يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تلطيخ النسيجية من

42.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51381

⸱

مايو 13, 2014

 , 
1Feedstocks Division, Joint Bioenergy Institute, 2Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

في هذه المقالة

ملخص

يختلف تكوين جدار الخلية النباتية بين أنواع الأنسجة ويمكن أن يشمل اللجنين والسليلوز والهيميسليلوز والبكتين. تم تطوير تقنيات تلوين مختلفة لتصور الاختلافات على مستوى نوع الخلية. هذه الورقة عبارة عن مجموعة من تقنيات تلطيخ جدار الخلية شائعة الاستخدام.

الملخص

Arabidopsis thaliana هو كائن حي نموذجي يستخدم بشكل شائع لفهم العمليات الخلوية المختلفة في النباتات ومعالجتها ، وقد تم استخدامه على نطاق واسع في دراسة تكوين جدار الخلية الثانوي. يحدث ترسب جدار الخلية الثانوي بعد وضع جدار الخلية الأساسي ، وهي عملية يتم تنفيذها حصريا بواسطة خلايا متخصصة مثل تلك التي تشكل أنسجة الأوعية الدموية والألياف. تتكون معظم جدران الخلايا الثانوية من السليلوز (40-50٪) والهيميسليلوز (25-30٪) واللجنين (20-30٪). تم عزل العديد من الطفرات التي تؤثر على التخليق الحيوي لجدار الخلية الثانوي ، وقد تظهر الطفرات المقابلة أو لا تظهر تغيرات واضحة في التركيب الكيميائي الحيوي أو الأنماط الظاهرية المرئية حيث يمكن إخفاء هذه الطفرات من خلال الاستجابات التعويضية. تم استخدام إجراءات التلوين تاريخيا لإظهار الاختلافات على أساس خلوي. هذه الأساليب هي وسائل تحليلية مرئية حصرية. ومع ذلك ، فإن دورها في التحليل السريع والنقدي له أهمية كبيرة. الكونغو الأحمر والأبيض الكالكوفلوري هي بقع تستخدم للكشف عن السكريات ، بينما يشيع استخدام Mäule و phloroglucinol لتحديد الاختلافات في اللجنين ، ويستخدم التولودين الأزرق O لصبغة السكريات واللجنين بشكل تفاضلي. يمكن أن تشكل التقنيات التي تبدو بسيطة للتقسيم والتلوين والتصوير تحديا للمبتدئين. بدءا من تحضير العينة باستخدام نموذج A. thaliana ، توضح هذه الدراسة بالتفصيل بروتوكولات مجموعة متنوعة من منهجيات التلوين التي يمكن تنفيذها بسهولة لمراقبة تنظيم الخلايا والأنسجة في جدران الخلايا الثانوية للنباتات.

المقدمة

جدار الخلية النباتية يحمل مجموعة كبيرة من المعلومات ضمن مختلف مكوناته: اللجنين، السليلوز، hemicelluloses (الزيلان، glucuronoxylan، xyloglucan، arabinoxylan، الربط المختلطة جلوكان، أو glucomannan)، والبكتين. توفير التقنيات النسيجية الإشارات البصرية الهامة في دراسة الاختلافات داخل جدران الخلايا الثانوية في المستويات التنظيمية والخلوية. تم تطوير تقنيات النسيجية المختلفة ويمكن العثور عليها في الأدب، ولكن يمكن لهذه التقنيات أن يكون تحديا للمبتدئين وتستغرق وقتا طويلا لأن بروتوكولات مفصلة جدا مع تعليمات بسيطة ونادرا ما تكون مرئية إذا كان متوفرا من أي وقت مضى. الهدف من هذه الدراسة هو تقديم الإرشادات البسيطة لتقنيات تلطيخ النسيجية للحصول على صور عالية الجودة.

