiocytin LabelingCortical NeuronsAction Potential SpikingMorphological ReconstructionSensory CortexPatch PipettesCurrent InjectionsBiotin StainingDigital Reconstruction

Related Articles