بروتوكول لتحليل التهاب الكبد الوبائي فيروس النسخ المتماثل

التهاب الكبد الوبائي (HCV) يسبب تليف الكبد وسرطان الكبد. فإنه يؤثر على 170 مليون شخص في جميع أنحاء العالم مع 350،000 شخص يموتون سنويا ^1-3. HCV هو حبلا إيجابية فيروس الحمض النووي الريبي مع حجم الجينوم من 9.6 كيلو بايت. تتم ترجمة الجينوم HCV باعتبارها واحدة من polyprotein ~ 3،000 الأمينية بقايا حمض التي المشقوق proteolytically من قبل مختلف البروتياز الخلوية والفيروسية في 10 البروتينية. سي هو فيروس النموذج في جنس Hepacivirus وينتمي إلى عائلة الفيروسات المصفرة ^4. عند التعرض، HCV يحدد عدوى مزمنة في 80٪ من الأفراد. العدوى بدون أعراض في الغالب والتشخيص في الوقت المناسب يمكن أن تسمح التدخل العلاجي لمنع تدهور الكبد. العلاج الحالي هو الأمثل وأي لقاح متاح ^5،6.

وكان أول وصف مسببات التهاب الكبد C في عام 1989 ^7. دراسة النسخ المتماثل HCV المهم لقاح التهاب الكبد C والبحوث العلاج، ولكن كان عليهأعاق طويلة من عدم وجود نظام الثقافة الفيروسية كفاءة. وقد أظهرت استنساخ الجزيئي للفيروس (سي) لتكون معدية في الشمبانزي على التلقيح داخل الكبد ^8. في وقت لاحق، وصفت replicons HCV الفرعية الجيني، مما سمح لتشريح الفيروسية مرحلة تكرار الجينوم في ^9،10 نظام خلية ثقافة. اكتشاف HCV الوراثي 2A عزل JFH-1 (اليابانية التهاب الكبد مداهم-1)، القادرة على إصابة خلية ثقافة فتحت آفاقا جديدة للبحث تكرار HCV ^11-13. سلالة النمط الجيني 2A JFH-1 استنادا الفيروسات خيالية بين وداخل الوراثي والنمط الجيني 1 HCV هي أنظمة الثقافة المعدية استنادا المتاحة، فضلا ^14-18.

وقد استخدمنا بنجاح JFH-1 سلالة وHCV intragenotype 2A الفيروس خيالية للحصول على دقة عالية خارطة التنميط وظيفية من المجالات البروتين ورابطة الدول المستقلة المفعول عناصر الحمض النووي الريبي ^19،20. وفقا لهذا، ونحن هنا تصف نظام الثقافة فعالة تستخدم بشكل روتيني أن يسمحدراسة مراحل مختلفة من دورة النسخ المتماثل HCV والتفاعل المضيف الممرض. نقدم فحوصات الفيروسية لتقييم تكرار الجينوم الفيروسي والعدوى نوفو دي من intragenotype 2A سي ومراسل سي Renilla luciferase المراسل القائمة.

ويتضح A المخطط العام للبروتوكول في الشكل 1.

1. خلايا

1. إعداد وسائط النمو الكامل الذي يحتوي على 10-15٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 10 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 10 ملي Hepes، البنسلين (100 وحدة / مل)، الستربتوميسين (100 ملغ / مل)، و 2 مم L-الجلوتامين.
2. الحفاظ على خلايا هوه 7.5.1 ¹³ في وسائط النمو الكامل الذي يحتوي على ملاحق أعلاه في المختبر لتحليل التهاب الكبد C دورة تكاثر الفيروس.
3. ثقافة سلالات فيروسية في خلايا هوه 7.5.1 مع وسائل الإعلام تستكمل النمو المحدد عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO _2.