باجتزاء الأنسجة الجذعية هي الخطوة الأولى في التصور من جدران الخلايا والأشكال الخلية. على الرغم من المقاطع ومن ناحية القص غير مكلفة وتستغرق وقتا أقل للتحضير، واستخدام vibratome يقدم الاتساق وتعطي صور عالية الجودة. باستخدام vibratome يسمح إنتاج أفضل نوعية البيانات عن طريق توليد أقسام حتى مع نفس السمك، مما يساعد على إنتاج صور حادة ويقلل بشكل ملحوظ من خطر ينتج عنها اختلافات دقيقة بين العينات التي من شأنها أن يكون سبب ذلك ببساطة عن طريق إعداد عينة سيئة. يمكن باستخدام راتنجات لإصلاح العينات الطازجة يكون تحديا للمبتدئين ويمكن أن تكون لا تزال تستغرق وقتا طويلا حتى بالنسبة للخبراء عندما يحتاج تحليلا ينبغي القيام به بسرعة. بالإضافة إلى ذلك، يصبح من المستحيل لقياس أي نشاط بيولوجي مع العينة عندما تم تضمين ذلك في الراتنج. أسلوب واحد بسيط هو أن توظف الاغاروز والعفن محلية الصنع هي مفيدة لتضمين الأنسجة الجذعية، ويمكن أيضا أن تستخدم في تطبيقات أخرى تتطلب تشريح الأنسجة الرخوة. بالمقارنة مع تضمين العينات في الراتنج، وهذا الأسلوب له ميزة الحفاظ على الأنسجة على قيد الحياة والحد من التلاعب العينة. باجتزاء الأنسجة عن طريق vibratome هو دقيق للغاية ويولد homogenأقسام الأوس، والتي، اعتمادا على الهدف من الدراسة، ومن ثم يمكن استخدامها مع العديد من التقنيات تلطيخ مختلفة.

أبسط الطرق لتصور اللجنين والمواد العطرية الأخرى تستخدم الأشعة فوق البنفسجية (UV) ضوء. الإثارة من الجزيئات العطرية مقرها من قبل ضوء الأشعة فوق البنفسجية هي تقنية قديمة، ولكنها لا تزال واحدة من أسرع النهج لرؤية اللجنين. ومع ذلك، والتصور للأشعة فوق البنفسجية هو في الواقع ليست مثالية للكشف عن اللجنين لضوء الأشعة فوق البنفسجية سوف تثير العطرية الأخرى. يتكون اللجنين في المقام الأول من ثلاث كتل بناء، وmonolignols (الكحول hydroxycinnamyl: الكحول coniferyl والكحول sinapyl، وف coumaryl الكحول) 1-3. يمكن فلوروغلوسين صمة عار توفر أدلة على مدى cinnamaldehydes الموجودة في الخشب والألياف والأنسجة القصبة الهوائية 4. فلوروغلوسين يعد مؤشرا جيدا من cinnamaldehydes العامة ويمكن التفريق بين cinnamaldehydes والعطرية الأخرى. ويمكن الكشف عن الكحول مونومرات sinapylومتمايزة عن طريق استخدام مولي وصمة عار. طولويدين يا الأزرق هو صبغة متعدد الألوان، ولديه القدرة وصمة عار عناصر مختلفة من جدار الخلية في ألوان مختلفة 5،6 بالتالي. الاستخدام الرئيسي للطولويدين يا الأزرق هو للكشف عن البكتين واللجنين 5،6. ميزة استخدام طولويدين يا الأزرق هو أن العديد من عناصر جدار الخلية يمكن تصور في خطوة واحدة. كلا calcofluor الأبيض والكونغو الحمراء هي سهلة للعمل مع، ويمكن استخدامها لتصور السليلوز. Calcofluor البقع البيضاء السليلوز، callose، وغيرها من β جلوكان غير استبداله أو استبداله ضعيفة 6-9، في حين الكونغو البقع الحمراء مباشرة إلى β (1 → 4) جلوكان وبشكل خاص لالسيليلوز 10،11. الهدف من هذه الدراسة هو تقديم الإرشادات البسيطة لاستخدام التقنيات تلطيخ المذكورة أعلاه للحصول على صور عالية الجودة من A. ينبع thaliana.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الجذعية تضمينها

