مقالة منهجية

بروتوكول لتحليل التهاب الكبد الوبائي فيروس النسخ المتماثل

DOI:

10.3791/51362

⸱

يونيو 26, 2014

 ,  , 
1Liver Program at Regenerative Medicine Institute, Department of Biomedical Sciences, Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروس التهاب الكبد C (HCV) هو أحد مسببات الأمراض البشرية الرئيسية التي تسبب اضطرابات الكبد، بما في ذلك تليف الكبد والسرطان. يعد نظام زراعة الخلايا المعدية لفيروس التهاب الكبد C ضروريا لفهم الآلية الجزيئية لتكاثر فيروس التهاب الكبد C وتطوير مناهج علاجية جديدة. نصف هنا بروتوكولا للتحقيق في مراحل مختلفة من دورة تكرار فيروس التهاب الكبد C.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب الكبد C فيروس (HCV) يؤثر على 3٪ من سكان العالم ويسبب أمراض خطيرة في الكبد بما في ذلك التهاب الكبد المزمن، تليف الكبد، وسرطان الكبد. سي هو فيروس الحمض النووي الريبي يلفها ينتمون إلى عائلة الفيروسات المصفرة. العلاج الحالية ليست فعالة تماما ويسبب آثار جانبية ضارة. لا يوجد لقاح التهاب الكبد الوبائي المتاحة. وبالتالي، مطلوب جهد استمر لتطوير لقاح وعلاج أفضل. خلية نظام الثقافة HCV أمر بالغ الأهمية لدراسة مختلف مراحل النمو بما في ذلك دخول الفيروس HCV، وتكرار الجينوم، والتغليف، والخروج. في الإجراء الحالي قدم، كنا فيروس من النوع البري intragenotype 2A خيالية، FNX-HCV، والمؤتلف فيروس FNX-Rluc يحمل Renilla luciferase المراسل مراسل الجينات لدراسة تكاثر الفيروس. خط الخلية الكبدي الإنسان كان يستخدم لترنسفكأيشن في المختبر (7 هوه القائم) كتب HCV الرنا الجيني. supernatants ثقافة خالية من الخلايا، لست] البروتين ورتم حصادها RNA OTAL في وقت مختلف النقاط بعد ترنسفكأيشن لتقييم النمو HCV. تم تقييم HCV الجينوم حالة النسخ المتماثل التي كتبها الكمي RT-PCR وتصور وجود HCV RNA المزدوج تقطعت بهم السبل. تم التحقق من التعبير البروتين HCV بواسطة وصمة عار والمقايسات المناعي الغربية باستخدام الأجسام المضادة المحددة لHCV NS3 وNS5A البروتينات. وقد تم قياس الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل HCV RNA صدر الجسيمات المعدية في طاف الثقافة وعيار الفيروسية. واستخدمت المقايسات luciferase المراسل لتقييم مستوى التكرار والعدوى مراسل سي. في الختام، فإننا نقدم مختلف المقايسات الفيروسية لوصف المراحل المختلفة من دورة النسخ المتماثل HCV.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب الكبد الوبائي (HCV) يسبب تليف الكبد وسرطان الكبد. فإنه يؤثر على 170 مليون شخص في جميع أنحاء العالم مع 350،000 شخص يموتون سنويا 1-3. HCV هو حبلا إيجابية فيروس الحمض النووي الريبي مع حجم الجينوم من 9.6 كيلو بايت. تتم ترجمة الجينوم HCV باعتبارها واحدة من polyprotein ~ 3،000 الأمينية بقايا حمض التي المشقوق proteolytically من قبل مختلف البروتياز الخلوية والفيروسية في 10 البروتينية. سي هو فيروس النموذج في جنس Hepacivirus وينتمي إلى عائلة الفيروسات المصفرة 4. عند التعرض، HCV يحدد عدوى مزمنة في 80٪ من الأفراد. العدوى بدون أعراض في الغالب والتشخيص في الوقت المناسب يمكن أن تسمح التدخل العلاجي لمنع تدهور الكبد. العلاج الحالي هو الأمثل وأي لقاح متاح 5،6.