2. الفيروسات ويبني البلازميد

1. توليد شكل التكميلية الحمض النووي ([كدنا]) من HCV RNA واستنساخ قبل أن تتحول إلى ناقل البلازميد لسهولة التلاعب الجيني. ملاحظة: اكتشاف التهاب الكبد مداهم اليابانية 1، JFH-1 (النمط الجيني 2A HCV)، وعزل كانت حرجة للبحوث HCV وتستخدم في المقام الأول لدراسة دورة النسخ المتماثل HCV ^11-13. وتستخدم الفيروسات خيالية بين وintragenotypic استنادا JFH HCV-1 عادة في البحوث ^14-18. وقد وصفت بناء الاصطناعية intragenotype 2A الفيروس خيالية، FNX-HCV، وmonocistronic سلالة مراسل خيالية سابقا ¹⁹ و البناء التفاصيل هي خارج نطاق هذا البروتوكول.
2. استخدام pFNX-HCV فيروس intragenotype 2A كما أنه يحتوي على 5'NTR والمناطق وP7 الهيكلية، وجزء من مناطق غير الهيكلية NS2 (النيوكليوتيدات 1-2878) من سلالة الأبوية J6CF (NCBI الانضمام لا. AF177036)، و كذلك مكونات غير الهيكلية من سلالة فيروسية JFH-1 (NCBI الانضمام لا. AB047639). ملاحظة: تم تصنيعه FNX-HCV على أساس تسلسل قطعة Jc1 intragenotype 2A HCV خيالية ذكرت سابقا ^15.
3. توليد خيالية مراسل بناء الفيروسية monocistronic، وpFNX-Rluc، استنادا إلى سلالة pFNX-HCV (أعلاه في الخطوة 2.2) عن طريق إدراج Renilla luciferase المراسل الجينات بين 'NTR 5 والجينات الأساسية (بين الإقليم الشمالي 388 و 389). بعد ذلك، ربط الجينات و luciferase الجينات الأساسية لهذا البناء باستخدام القدم والفم مرض فيروس 2A (F2A) تسلسل الببتيد، التي من شأنها أن تعمل كإشارة الانقسام.
4. مهندس الحمض النووي الريبي بوليميراز الصفرية (بول) بناء الفيروسية باستخدام إما pFNX-HCV أو الخلفية الفيروسية pFNX-Rluc. استبدال بقايا الحفاز NS5B البلمرة، GDD (أأ 2759-2761؛ الإقليم الشمالي 8615-8623)، من أي من هذه العمود الفقرى الفيروسية مع بقايا حمض أميني الاهلي.

3. HCV RNA في المختبر النسخ

1. استخدام intragenotype 2A خيالية فيروس HCV-FNX وFNX-HCV بول فارغة (بول) HCV لتقييم تكاثر الفيروس (الشكل 2A).
2. خطي البلازميدات الفيروسي مع XbaI انزيم التقييد وثم التعامل مع مونج الفول نوكلياز لتوليد نهايات حادة. تنقية البلازميدات هضمها من قبل أنيون تبادل اللوني. تحقق من تكامل سو على خطي البلازميد بإخضاع الحمض النووي لالاغاروز الكهربائي للهلام (الشكل 2B).
3. تدوين البلازميدات الفيروسي خطي باستخدام البلمرة T7-RNA.
4. تنقية توليفها حديثا RNA المعالجة الدناز باستخدام طقم تنقية الحمض النووي الريبي.
5. التحقق من إنتاج الحمض النووي الريبي التي كتبها الاغاروز الكهربائي للهلام (الشكل 2C).
6. قياس الحمض النووي الريبي بواسطة القياس الطيفي.
7. تخزين الحمض النووي الريبي ولدت في -80 درجة مئوية في 10 ميكروغرام مأخوذة العمل. ملاحظة: لتقليل التباين في نوعية الحمض النووي الريبي في كل التصميم التجريبي قبل الكتابة عن الحمض النووي الريبي لكل عينة فيروسية ومراقبة في نفس الوقت.

