Method Article

بروتوكول لتحليل التهاب الكبد الوبائي فيروس النسخ المتماثل

DOI:

10.3791/51362

⸱

June 26th, 2014

 ,  , 
1Liver Program at Regenerative Medicine Institute, Department of Biomedical Sciences, Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروس التهاب الكبد C (HCV) هو أحد مسببات الأمراض البشرية الرئيسية التي تسبب اضطرابات الكبد، بما في ذلك تليف الكبد والسرطان. يعد نظام زراعة الخلايا المعدية لفيروس التهاب الكبد C ضروريا لفهم الآلية الجزيئية لتكاثر فيروس التهاب الكبد C وتطوير مناهج علاجية جديدة. نصف هنا بروتوكولا للتحقيق في مراحل مختلفة من دورة تكرار فيروس التهاب الكبد C.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب الكبد C فيروس (HCV) يؤثر على 3٪ من سكان العالم ويسبب أمراض خطيرة في الكبد بما في ذلك التهاب الكبد المزمن، تليف الكبد، وسرطان الكبد. سي هو فيروس الحمض النووي الريبي يلفها ينتمون إلى عائلة الفيروسات المصفرة. العلاج الحالية ليست فعالة تماما ويسبب آثار جانبية ضارة. لا يوجد لقاح التهاب الكبد الوبائي المتاحة. وبالتالي، مطلوب جهد استمر لتطوير لقاح وعلاج أفضل. خلية نظام الثقافة HCV أمر بالغ الأهمية لدراسة مختلف مراحل النمو بما في ذلك دخول الفيروس HCV، وتكرار الجينوم، والتغليف، والخروج. في الإجراء الحالي قدم، كنا فيروس من النوع البري intragenotype 2A خيالية، FNX-HCV، والمؤتلف فيروس FNX-Rluc يحمل Renilla luciferase المراسل مراسل الجينات لدراسة تكاثر الفيروس. خط الخلية الكبدي الإنسان كان يستخدم لترنسفكأيشن في المختبر (7 هوه القائم) كتب HCV الرنا الجيني. supernatants ثقافة خالية من الخلايا، لست] البروتين ورتم حصادها RNA OTAL في وقت مختلف النقاط بعد ترنسفكأيشن لتقييم النمو HCV. تم تقييم HCV الجينوم حالة النسخ المتماثل التي كتبها الكمي RT-PCR وتصور وجود HCV RNA المزدوج تقطعت بهم السبل. تم التحقق من التعبير البروتين HCV بواسطة وصمة عار والمقايسات المناعي الغربية باستخدام الأجسام المضادة المحددة لHCV NS3 وNS5A البروتينات. وقد تم قياس الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل HCV RNA صدر الجسيمات المعدية في طاف الثقافة وعيار الفيروسية. واستخدمت المقايسات luciferase المراسل لتقييم مستوى التكرار والعدوى مراسل سي. في الختام، فإننا نقدم مختلف المقايسات الفيروسية لوصف المراحل المختلفة من دورة النسخ المتماثل HCV.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب الكبد الوبائي (HCV) يسبب تليف الكبد وسرطان الكبد. فإنه يؤثر على 170 مليون شخص في جميع أنحاء العالم مع 350،000 شخص يموتون سنويا 1-3. HCV هو حبلا إيجابية فيروس الحمض النووي الريبي مع حجم الجينوم من 9.6 كيلو بايت. تتم ترجمة الجينوم HCV باعتبارها واحدة من polyprotein ~ 3،000 الأمينية بقايا حمض التي المشقوق proteolytically من قبل مختلف البروتياز الخلوية والفيروسية في 10 البروتينية. سي هو فيروس النموذج في جنس Hepacivirus وينتمي إلى عائلة الفيروسات المصفرة 4. عند التعرض، HCV يحدد عدوى مزمنة في 80٪ من الأفراد. العدوى بدون أعراض في الغالب والتشخيص في الوقت المناسب يمكن أن تسمح التدخل العلاجي لمنع تد....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتضح A المخطط العام للبروتوكول في الشكل 1.