  1. جعل الحل الاغاروز 7٪ في الماء (7 غرام من الاغاروز الكهربائي الصف في 100 مل من الماء المقطر). حل الاغاروز بواسطة التعقيم لمدة 20 دقيقة أو عن طريق الميكروويف لمدة 20 دقيقة في أقل كثافة (على سبيل المثال، 10٪ من كثافة الميكروويف 1،250 واط).
  2. إعداد قالب محلية الصنع لتضمين ينبع باستخدام قوارير البلاستيك.
    1. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع أسفل المخروطية من 2 مل المسمار غطاء أنبوب microcentrifuge (الجزء أ). مع إبرة حقنة، ثقب ثقبا في غطاء أنبوب أكبر قليلا من قطر الجذعية لتكون جزءا لا يتجزأ. المقبل، وقطع من 0.5 سم في الجزء السفلي من 0.6 مل أنبوب microcentrifuge (الجزء ب).
    2. إضافة قطع 0.5 سم جزء من أنبوب microcentrifuge 0.6 مل مل في أنبوب microcentrifuge قبل القطع 2. ختم شطري باستخدام Parafilm (الشكل 1). ملاحظة: يتم قطع الجزء السفلي من الأنبوب لتسهيل إزالة عينة جزءا لا يتجزأ بعد أن عززت agarose. Tكان ثقب في الغطاء سوف تساعد في عقد الجذعية ثابت عندما يتم تضمين الجذعية في الاغاروز. سوف تخدم العفن لعقد الاغاروز وعقد على التوالي الجذعية عندما التضمين. سوف Parafilm عقد شطري، ألف وباء، حتى يتم تعيين الاغاروز وجزءا لا يتجزأ من الجذع.
    3. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع جزء الجذعية من منطقة الفائدة، (على سبيل المثال منتصف الأولى السلاميات الجذعية). ملاحظة: من الناحية المثالية، ينبغي خفض الجذعية قبل التضمين لتجنب الدمار بسبب الجفاف. بدلا من ذلك، الجذعية يمكن تخزينها مؤقتا في لوحة تحتوي على ورق الترشيح المبللة بالماء. يمكن وضع هذه اللوحة على الجليد حتى جاهزة للجزءا لا يتجزأ من النسيج لمنع الجفاف وتشوه. سوف تخزين الجذعية لفترات أطول من 30 دقيقة من دون رطوبة عالية تسبب الجذعية لتجف.
  3. إذابة الاغاروز في الميكروويف في كثافة منخفضة. تحذير: زجاجة تحتوي على الاغاروز قد تكون ساخنة. استخدام قفاز لالتقاط زجاجة. السماح ليالي الاغاروز ذابTAND في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 درجة مئوية و 25 درجة مئوية) حتى يبرد إلى حوالي 50 درجة مئوية.
  4. ماصة ببطء 5 مل من الاغاروز في قالب من البلاستيك ولم يضف لملء القارورة. ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في قوالب. سوف فقاعات الهواء يسبب فجوات في قالب الاغاروز ولن تغطي كامل العينة الجذعية، الأمر الذي سيؤدي في نهاية المطاف إلى قطع متفاوتة من المقاطع العينة.
    1. السماح للالاغاروز يبرد لمدة 30 إلى 60 ثانية لتصبح نصف صلبة. اختبار مع مسواك الصغيرة، والتأكد من أنها يمكن أن تخترق والوقوف، ولكن لا تطفو، في الاغاروز. ملاحظة: إذا تم وضع الجذعية عندما الاغاروز لا تزال ساخنة فإنه سوف يضر عينة من الذبول الجذعية، وتدمير مورفولوجيا الخلايا.
    2. وضع الجذعية في هذا مملوءة الاغاروز القارورة. تأكد من أن يبقى الجذعية على التوالي. وضع غطاء مثقب في مثل هذه الطريقة التي يقام غيض من الجذعية من الغطاء. لا تتحول الغطاء المسمار على. في وقت ما أكثر من واحد الجذعية (من نوع واحد) يمكن أن يكون EMBEdded في قنينة واحدة؛ ولكن في هذه الحالة بالذات، لا تستخدم الغطاء. ملاحظة: إذا تم تشغيل كاب المسمار، سوف تحصل على جذع الملتوية.
  5. ترك القارورة في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية لمدة 10-30 دقيقة، حتى يتصلب.
  6. إزالة العفن من الانزلاق برفق من الأنبوب. فتح Parafilm. دفع الجزء السفلي من الجزء باء من العفن بلطف مع الإبهام للافراج عن الاغاروز طدت من الجزء (أ) على شريحة المجهر والزجاج.
  7. قطع الجذعية جزءا لا يتجزأ من الاغاروز الى ثلاث قطع متساوية تقريبا من 1.2 سم في الطول. قطع جزء من الجذع الذي لم يكن في الاغاروز وتخلص منه.
    1. تخزين هذه القطع من الاغاروز مع جزءا لا يتجزأ من ينبع في محكم 2 مل أنابيب microcentrifuge في مربع الظلام في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للمقطع. بدلا من ذلك، تخزين الأنابيب في 4 درجات مئوية لمدة أقصاها أسبوع واحد. ملاحظة: التخزين هو ممكن، ولكن المجرب يحتاج إلى أن يكون على علم بأن جزءا لا يتجزأ من ينبع لا تزال على قيد الحياة، واعتمادا على التجربة، يحتمل أن يكون عرض الأعمال الفنية.