وكان أول وصف مسببات التهاب الكبد C في عام 1989 7. دراسة النسخ المتماثل HCV المهم لقاح التهاب الكبد C والبحوث العلاج، ولكن كان عليهأعاق طويلة من عدم وجود نظام الثقافة الفيروسية كفاءة. وقد أظهرت استنساخ الجزيئي للفيروس (سي) لتكون معدية في الشمبانزي على التلقيح داخل الكبد 8. في وقت لاحق، وصفت replicons HCV الفرعية الجيني، مما سمح لتشريح الفيروسية مرحلة تكرار الجينوم في 9،10 نظام خلية ثقافة. اكتشاف HCV الوراثي 2A عزل JFH-1 (اليابانية التهاب الكبد مداهم-1)، القادرة على إصابة خلية ثقافة فتحت آفاقا جديدة للبحث تكرار HCV 11-13. سلالة النمط الجيني 2A JFH-1 استنادا الفيروسات خيالية بين وداخل الوراثي والنمط الجيني 1 HCV هي أنظمة الثقافة المعدية استنادا المتاحة، فضلا 14-18.

وقد استخدمنا بنجاح JFH-1 سلالة وHCV intragenotype 2A الفيروس خيالية للحصول على دقة عالية خارطة التنميط وظيفية من المجالات البروتين ورابطة الدول المستقلة المفعول عناصر الحمض النووي الريبي 19،20. وفقا لهذا، ونحن هنا تصف نظام الثقافة فعالة تستخدم بشكل روتيني أن يسمحدراسة مراحل مختلفة من دورة النسخ المتماثل HCV والتفاعل المضيف الممرض. نقدم فحوصات الفيروسية لتقييم تكرار الجينوم الفيروسي والعدوى نوفو دي من intragenotype 2A سي ومراسل سي Renilla luciferase المراسل القائمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتضح A المخطط العام للبروتوكول في الشكل 1.

1. خلايا

  1. إعداد وسائط النمو الكامل الذي يحتوي على 10-15٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 10 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 10 ملي Hepes، البنسلين (100 وحدة / مل)، الستربتوميسين (100 ملغ / مل)، و 2 مم L-الجلوتامين.
  2. الحفاظ على خلايا هوه 7.5.1 13 في وسائط النمو الكامل الذي يحتوي على ملاحق أعلاه في المختبر لتحليل التهاب الكبد C دورة تكاثر الفيروس.
  3. ثقافة سلالات فيروسية في خلايا هوه 7.5.1 مع وسائل الإعلام تستكمل النمو المحدد عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2.

2. الفيروسات ويبني البلازميد

  1. توليد شكل التكميلية الحمض النووي ([كدنا]) من HCV RNA واستنساخ قبل أن تتحول إلى ناقل البلازميد لسهولة التلاعب الجيني. ملاحظة: اكتشاف التهاب الكبد مداهم اليابانية 1، JFH-1 (النمط الجيني 2A HCV)، وعزل كانت حرجة للبحوث HCV وتستخدم في المقام الأول لدراسة دورة النسخ المتماثل HCV 11-13. وتستخدم الفيروسات خيالية بين وintragenotypic استنادا JFH HCV-1 عادة في البحوث 14-18. وقد وصفت بناء الاصطناعية intragenotype 2A الفيروس خيالية، FNX-HCV، وmonocistronic سلالة مراسل خيالية سابقا 19 و البناء التفاصيل هي خارج نطاق هذا البروتوكول.
  2. استخدام pFNX-HCV فيروس intragenotype 2A كما أنه يحتوي على 5'NTR والمناطق وP7 الهيكلية، وجزء من مناطق غير الهيكلية NS2 (النيوكليوتيدات 1-2878) من سلالة الأبوية J6CF (NCBI الانضمام لا. AF177036)، و كذلك مكونات غير الهيكلية من سلالة فيروسية JFH-1 (NCBI الانضمام لا. AB047639). ملاحظة: تم تصنيعه FNX-HCV على أساس تسلسل قطعة Jc1 intragenotype 2A HCV خيالية ذكرت سابقا 15.
  3. توليد خيالية مراسل بناء الفيروسية monocistronic، وpFNX-Rluc، استنادا إلى سلالة pFNX-HCV (أعلاه في الخطوة 2.2) عن طريق إدراج Renilla luciferase المراسل الجينات بين 'NTR 5 والجينات الأساسية (بين الإقليم الشمالي 388 و 389). بعد ذلك، ربط الجينات و luciferase الجينات الأساسية لهذا البناء باستخدام القدم والفم مرض فيروس 2A (F2A) تسلسل الببتيد، التي من شأنها أن تعمل كإشارة الانقسام.
  4. مهندس الحمض النووي الريبي بوليميراز الصفرية (بول) بناء الفيروسية باستخدام إما pFNX-HCV أو الخلفية الفيروسية pFNX-Rluc. استبدال بقايا الحفاز NS5B البلمرة، GDD (أأ 2759-2761؛ الإقليم الشمالي 8615-8623)، من أي من هذه العمود الفقرى الفيروسية مع بقايا حمض أميني الاهلي.