4. HCV RNA ترنسفكأيشن وجمع العينات

1. حصاد الخلايا هوه 7.5.1 باستخدام التربسين.
2. لشطف الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي و resuspend تعليق الباردة مرتين مع وسائل الاعلام المصل منخفضة. resuspend الخلايا في مصل الدم المنخفض وسائل الاعلام في 1 × 10 ⁷ خلية لكل مل.
3. مزيج ما مجموعه 10 & #956؛ غرام من الحمض النووي الريبي الفيروسي كتب مع 400 ميكرولتر من الخلايا معلق (4 × 10 ⁶ خلايا) في 0.4 سم كفيت electroporation. بالنقل الخلايا عن طريق التثقيب الكهربائي في 270 V، 100 Ω، و 950 μF.
4. resuspend الخلايا electroporated في 10 مل وسائط النمو الكامل مع FBS 15٪. ملاحظة: يعتبر زيادة البقاء على قيد الحياة من خلايا electroporated عندما كانت خلايا هوه 7.5.1 مثقف في 15٪ مصل بقري جنيني.
5. لوحة الخلايا في كل من T-25 قوارير (~ 1.2 × 10 ⁶ خلايا في قارورة) وألواح جيدا 48 (1 × 10 ⁴ خلايا لكل بئر) لكل نقطة من النقاط الزمنية التالية: 4، 48 و 96 ساعة.
6. استبدال وسائل الإعلام في 4-8 ساعة بعد ترنسفكأيشن مع الطازجة وسائط النمو تستكمل مع FBS 10٪ لإزالة الحطام الخلية الميتة من قوارير ومثقف لوحات.
7. supernatants ثقافة الخلية الحصاد في 48 و 96 نقطة الساعة ساعة وإزالة الحطام الخلوية من العينات التي تم جمعها بواسطة الطرد المركزي الخلايا في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة على 4 درجة مئوية.
8. تخزين supernatants خالية من الخلايا في -80 درجة مئوية. ليز الخلايا للبروتين وتحليل الحمض النووي الريبي لطخة الغربية وعكس النسخ PCR الكمي في نقاط زمنية المشار إليه.

5. عكس النسخ كمي PCR (RT-QPCR) لتقييم النسخ HCV الجينوم

1. إجراء من خطوتين RT-QPCR لتحديد HCV RNA الجيني في عدد النسخ.
2. إكتب العكسي 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية باستخدام الناسخ العكسي والتمهيدي محددة لHCV الشعور الذي يربط حبلا ل5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') أو التمهيدي محددة من أجل الوطن الجين peptidylprolyl مصاوغة G (R PPIG : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3). عكس أيضا تدوين FNX-HCV RNA (ولدت في الخطوة 3) نسخ من الجينوم المعروفة ⁽¹⁰ يناير - 10 سبتمبر قياسي) استخدام الحس HCV حبلا التمهيدي.
3. تنفيذ QPCR باستخدام 50 نانوغرام من [كدنا] كتب الناتجة باستخدام بادئات محددة HCV (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3؛ JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') والحمض النووي ملزم الصبغة الخضراء التي تحتوي على مزيج QPCR عظمى. أداء QPCR من أجل الوطن PPIG الجينات وكذلك (الاشعال PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '؛ PPIG R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') ملاحظة: للحصول على حساب دقيق بين الخلايا HCV RNA المستوى عبر العينات، واستخدام الجينات الخلوية التدبير المنزلي، PPIG ، ومستوى التعبير (دورة ط) للتطبيع. استخدام رقم نسخة من الجينوم FNX-HCV كمعيار لتحديد عدد النسخ.
4. استخدام الشروط التالية عند تشغيل QPCR لتحديد عدد نسخ الحمض النووي الريبي HCV: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60   درجة مئوية لمدة 30 ثانية (40 دورات) في الوقت الحقيقي باستخدام نظام PCR.
5. أنظر الشكلين 3A 3B للنتائج وتكرار الجينوم.

6. تحليل الغربية التنشيف للكشف عن HCV التعبير البروتين (الشكل 3C)

1. استخدام الخلية لست الابالحمض النووي الريبي الفيروسي ام transfected في 96 ساعة ترنسفكأيشن آخر للبروتين تحليل النشاف الغربية.
2. حل المحللة الخلية باستخدام SDS-PAGE ونقل إلى difluoride البولي فينيل (PVDF) الغشاء.
3. منع الغشاء باستخدام محلول يحتوي على حجب الحليب الخالي من الدسم 5٪، 0.2٪ توين 20 في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
4. احتضان الغشاء مع الابتدائي الماوس ريتوكسيماب NS3 (1 في 1،000 التخفيف) وبيتا الأكتين (1 في 5،000 التخفيف).
5. إضافة الماعز مفتش مكافحة الماوس مترافق إلى البيروكسيديز الفجل (1 في 5،000 التخفيف) وكشف من قبل لمعان كيميائي.