1. خلايا

  1. إعداد وسائط النمو الكامل الذي يحتوي على 10-15٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 10 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 10 ملي Hepes، البنسلين (100 وحدة / مل)، الستربتوميسين (100 ملغ / مل)، و 2 مم L-الجلوتامين.
  2. الحفاظ على خلايا هوه 7.5.1 13 في وسائط النمو الكامل الذي يحتوي على ملاحق أعلاه في المختبر لتحليل التهاب الكبد C دورة تكاثر الفيروس. <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروس التهاب الكبد C هو فيروس الحمض النووي الريبي. وبالتالي لغرض التلاعب الجيني، وقد تم استنساخ [كدنا] HCV الجيني في البلازميد ناقلات البكتيرية. وقدم تسلسل الحمض النووي الريبي بوليميراز المروج T7 مباشرة قبل 5 'نهاية الجينوم HCV. ويرد المخطط العام للتحليل HCV سير العمل في الشكل 1. HCV RNA لتوليد الجيني مع الدقيق 'نهاية 3، يتم قطع الجينوم تحتوي على البلازميد مع HCV Xba أنا تقييد انزيم وتم إنشاؤها قلل من عبء واحد الذين تقطعت بهم السبل مع الفول مونج نوكلياز ا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا التوضيح طريقة لتحليل دورة النسخ المتماثل فيروس التهاب الكبد الوبائي. HCV هو الممرض الإنسان وسوف بروتوكول السلامة الأحيائية وصفه يجب اتباعها بدقة. وقد وصفت نظم زراعة الخلايا HCV المعدية سابقا 11-13،16،17. هناك عدد قليل من النقاط الحاسمة عندما ننفذ بعد بروتوكول موضح. الأولى، فإنه من الأهمية العالية لنوعية جيدة من سليمة كامل طول الفيروسي RNA الجيني للدراسات المصب. البلازميد المدخلات تحمل كدنا] الفيروسية لابد من خطي وقلل بعناية. ونوكلياز مونج الفول تستخدم لفظة X.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر F. Chisari على توفير خط خلية Huh-7.5.1. نود أن نشكر جوستين هو على تحرير المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل جائزة البحوث البرنامجية المؤسسية لمركز Cedars-Sinai الطبي والمركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية ، UL1TR000124 Grant to V.A.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
دولبيكو s النسر المعدل s medium (DMEM)Fisher Scientific10-017-CV
حمض أميني غير أساسيفيشر ScientificMT25025CI
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium ، لا يوجد Phenol RedLife Technologies11058-021
Huh-7.5.1سكريبس للأبحاثتم تقديم خط الخلية من قبل الدكتور فرانسيس تشيساري للدكتور أروموغاسوامي بموجب MTA المنفذة بين معهد سكريبس للأبحاث ومركز سيدارز سيناي
الطبي بلازميدات (pFNX-HCV و pFNX-HCV Pol null و pFNX-Rluc و pFNX-Rluc Pol null)   ؛سيدارز سيناي الطبيتم تصنيع بلازميدات فيروس التهاب الكبد C بواسطة الدكتور أروموغاسوامي باستخدام أوليغو نيوكليوتيدات متداخلة.
شركة XbaINew England Biolabs Inc.R0145S
مونج فول نوكليزنيو إنجلاند بيولابز إنك.M0250S
T7 RiboMAX Express على نطاقPromegaP1320
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 مم)BioexpressE-5010-4
Gene Pulser Xcell Total SystemBio-Rad165-2660
الفأر أحادي النسيلة المضاد للجسم المضاد dsRNA J2 & nbsp ؛الإنجليزية & الاستشارات العلمية Kft.10010200
الماعز المضاد للأرانب IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11008
الماعز المضاد للأرانب IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
حزمة غشاء PVDFBio-Rad162-0263
النشاف الصف الحليب الجاف غير الدسمBio-Rad170-6404XTU
Tween-20Bio-Rad170-6531XTU
المضاد لفيروس التهاب الكبد C NS3 [8 G-2]Abcamab65407
المضاد لفيروس التهاب الكبد C NS3 [H23]Abcamab13830
الماعز المضاد للفأر IgG المقترن ببيروكسيداز الفجل الحار (HRP)  جاكسون لمختبرات الأبحاث المناعية115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Recodes جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياةRPN2236
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W / ROXLife Technologies11744500
ViiA 7 نظام PCR في الوقت الفعليLife TechnologiesNA
Renilla Luciferase نظام الفحصPromegaE2810
RNaseFree DNase PromegaM6101
GloMax-Multi Detection System (مقياس الإضاءة)بروميجا
معهد مركز نظام إنتاج الحمض النووي الريبي واسع مانع شركة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
  2. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
  3. Lavanchy, D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis C VirusHCV ReplicationViral RNA TransfectionQuantitative RT PCRWestern BlotImmunofluorescence AssayViral Titer MeasurementLuciferase AssayCell Culture SupernatantHuh 7 Cells

Related Articles