3. HCV RNA في المختبر النسخ

  1. استخدام intragenotype 2A خيالية فيروس HCV-FNX وFNX-HCV بول فارغة (بول) HCV لتقييم تكاثر الفيروس (الشكل 2A).
  2. خطي البلازميدات الفيروسي مع XbaI انزيم التقييد وثم التعامل مع مونج الفول نوكلياز لتوليد نهايات حادة. تنقية البلازميدات هضمها من قبل أنيون تبادل اللوني. تحقق من تكامل سو على خطي البلازميد بإخضاع الحمض النووي لالاغاروز الكهربائي للهلام (الشكل 2B).
  3. تدوين البلازميدات الفيروسي خطي باستخدام البلمرة T7-RNA.
  4. تنقية توليفها حديثا RNA المعالجة الدناز باستخدام طقم تنقية الحمض النووي الريبي.
  5. التحقق من إنتاج الحمض النووي الريبي التي كتبها الاغاروز الكهربائي للهلام (الشكل 2C).
  6. قياس الحمض النووي الريبي بواسطة القياس الطيفي.
  7. تخزين الحمض النووي الريبي ولدت في -80 درجة مئوية في 10 ميكروغرام مأخوذة العمل. ملاحظة: لتقليل التباين في نوعية الحمض النووي الريبي في كل التصميم التجريبي قبل الكتابة عن الحمض النووي الريبي لكل عينة فيروسية ومراقبة في نفس الوقت.

4. HCV RNA ترنسفكأيشن وجمع العينات

  1. حصاد الخلايا هوه 7.5.1 باستخدام التربسين.
  2. لشطف الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي و resuspend تعليق الباردة مرتين مع وسائل الاعلام المصل منخفضة. resuspend الخلايا في مصل الدم المنخفض وسائل الاعلام في 1 × 10 7 خلية لكل مل.
  3. مزيج ما مجموعه 10 & #956؛ غرام من الحمض النووي الريبي الفيروسي كتب مع 400 ميكرولتر من الخلايا معلق (4 × 10 6 خلايا) في 0.4 سم كفيت electroporation. بالنقل الخلايا عن طريق التثقيب الكهربائي في 270 V، 100 Ω، و 950 μF.
  4. resuspend الخلايا electroporated في 10 مل وسائط النمو الكامل مع FBS 15٪. ملاحظة: يعتبر زيادة البقاء على قيد الحياة من خلايا electroporated عندما كانت خلايا هوه 7.5.1 مثقف في 15٪ مصل بقري جنيني.
  5. لوحة الخلايا في كل من T-25 قوارير (~ 1.2 × 10 6 خلايا في قارورة) وألواح جيدا 48 (1 × 10 4 خلايا لكل بئر) لكل نقطة من النقاط الزمنية التالية: 4، 48 و 96 ساعة.
  6. استبدال وسائل الإعلام في 4-8 ساعة بعد ترنسفكأيشن مع الطازجة وسائط النمو تستكمل مع FBS 10٪ لإزالة الحطام الخلية الميتة من قوارير ومثقف لوحات.
  7. supernatants ثقافة الخلية الحصاد في 48 و 96 نقطة الساعة ساعة وإزالة الحطام الخلوية من العينات التي تم جمعها بواسطة الطرد المركزي الخلايا في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة على 4 درجة مئوية.
  8. تخزين supernatants خالية من الخلايا في -80 درجة مئوية. ليز الخلايا للبروتين وتحليل الحمض النووي الريبي لطخة الغربية وعكس النسخ PCR الكمي في نقاط زمنية المشار إليه.