2. الجذعية باجتزاء

  1. تنبيه: قراءة دليل vibratome بعناية واتباع جميع تعليمات السلامة.
  2. تأكد من أن القرص العينة نظيفة وجافة تماما (خالية من أي مادة صلبة أو سائلة). تنظيف القرص عينة بشفرة حلاقة لإزالة أي الغراء المتبقي من التجارب السابقة ويغسل بالماء. ثم تجف مع منشفة ورقية. ملاحظة: هذا سوف يضمن أن يعمل بشكل جيد لاصقة ويربط العينة الاغاروز. إذا لم تتم هذه الخطوة بشكل صحيح، فمن الممكن أن العينة قد لا تلتزم القرص، وسوف يتسبب في وقت لاحق العينة أن تسقط القرص خلال باجتزاء.
    1. مناديل استخدام ورقة ناعمة لإزالة أي الرطوبة من كتلة agarose تحتوي على العينات.
    2. وضع قطرة صغيرة من الأنسجة لاصقة على القرص العينة. خط من لاصق لتغطية المنطقة في منتصف لوحة باستخدام غيض من زجاجة لاصقة. المكان بسرعةكتلة agarose بحيث العينات إما عمودية أو بالتوازي مع لوحة لمدة طولية أو مستعرضة المقاطع العرضية، على التوالي. السماح لاصقة لإصلاح العينة إلى القرص العينة في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية لمدة 10-30 دقيقة. ملاحظة: هذه خطوة حساسة للوقت.
  3. إصلاح القرص العينة في مكان على صينية عازلة أو الحوض الصغير. وينبغي أن تكون كتلة / ث من الاغاروز مع أقسام بالتوازي مع شفرة حلاقة. ملء علبة عازلة مع الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة حتى يتم المغمورة العينات تماما.
  4. قطع شفرة حلاقة في نصف ثم رتبت النهاية مع مقص قوي بحيث يبقى شفرة مسطحة تماما. نعلق نصف شفرة حلاقة قبل القطع على حامل السكين.
    1. تعيين زاوية على حامل السكين إلى 84 درجة، وسرعة إلى 0.90 ملم / ثانية (8 الموقف على vibratome) وتردد إلى 50 هرتز (5 موقف على vibratome). قطع أجزاء من سمك 100 ميكرون. استخدام الوضع المستمر. NOTE: تم اختيار هذا سمك لضمان أن الأنسجة يمكن أن تصمد أمام مختلف العلاجات حمض وقاعدة تستخدم في بعض البروتوكولات تلطيخ. تعيين نافذة لباجتزاء والسماح 15-20 دقيقة على الوضع المستمر لvibratome إلى القسم كتلة الاغاروز حوالي 1.2 سم.
  5. جمع الأقسام باستخدام ماصة البلاستيكية خلال باجتزاء في علبة عازلة. بدلا من ذلك، يمكن نقل أقسام من علبة عازلة في كوب زجاجي ثم إلى لوحة بيتري واضحة. نقل المقاطع القليلة لأنابيب microcentrifuge 2.0 مل. ملاحظة: يتم جمع عينات من لوحة بيتري لأنه من الأسهل لمشاهدة المقاطع على خلفية واضحة، ولأن علبة عازلة يمكن معبي للعينة القادمة.
  6. ويمكن تخزين المقاطع في أنبوب 50 مل أو جمعها وتخزينها في 1،5-2 مل أنابيب microcentrifuge في 4 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة. ملاحظة: تخزين المقاطع لفترات أطول وسوف يؤدي ذلك إلى ضعف جودة الصورة.