7. المناعي الفحص (IFA)

1. إصلاح الخلايا المصابة وtransfected HCV باستخدام الميثانول لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة المناعي الفحص.
2. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات ومنع مع ايفا للعرقلة العازلة.
3. استخدام الأرنب بولكلونل مكافحة NS5A الأجسام المضادة في المقام الأول (شريطة التفضل الدكتور داسجوبتا، UCLA) أو الماوس وحيدة النسيلة المضادة للDSRNA الأضداد J2 في التخفيف من 1:200 (1 ميكروغرام / مل)، واحتضان لمدة 5 ساعة بين عشية وضحاها لفي 4 درجة مئوية.
4. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات بعد الأجسام المضادة الأولية.
5. إضافة الماعز المضادة للأرنب مفتش-488 الضد الثانوية بولكلونل أو الماعز المضادة للماوس مفتش-594 الضد الثانوية بولكلونل في التخفيف 1:1،000 (1 ميكروغرام / مل)، واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
6. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات ونوى وصمة عار باستخدام هويشت الصبغة وطريقة العرض باستخدام المجهر الفلورسنت (الشكل 3D).

8. عيار قياس الفيروسات

1. لوحة ساذجة هوه 7.5.1 الخلايا في حوالي 3 × 10 ³ خلية / جيدا باستخدام لوحة 96 جيدا. في اليوم التالي، نفذ التخفيفات التسلسلي 10 أضعاف للثقافة خالية من الخلايا طاف تحصد من الحمض النووي الريبي transfected خلايا الكبد الوبائي باستخدام وسائل الإعلام النمو وتطعيم في ثلاث نسخ على هوه 7.5.1 الخلايا.
2. إصلاح الخلايا في 72 ساعة بعد العدوى باستخدام الميثانول (لمدة 30 دقيقة في -20
3. استخدام أعلى التخفيف من الاعتماد على البؤر الإيجابية NS5A وحساب متوسط ​​عدد التركيز وحدة تشكيل (FFU) في الملليمتر الواحد. انظر الشكل (4) لفيروس (سي) عيار.

9. Renilla luciferase المراسل مراسل الفحص لالفيروسية الجينوم النسخ المتماثل والعدوى

1. لتقييم تكرار الجينوم الفيروسي، لوحة HCV-RNA electroporated هوه 7.5.1 الخلايا في ثلاث نسخ في لوحات 48 جيدا (1 × 10 ⁴ خلايا / جيد).
2. ليز الخلايا مع 75 ميكرولتر من تحلل العازلة السلبي في ساعة 6، 48 ساعة، و 96 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
3. موسيقى الروك لوحات بلطف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
4. لقياس Renilla luciferase المراسل النشاط الأنزيمي، ذوبان الجليد في المحللة البروتين وRenilla luciferase المراسل الكواشف مقايسة إلى درجة حرارة الغرفة.
5. إضافة 20 ميكرولتر من البروتين المحللة لكل بئر من على بعد 96 أهلا وسهلا ل لوحة التلألؤ البيضاء ووضع لوحة في luminometer.
6. الاستغناء 100 ميكرولتر من Renilla luciferase الفحص الكاشف (coelenterazine الركيزة عازلة +) لكل بئر، وبعد 2 ثانية قبل قراءة تأخير؛ دمج الضوء المنبعث لمدة 10 ثانية.
7. حساب المتوسط ​​والانحراف المعياري لكل عينة من القيم luciferase المراسل من يثلث البيولوجية وإخضاع البيانات إلى التحليل الإحصائي (الشكل 5).
8. لتقييم العدوى، تطعيم 500 ميكرولتر من طاف خالية من الخلايا التي تم الحصول عليها من خلايا transfected الحمض النووي الريبي HCV لنقاط الوقت المشار إليه (48 ساعة و 96 ساعة) في ثلاث نسخ على السذاجة هوه 7.5.1 الخلايا في لوحات 48 عاما أيضا.
9. استبدال اللقاح الفيروسي مع 500 ميكرولتر من متوسطة جديدة لكل بئر بعد 6 ساعة بعد العدوى.
10. ليز الخلايا في 48 ساعة بعد الإصابة، وتخضع لRenilla luciferase الفحص كما هو موضح في الخطوات 8،2-8،7 (الشكل 5).

1. أشرطة الخطأ في الرسوم البيانية تشير الانحرافات المعيارية (SD). تم حساب القيم P من ر الاختبار المفردة.