5. عكس النسخ كمي PCR (RT-QPCR) لتقييم النسخ HCV الجينوم

  1. إجراء من خطوتين RT-QPCR لتحديد HCV RNA الجيني في عدد النسخ.
  2. إكتب العكسي 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية باستخدام الناسخ العكسي والتمهيدي محددة لHCV الشعور الذي يربط حبلا ل5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') أو التمهيدي محددة من أجل الوطن الجين peptidylprolyl مصاوغة G (R PPIG : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3). عكس أيضا تدوين FNX-HCV RNA (ولدت في الخطوة 3) نسخ من الجينوم المعروفة (10 يناير - 10 سبتمبر قياسي) استخدام الحس HCV حبلا التمهيدي.
  3. تنفيذ QPCR باستخدام 50 نانوغرام من [كدنا] كتب الناتجة باستخدام بادئات محددة HCV (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3؛ JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') والحمض النووي ملزم الصبغة الخضراء التي تحتوي على مزيج QPCR عظمى. أداء QPCR من أجل الوطن PPIG الجينات وكذلك (الاشعال PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '؛ PPIG R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') ملاحظة: للحصول على حساب دقيق بين الخلايا HCV RNA المستوى عبر العينات، واستخدام الجينات الخلوية التدبير المنزلي، PPIG ، ومستوى التعبير (دورة ط) للتطبيع. استخدام رقم نسخة من الجينوم FNX-HCV كمعيار لتحديد عدد النسخ.
  4. استخدام الشروط التالية عند تشغيل QPCR لتحديد عدد نسخ الحمض النووي الريبي HCV: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60   درجة مئوية لمدة 30 ثانية (40 دورات) في الوقت الحقيقي باستخدام نظام PCR.
  5. أنظر الشكلين 3A 3B للنتائج وتكرار الجينوم.

6. تحليل الغربية التنشيف للكشف عن HCV التعبير البروتين (الشكل 3C)

  1. استخدام الخلية لست الابالحمض النووي الريبي الفيروسي ام transfected في 96 ساعة ترنسفكأيشن آخر للبروتين تحليل النشاف الغربية.
  2. حل المحللة الخلية باستخدام SDS-PAGE ونقل إلى difluoride البولي فينيل (PVDF) الغشاء.
  3. منع الغشاء باستخدام محلول يحتوي على حجب الحليب الخالي من الدسم 5٪، 0.2٪ توين 20 في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  4. احتضان الغشاء مع الابتدائي الماوس ريتوكسيماب NS3 (1 في 1،000 التخفيف) وبيتا الأكتين (1 في 5،000 التخفيف).
  5. إضافة الماعز مفتش مكافحة الماوس مترافق إلى البيروكسيديز الفجل (1 في 5،000 التخفيف) وكشف من قبل لمعان كيميائي.

7. المناعي الفحص (IFA)

  1. إصلاح الخلايا المصابة وtransfected HCV باستخدام الميثانول لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة المناعي الفحص.
  2. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات ومنع مع ايفا للعرقلة العازلة.
  3. استخدام الأرنب بولكلونل مكافحة NS5A الأجسام المضادة في المقام الأول (شريطة التفضل الدكتور داسجوبتا، UCLA) أو الماوس وحيدة النسيلة المضادة للDSRNA الأضداد J2 في التخفيف من 1:200 (1 ميكروغرام / مل)، واحتضان لمدة 5 ساعة بين عشية وضحاها لفي 4 درجة مئوية.
  4. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات بعد الأجسام المضادة الأولية.
  5. إضافة الماعز المضادة للأرنب مفتش-488 الضد الثانوية بولكلونل أو الماعز المضادة للماوس مفتش-594 الضد الثانوية بولكلونل في التخفيف 1:1،000 (1 ميكروغرام / مل)، واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات ونوى وصمة عار باستخدام هويشت الصبغة وطريقة العرض باستخدام المجهر الفلورسنت (الشكل 3D).