3. مجهر الكاميرا وإعدادات التصوير

  1. ضبط الإضاءة كوهلر على المجهر. اختيار الهدف. التركيز على العينة الأولى. جلب شدة الضوء إلى نصف أو أقل. إغلاق الحجاب الحاجز الحقل (FD) والفتحة (ا ف ب) أو إحضاره إلى أدنى الإعداد ممكن على هذا الهدف بالذات.
    1. وارتفاع التكبير، أكبر عصابة سيكون. استخدام مكثف التركيز مقبض الباب للتركيز القزحية الملعب بشكل حاد ممكن.
    2. جلب ببطء صورة القزحية الميدانية (على شكل مسدس حلقة صغيرة) إلى المركز باستخدام المقابض المكثف-توسيط (مسامير على شكل دبوس المحيطة المكثف). زيادة ببطء الحجاب الحاجز (FD) بحيث القزحية الحقل يصل إلى الحافة. وقف زيادة FD بعد القزحية مجال اجتاز الحافة.
    3. زيادة ببطء الفتحة (AP) لضبط التباين. ضبط شدة الضوء كما هو مطلوب. ملاحظة: كوهلر الإضاءة يحتاج إلى تعديل لكل سbjective، كل يوم التجريبية. نلاحظ الأرقام التي تم الحصول عليها بعد التعديل لهذا اليوم. وسيعاد استخدام هذه الأرقام في كل مرة أن يتم تبديل أهداف ذهابا وإيابا لهذا اليوم بالذات.
  2. ضبط الفتحة، وكثافة، وقت التعرض، وزيادة، والمرشحات كما هو موضح في الجدول رقم 1. ينبغي أن تستخدم هذه المعلومات فقط كدليل.
  3. استخدام كاميرا رقمية عالية الدقة مع كبير تنسيق الناقلات CCD رقاقة مع عدم وجود مفتاح ميكانيكي لالتقاط الصور مضان؛ وعالية الدقة، وكاميرا عالية السرعة للصور مشرق الميدان.
  4. معالجة الشرائح باستخدام البرمجيات القياسية. تحميل البرنامج. انقر على "اكتساب" و "مجموعة الكاميرا / المجلس"، ثم حدد الكاميرا لاستخدامها. انقر على زر "موافق". انقر على "الحصول على" تليها "علامة التبويب اللون." تحت "علامة التبويب اللون،" اختيار "طريقة باير"، يليه "متوسط ​​أربعة." إضافة المكسب اقترح (الأحمر والأخضر والأزرق) جيئة وذهابام الجدول 1. حدد "تعيين انقاذ" علامة التبويب وانقر على الدليل حيث الصور هي ليتم تخزينها. تعيين "زمن التعرض" من الاقتراحات في الجدول 1. تعيين "Binning" في "1" و "binning لايف" في "1". التركيز على المنطقة من اهتمام وثم انقر على "حفظ العيش".
  5. الصور الإخراج على برنامج الكاميرا هي في شكل "TIF". تحليل الصور لالكيمياء النسيجية من أنواع الخلايا. استخدام برامج الكمبيوتر القياسية للاستخدامات المصب من العرض والنشر.