فيروس التهاب الكبد C هو فيروس الحمض النووي الريبي. وبالتالي لغرض التلاعب الجيني، وقد تم استنساخ [كدنا] HCV الجيني في البلازميد ناقلات البكتيرية. وقدم تسلسل الحمض النووي الريبي بوليميراز المروج T7 مباشرة قبل 5 'نهاية الجينوم HCV. ويرد المخطط العام للتحليل HCV سير العمل في الشكل 1. HCV RNA لتوليد الجيني مع الدقيق 'نهاية 3، يتم قطع الجينوم تحتوي على البلازميد مع HCV Xba أنا تقييد انزيم وتم إنشاؤها قلل من عبء واحد الذين تقطعت بهم السبل مع الفول مونج نوكلياز الهضم . وتم تقييم نوعية البلازميد HCV خطي من قبل الاغاروز الكهربائي للهلام (الشكل 2B). تعرض الحمض النووي HCV RNA T7 إلى البلمرة بوساطة النسخ في المختبر والحمض النووي الريبي الناتجة أسفرت عن منتج واحد عند 9.6 كيلو قاعدة (الشكل 2C).

اختبرنا حركية النمو من intragenotype 2A HCV (الشكل60، 3). و electroporated الخلايا هوه 7.5.1 مع الحمض النووي الريبي في المختبر كتب البرية من نوع (WT) والبلمرة الفيروسات فارغة. قمنا بتقييم بمعنى تكرار الجينوم الفيروسي عن طريق RT-QPCR. وأشارت النتائج إلى أن الفيروس WT نسخ الجينوم بكفاءة (أرقام 3A 3B و). من النوع البري أظهرت مستوى 1-3 سجل أعلى النسخ المتماثل الجينوم مقارنة بما كان عليه من بول الفيروسات. الفيروس WT تنتج البروتين NS3 (الشكل 3C) التي تشارك في الانقسام البروتين الفيروسي (نشاط الأنزيم البروتيني)، وتكرار الجينوم (النشاط helicase). كما أعرب عن فيروس WT البروتين NS5A وفقا لتقييم المناعي فحص (الشكل 3D). البروتين NS5A هو جزء من الحمض النووي الريبي معقدة المتنسخة HCV. لتصور تكرار الجينوم الفيروسي، درسنا وجود المزدوج تقطعت بهم السبل (س) HCV RNA باستخدام جسم مضاد يعترف تحديدا الرنا المزدوج الجديلة. خلال HCV الجينوم التضخيم، والحمض النووي الريبي حبلا الشعور هو جopied لمكافحة الشعور الجينوم، وبالتالي فإن مضاعفة الحمض النووي الريبي الذين تقطعت بهم السبل وسيطة موجودة في الخلية السيتوبلازم المصابة. البروتين NS5A والرنا المزدوج الجديلة المشترك يموضع في السيتوبلازم الخلوي (الشكل 3D) WT من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مما يدل على تكاثر الفيروس النشط. أخذت معا، أنشأ الفيروس WT تكرار النشطة في transfected هوه 7.5.1 الخلايا.

وكان التقدم في مجال البحوث HCV تم محدودة بسبب عدم وجود نظام زراعة الخلايا المعدية. اكتشاف JFH-1 سلالة من فيروس (سي) وتوصيف سلالات اللاحقة المختبر خيالية سمح لنا للتحقيق في دورة النسخ المتماثل HCV كامل في الثقافة الخلية بما في ذلك دخول الفيروس، ترجمة الحمض النووي الريبي، وتكرار الحمض النووي الريبي وتشكيل ذرية الفيروسية المعدية. لتقييم عيار سي دي والعدوى نوفو، ونحن تلقيح supernatants خلية ثقافة تحصد من الحمض النووي الريبي transfected خلايا سي. وقد تصور فيروس التهاب الكبد الوبائي عن طريق الكشف عن البروتين NS5A HCV ويحسبعيار الفيروسية عن طريق عد البؤر المعدية (الشكل 4). رأيناها العنقودية المعزولة من الخلايا (خلايا أكثر من 2) إيجابية لNS5A باعتباره بؤرة واحدة. وأشارت النتائج إلى أن الفيروس WT هو المعدية وتنتج أكثر من 10 4 بؤر تشكيل وحدة / مل من الجسيمات المعدية.