8. عيار قياس الفيروسات

  1. لوحة ساذجة هوه 7.5.1 الخلايا في حوالي 3 × 10 3 خلية / جيدا باستخدام لوحة 96 جيدا. في اليوم التالي، نفذ التخفيفات التسلسلي 10 أضعاف للثقافة خالية من الخلايا طاف تحصد من الحمض النووي الريبي transfected خلايا الكبد الوبائي باستخدام وسائل الإعلام النمو وتطعيم في ثلاث نسخ على هوه 7.5.1 الخلايا.
  2. إصلاح الخلايا في 72 ساعة بعد العدوى باستخدام الميثانول (لمدة 30 دقيقة في -20 º C) وimmunostain لHCV البروتين NS5A كما جاء في المادة 7.
  3. استخدام أعلى التخفيف من الاعتماد على البؤر الإيجابية NS5A وحساب متوسط ​​عدد التركيز وحدة تشكيل (FFU) في الملليمتر الواحد. انظر الشكل (4) لفيروس (سي) عيار.

9. Renilla luciferase المراسل مراسل الفحص لالفيروسية الجينوم النسخ المتماثل والعدوى

  1. لتقييم تكرار الجينوم الفيروسي، لوحة HCV-RNA electroporated هوه 7.5.1 الخلايا في ثلاث نسخ في لوحات 48 جيدا (1 × 10 4 خلايا / جيد).
  2. ليز الخلايا مع 75 ميكرولتر من تحلل العازلة السلبي في ساعة 6، 48 ساعة، و 96 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
  3. موسيقى الروك لوحات بلطف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  4. لقياس Renilla luciferase المراسل النشاط الأنزيمي، ذوبان الجليد في المحللة البروتين وRenilla luciferase المراسل الكواشف مقايسة إلى درجة حرارة الغرفة.
  5. إضافة 20 ميكرولتر من البروتين المحللة لكل بئر من على بعد 96 أهلا وسهلا ل لوحة التلألؤ البيضاء ووضع لوحة في luminometer.
  6. الاستغناء 100 ميكرولتر من Renilla luciferase الفحص الكاشف (coelenterazine الركيزة عازلة +) لكل بئر، وبعد 2 ثانية قبل قراءة تأخير؛ دمج الضوء المنبعث لمدة 10 ثانية.
  7. حساب المتوسط ​​والانحراف المعياري لكل عينة من القيم luciferase المراسل من يثلث البيولوجية وإخضاع البيانات إلى التحليل الإحصائي (الشكل 5).
  8. لتقييم العدوى، تطعيم 500 ميكرولتر من طاف خالية من الخلايا التي تم الحصول عليها من خلايا transfected الحمض النووي الريبي HCV لنقاط الوقت المشار إليه (48 ساعة و 96 ساعة) في ثلاث نسخ على السذاجة هوه 7.5.1 الخلايا في لوحات 48 عاما أيضا.
  9. استبدال اللقاح الفيروسي مع 500 ميكرولتر من متوسطة جديدة لكل بئر بعد 6 ساعة بعد العدوى.
  10. ليز الخلايا في 48 ساعة بعد الإصابة، وتخضع لRenilla luciferase الفحص كما هو موضح في الخطوات 8،2-8،7 (الشكل 5).
itle "> 10. التحليل الإحصائي