4. الأشعة فوق البنفسجية ومشرق الميدان التصوير

  1. استخدام ماصة 1 مل مع قطع ماصة الحافة بحيث أقسام يمكن pipetted بسهولة. أقسام بلطف ماصة في تلميح وعلى لشريحة المجهر. تغطية الأجزاء مع انزلاق الغطاء. مراقبة أقسام تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية أو الإضاءة مشرق الميدان.

5. فلوروغلوسين-حمض الهيدروكلوريك (يزنر) يلطخ 12

  1. حل 0.3 غرام من فلوروغلوسين في 10 مل من الإيثانول المطلق لإعداد حل فلوروغلوسين 3٪. مزج حجم واحد من حمض الهيدروكلوريك المركز (37 N) لمجلدين من 3٪ فلوروغلوسين في الإيثانول؛ هذا الحل هو فلوروغلوسين، حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة) أو يزنر وصمة عار. ملاحظة: هذا الحل يجب أن يصدر الطازجة في اليوم من تلطيخ ولا يمكن تخزينها، لأن الحل سوف تتحلل بمرور الوقت وسوف تصبح غير فعالة تلطيخ. تنبيه: حمض الهيدروكلوريك هي ضارة للغاية، لذلك توخي الحذر الشديد أثناء التعامل مع وصمة عار فتاه حمض الهيدروكلوريك.
  2. نقل أقسام الجذعية إلى أنبوب 2.0 مل ميكروسنتريفوج. إضافة 1 مل من محلول حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة إلى الأنبوب الذي يحتوي على أقسام والأنكى من ذلك على الفور لأن حمض الهيدروكلوريك في وصمة عار فتاه حمض الهيدروكلوريك هي ضارة للغاية. بلطف تحريك أنبوب للتأكد من أن جميع أقسام هي ملطخة. بديل لهذه الخطوة هو الحفاظ على غطاء أنبوب مفتوحة بحيث يمكن pipetted الحل فتاه حمض الهيدروكلوريك صعودا وهبوطا، ويفضل أن يكون من دون إزعاج ثانيةستعقد. ملاحظة: يجب الحرص على عدم ماصة الأقسام في تلميح ماصة، لأن هذا قد يؤدي إلى تلف تلك المقاطع.
    1. استخدام ماصة 1 مل مع قطع ماصة طرف في مثل هذه الطريقة التي المقاطع يمكن pipetted بسهولة من دون وقوع خسائر. ماصة بلطف أقسام في تلميح وعلى شريحة المجهر. تغطية أقسام مع غطاء قابل للانزلاق. مراقبة أقسام تحت الإضاءة مشرق الميدان. ملاحظة: الحل فتاه حمض الهيدروكلوريك يجف في 5-10 دقيقة، مما تسبب في تدهور العينات. وبالتالي، فإن التصوير لديه أن تكتمل في غضون تلك الفترة من الزمن.