أنشأنا أيضا HCV الفيروس مراسل إيواء Renilla luciferase المراسل (Rluc) الجين مراسل (الشكل 5A). A HCV مراسل يمكن استخدامها لاختبار عدد كبير من الفيروسات متحولة وكذلك لارتفاع محتوى فحوصات الفرز. نحن هنا تقديم تقييم الظواهر نمو WT والفيروسات بول المراسل. إذا يعيد الجينوم الفيروسي، فإن luciferase النشاط زيادة الوقت بدل الضائع ترنسفكأيشن آخر. زيادة مستويات تكرار الجينوم يمكن استخلاصه من زيادة luciferase النشاط. وبالتالي، فإن luciferase النشاط يوفر بشكل غير مباشر بقياس مستوى تكرار الجينوم. ولست] تحصد من WT أو بول السادستم اختبار الحمض النووي الريبي راؤول الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في نقاط زمنية للأنشطة المشار luciferase المراسل. في 6 ساعة بعد ترنسفكأيشن، كان كل WT وبول الفيروسات الأنشطة luciferase المراسل مماثلة، مشيرا إلى مستوى المدخلات مماثلة من الحمض النووي الريبي transfected التي ترجمت (الشكل 5B). ولكن في 48 ساعة و 96 ساعة بعد ترنسفكأيشن، فإن الفيروس WT معارضها زيادة مستويات تكرار الجينوم مقارنة بما كان عليه من بول الفيروسات. أيضا، فإن الفيروس تنتج البروتين WT NS3 الفيروسية كما تم التحقق منها من خلال تحليل النشاف الغربية (الشكل 5C). في وقت لاحق، ونحن اختبار العدوى من الفيروسات وWT بول مراسل، فحقن السذاجة هوه 7.5.1 الخلايا مع supernatants خالية من الخلايا التي تم جمعها من 48 ساعة و 96 ساعة، transfected آخر الثقافات الخلية. كان بول الفيروسات luciferase النشاط على مستوى القاعدة، في حين كان مستوى الفيروس WT 2-3 سجل أعلى من النسخ المتماثل إلى أن فيروس بول مراسل (الشكل 5D). تثبت النتائج أن لدينا قوية HCV المعدية cultu الخلية إعادة النظام.

الشكل 1. مخطط العام للنسخ المتماثل HCV تحليل سير العمل. خطي البلازميد HCV RNA T7 بناء تحتوي على البلمرة المروج (T7P) تعرض لفي المختبر النسخ. وelectroporated وHCV RNA تنقية الجينوم في الخلايا هوه 7.5.1 ومطلي في قوارير و48 لوحة جيدا. في 4 ساعات و 48 ساعة، و 96 ساعة بعد ترنسفكأيشن، يتم حصاد RNA الخلوية وsupernatants الثقافة من القوارير. وتستخدم الخلايا من لوحة 48 جيدا للحصاد البروتين المحللة وثابتة لفحص المناعي. تحليل عدد نسخ الجينوم بواسطة RT-QPCR، تتم الغربية النشاف وقياس عيار الفيروسية لتقييم تكرار HCV.

1362fig2highres.jpg "العرض =" 400 "/>
الشكل 2. إنتاج الرنا HCV الجيني عن طريق النسخ في المختبر من السلطات الوطنية المعينة البلازميد التي شيدت. A) منظمة الجينوم من الفيروسات خيالية J6CF/JFH-1 intragenotype 2A، FNX-HCV-HCV وFNX بول فارغة. ويصور المنطقة J6CF سلالة (5'NTR إلى جزء من NS2) في الرمادي الداكن والمنطقة سلالة JFH-1 (جزء من NS2 ل3'NTR) يتم عرضها في الرمادي الفاتح. يشار NS5B البلمرة طفرة مجال الحفاز (GDD لمجموعة الاهلي) مع النجمة. ب) الخطوات المتبعة في توليد خطي HCV البلازميد. يظهر في الصورة من هلام خطي، حادة السلطات الوطنية المعينة البلازميد العضوية التي تنتجها Xba الأول ومونج الفول نوكلياز الهضم، وعلى استعداد لفي المختبر النسخ. تم استخدام 0.8٪ agarose هلام لحسم الحمض النووي. C) صورة جل يصور الرنا HCV الجيني التي تنتجها في المختبر باستخدام الحمض النووي الريبي النسخ نظام البلمرة T7. WT: من النوع البري؛ بول: فارغة البلمرة؛ M:علامة.