  1. أشرطة الخطأ في الرسوم البيانية تشير الانحرافات المعيارية (SD). تم حساب القيم P من ر الاختبار المفردة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروس التهاب الكبد C هو فيروس الحمض النووي الريبي. وبالتالي لغرض التلاعب الجيني، وقد تم استنساخ [كدنا] HCV الجيني في البلازميد ناقلات البكتيرية. وقدم تسلسل الحمض النووي الريبي بوليميراز المروج T7 مباشرة قبل 5 'نهاية الجينوم HCV. ويرد المخطط العام للتحليل HCV سير العمل في الشكل 1. HCV RNA لتوليد الجيني مع الدقيق 'نهاية 3، يتم قطع الجينوم تحتوي على البلازميد مع HCV Xba أنا تقييد انزيم وتم إنشاؤها قلل من عبء واحد الذين تقطعت بهم السبل مع الفول مونج ن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا التوضيح طريقة لتحليل دورة النسخ المتماثل فيروس التهاب الكبد الوبائي. HCV هو الممرض الإنسان وسوف بروتوكول السلامة الأحيائية وصفه يجب اتباعها بدقة. وقد وصفت نظم زراعة الخلايا HCV المعدية سابقا 11-13،16،17. هناك عدد قليل من النقاط الحاسمة عندما ننفذ بعد بروتوكول موضح. الأولى، فإنه من الأهمية العالية لنوعية جيدة من سليمة كامل طول الفيروسي RNA الجيني للدراسات المصب. البلازميد المدخلات تحمل كدنا] الفيروسية لابد من خطي وقلل بعناية. ونوكلياز مونج الفول تستخدم لفظة X...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر F. Chisari على توفير خط خلية Huh-7.5.1. نود أن نشكر جوستين هو على تحرير المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل جائزة البحوث البرنامجية المؤسسية لمركز Cedars-Sinai الطبي والمركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية ، UL1TR000124 Grant to V.A.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دولبيكو s النسر المعدل s medium (DMEM)Fisher Scientific10-017-CV
حمض أميني غير أساسيفيشر ScientificMT25025CI
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium ، لا يوجد Phenol RedLife Technologies11058-021
Huh-7.5.1سكريبس للأبحاثتم تقديم خط الخلية من قبل الدكتور فرانسيس تشيساري للدكتور أروموغاسوامي بموجب MTA المنفذة بين معهد سكريبس للأبحاث ومركز سيدارز سيناي
الطبي بلازميدات (pFNX-HCV و pFNX-HCV Pol null و pFNX-Rluc و pFNX-Rluc Pol null)   ؛سيدارز سيناي الطبيتم تصنيع بلازميدات فيروس التهاب الكبد C بواسطة الدكتور أروموغاسوامي باستخدام أوليغو نيوكليوتيدات متداخلة.
شركة XbaINew England Biolabs Inc.R0145S
مونج فول نوكليزنيو إنجلاند بيولابز إنك.M0250S
T7 RiboMAX Express على نطاقPromegaP1320
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 مم)BioexpressE-5010-4
Gene Pulser Xcell Total SystemBio-Rad165-2660
الفأر أحادي النسيلة المضاد للجسم المضاد dsRNA J2 & nbsp ؛الإنجليزية & الاستشارات العلمية Kft.10010200
الماعز المضاد للأرانب IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11008
الماعز المضاد للأرانب IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
حزمة غشاء PVDFBio-Rad162-0263
النشاف الصف الحليب الجاف غير الدسمBio-Rad170-6404XTU
Tween-20Bio-Rad170-6531XTU
المضاد لفيروس التهاب الكبد C NS3 [8 G-2]Abcamab65407
المضاد لفيروس التهاب الكبد C NS3 [H23]Abcamab13830
الماعز المضاد للفأر IgG المقترن ببيروكسيداز الفجل الحار (HRP)  جاكسون لمختبرات الأبحاث المناعية115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Recodes جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياةRPN2236
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W / ROXLife Technologies11744500
ViiA 7 نظام PCR في الوقت الفعليLife TechnologiesNA
Renilla Luciferase نظام الفحصPromegaE2810
RNaseFree DNase PromegaM6101
GloMax-Multi Detection System (مقياس الإضاءة)بروميجا
معهد مركز نظام إنتاج الحمض النووي الريبي واسع مانع شركة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
  2. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
  3. Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
  4. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  5. Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
  6. Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
  7. Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
  8. Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
  9. Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
  10. Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
  11. Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
  12. Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
  13. Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
  14. Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
  15. Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
  16. Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
  17. Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
  18. Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
  19. Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
  20. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  21. Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
  22. Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
  23. Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
  24. Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
  25. Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
  26. Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
  27. Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Huh 7

مقالات ذات صلة