6. MAULE تلطيخ 13،14

  1. حل 0.2 غرام من برمنجنات البوتاسيوم في 40 مل من الماء المقطر لإعداد 0.5٪ محلول برمنجنات البوتاسيوم. تخزين في زجاجة داكنة في درجة حرارة الغرفة لمدة أقصاها 7 أيام.
    1. يعد حمض الهيدروكلوريك حل 3.7٪ وذلك بإضافة 1 مل حمض الهيدروكلوريك تتركز (37 N) إلى 9 مل من الماء المقطر (1:10). إعداد 3.7٪ محلول حمض الهيدروكلوريك جديدة علىيوم من التجربة. تأكد من أن الحل الأسهم 37 N حمض الهيدروكلوريك المستخدمة ليست قديمة جدا. يجب أن يتم تخزين تتركز محلول هيدروكسيد الأمونيوم (14.8 م) في 4 درجات مئوية لمنع المولية للمحلول مشبع من التناقص.
  2. نقل أقسام الجذعية إلى أنبوب 2.0 مل ميكروسنتريفوج. إضافة 1 مل من 0.5٪ في محلول برمنجنات البوتاسيوم إلى الأنبوب الذي يحتوي على أقسام.
    1. ماصة 0.5٪ في محلول برمنجنات البوتاسيوم بلطف صعودا ونزولا، ويفضل من دون إزعاج أقسام. احتضان لمدة 2 دقيقة وتكرار pipetting ل. السماح للأنبوب microcentrifuge الوقوف حتى تسوية جميع الأقسام أسفل. ملاحظة: يجب الحرص على عدم ماصة الأقسام في تلميح ماصة كما المقاطع قد تحصل على تضررت. قد يكون من الصعب أن نرى الأقسام الجذعية باعتبارها الحل هو الظلام، حتى تبقى الأنبوب مع الأقسام في أنبوب اختبار رف والسماح لهم لتسوية لمدة 2 دقيقة.
    2. باستخدام ماصة 1 مل، استخلاص 700 ميكرولتر من 0.5٪ محلول برمنجنات البوتاسيوم.إضافة 700 ميكرولتر من الماء المقطر لشطف خارج محلول برمنجنات البوتاسيوم. تكرار 3-4x أو حتى الحل يبقى الماء واضحة.
    3. تجاهل المياه. بسرعة إضافة 1 مل من حمض الهيدروكلوريك 3٪ حتى تبرأ اللون البني العميق من الأقسام. هذا قد يحدث في غضون 3-5 دقائق أو قد تتطلب يغسل 2 من 5 دقائق لكل منهما. ماصة من كل 3٪ حمض الهيدروكلوريك حل والشروع فورا في الخطوة التالية.
    4. إضافة 1 مل من محلول هيدروكسيد الأمونيوم المركزة. استخدام ماصة 1 مل مع قطع طرف في مثل هذه الطريقة التي المقاطع يمكن pipetted بسهولة من دون وقوع خسائر. ماصة بلطف أقسام في تلميح وعلى شريحة المجهر. تغطية الأجزاء مع ساترة. مراقبة أقسام تحت الإضاءة مشرق الميدان. تنبيه: لأن هيدروكسيد الأمونيوم هو تآكل للغاية، فإنه يتطلب المزيد من الحيطة والانتباه لتجنب التسبب في تآكل إلى مرحلة المجهر أو العدسة. ملاحظة: يمكن للأبخرة هيدروكسيد الأمونيوم الضباب ساترة، مما يجعل من الصعب مراقبة عينة. لذا كن حذرا اضافية قبل إضافة ساترة. الحل يجف في 5-10 دقيقة، وبالتالي فإن التصوير لديه أن تكتمل في غضون تلك الفترة من الزمن.