الرقم 3. تقييم الظواهر نمو بنيات HCV. أ) تقييم حركية تكرار الجينوم البرية من نوع (WT) والبلمرة فارغة (بول) فيروسات. يتم عرض الأرقام نسخة جينوم الحمض النووي الريبي حبلا الشعور المقررة من قبل RT-QPCR في الرسم البياني بار. انخفض نسخ الجينوم الفيروسي من بول الفيروسات على مدى فترة من الزمن مما يدل تكرار النمط الظاهري ناقص. B) ومقارنة الجينوم النسبية مستوى تكرار البرية من نوع سي إلى أن من بول الفيروسات. C) تحليل لطخة غربية من البروتين HCV التعبير. تم الكشف عن بروتين سي NS3 ويستخدم بيتا الأكتين كعنصر تحكم الخلوية. د) الفحص المناعي للتحقيق في تكاثر الفيروس. في 96 ساعة بعد electroporation تم إصلاح الخلايا والتعرض للIMMunostaining للبروتين HCV RNA وNS5A المزدوج تقطعت بهم السبل (س RNA)، وهو علامة لHCV RNA سيطة النسخ المتماثل. وتصور نوى مع هويشت صمة عار (شريط مقياس 50 ميكرون). HPT: ساعة بعد ترنسفكأيشن الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. فحص العدوى من التهاب الكبد الوبائي من النوع البري وقياس عيار الفيروس. أ) استخدمت الخلايا السذاجة هوه 7.5.1 للدراسات العدوى. وتعرض طاف خالية من الخلايا التي تم جمعها في 48 و 96 ساعة بعد ترنسفكأيشن (HPT) من HCV RNA إلى 10 أضعاف التخفيف المتسلسل وإضافتها إلى الخلايا في لوحة 96 جيدا في ثلاث نسخ. 72 ساعة بعد الإصابة، تم إصلاح الخلايا وimmunostained لبروتين سي NS5A. الخلايا مع Nيصاب S5A تلطيخ إيجابية (الحمراء) مع الفيروس. لتقييم تشكيل وحدة البؤر (FFU)، وقد عد البؤر الإيجابية على أعلى التخفيف. وتظهر لوحات ممثل الصور (شريط مقياس 100 ميكرون). ب) يتم عرض متوسط ​​القيم والانحرافات المعيارية من عيار الفيروسية في FFU في الملليمتر الواحد في الرسم البياني. لم متحولة فارغة البلمرة لا تنتج جزيئات معدية. WT: من النوع البري؛ بول:. فارغة البلمرة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5. تقييم تكرار الجينوم والعدوى مراسل سي. A) ويرد الكرتون من intragenotype 2A الفيروس مراسل خيالية. والجين luciferase المراسل Renilla هو إدراج inframويرد الإلكترونية بين 5'NTR والأساسية. ب) حركية تكرار الجينوم من نوع البرية والفيروسات مراسل بول متحولة في الوقت المشار إليه يشير آخر ترنسفكأيشن في الرسم البياني. تم حصادها لست] البروتين في 6 ساعة، 48 ساعة و 96 ساعة نقاط زمنية لقياس Renilla luciferase المراسل النشاط الأنزيمي. يتم عرض المتوسط ​​والانحراف المعياري وتحسب من ثلاث نسخ Renilla القيم luciferase المراسل (RLV) لكل الفيروس في الرسم البياني. C) يبين لوحة النشاف الغربية البروتين التعبير HCV NS3. A مستضد غير محددة الكشف عنها بواسطة NS3 الأجسام المضادة الأولية بمثابة تحكم التحميل. البرية من نوع (WT) فيروس مراسل تنتج مستوى عال من البروتين NS3. D) تحليل العدوى بالفيروس. تم تلقيح السذاجة هوه 7.5.1 مع الخلايا طاف خالية من الخلايا التي تم الحصول عليها من ثقافة transfected في 48 ساعة و 96 نقطة الساعة ساعة. تم قياس أنشطة luciferase المراسل Renilla من الخلايا المصابة في 48 ساعة بعد العدوى.يتم عرض القيم المتوسطة مع انحراف معياري في الرسم البياني. الفيروس بول مراسل المصابين زيارتها خلايا مستوى الخلفية فقط من luciferase النشاط، في حين WT الفيروس مراسل أظهرت مستوى عال من العدوى.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.