7. الكونغو الأحمر يلطخ 11،15

  1. حل 0.5 غرام الكونغو الحمراء في 100 مل من الماء المقطر لإعداد 0.5٪ محلول الأحمر في جمهورية الكونغو.
  2. نقل أقسام الجذعية إلى أنبوب 2.0 مل ميكروسنتريفوج. إضافة 1 مل من 0.5٪ الحل الأحمر في جمهورية الكونغو إلى الأنبوب. ماصة بلطف 0.5٪ الحل الأحمر في جمهورية الكونغو صعودا وهبوطا دون إزعاج أقسام. ملاحظة: يجب الحرص على عدم ماصة الأقسام في تلميح ماصة لأن هذا قد يؤدي إلى تلف أجزاء.
    1. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة، وتكرار pipetting ل. يتبع مع 3 دقيقة أخرى من الحضانة في درجة حرارة الغرفة.
    2. استخدام ماصة 1 مل لاستخلاص 700 ميكرولتر من 0.5٪ محلول الأحمر في جمهورية الكونغو. إضافة 700 ميكرولتر من الماء المقطر لشطف من الحل الأحمر في جمهورية الكونغو. تكرار غسل 3-4X حتى حل الغسيلواضح.
    3. استخدام ماصة 1 مل مع قطع طرفها في مثل هذه الطريقة التي المقاطع يمكن pipetted بسهولة من دون وقوع خسائر. ماصة بلطف أقسام في تلميح وعلى شريحة المجهر، وغطاء لهم مع ساترة. مراقبة العينات على شريحة المجهر تحت زرقاء ضوء الإثارة باستخدام فلتر مع ممر الموجة من 560/40. ملاحظة: عدم تخزين المقاطع في الماء لفترة طويلة قبل التحليل المجهري، حيث أن المياه سوف تغسل الكونغو الحمراء في 10-30 دقيقة.

8. Calcofluor الأبيض تلطيخ 9

  1. حل 0.02 غرام من الفلورسنت منير 28 (calcofluor الأبيض M2R) في 10 مل من الماء المقطر لإعداد محلول المخزون 0.2٪. ويمكن تخزين الحل 0.2٪ لمدة ستة أشهر في زجاجة داكنة في 4 درجات مئوية. يعد حل العاملة من 0.02٪ من خلال تمييع 0.2٪ محلول المخزون 10X مع الماء المقطر.
  2. نقل أقسام الجذعية إلى أنبوب 2.0 مل ميكروسنتريفوج. إضافة إلى أنبوب 1 مل من calcof 0.02٪luor حل البيضاء. ماصة بلطف الحل بيضاء 0.02٪ calcofluor صعودا وهبوطا. ملاحظة: يجب الحرص على عدم ماصة الأقسام في تلميح ماصة لأن هذا قد يؤدي إلى تلف أجزاء.
    1. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وتكرار pipetting ل. احتضان قسم للدقيقة 3 أخرى في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: السماح للأقسام ليستقر على الجزء السفلي من الأنبوب لجعله أسهل للماصة من الحل دون الإضرار أقسام.
    2. استخدام ماصة 1 مل لاستخلاص 700 ميكرولتر من 0.02٪ calcofluor حل بيضاء وإضافة 700 ميكرولتر من الماء المقطر؛ الانتظار لمدة 5 دقائق لشطف من الحل calcofluor الأبيض. تكرار غسل 3-4X. استخدام ماصة 1 مل مع قطع ماصة طرف في مثل الطريقة التي المقاطع يمكن pipetted بسهولة من دون وقوع خسائر.
    3. ماصة بلطف أقسام في تلميح وعلى شريحة المجهر وغطاء لهم مع ساترة. مراقبة أقسام تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

9. طولويدين بلوه يا تلطيخ 16،17

  1. حل ز 0.02 طولويدين يا زرقاء في 100 مل من الماء المقطر لإعداد محلول 0.02٪. ملاحظة: يمكن تخزين الحل يا الأزرق طولويدين لمدة أسبوعين في زجاجة داكنة في درجة حرارة الغرفة.
  2. نقل أقسام الجذعية إلى أنبوب 2.0 مل ميكروسنتريفوج. إضافة 1 مل من 0.02٪ طولويدين يا زرقاء حل للأنبوب. ماصة بلطف 0.02٪ طولويدين الحل يا الأزرق صعودا وهبوطا. ثم يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وتكرار pipetting لمرة واحدة. ملاحظة: يجب الحرص على عدم ماصة الأقسام في تلميح ماصة لأن هذا قد يؤدي إلى تلف أجزاء. السماح للأنبوب microcentrifuge نقف مكتوفي الأيدي حتى يستقر الأقسام أسفل. وهذا قد يكون من الصعب أن نرى، والحل هو الظلام، حتى تبقى الأنبوب الذي يحتوي على أقسام على أنبوب اختبار رف والسماح لهم لتسوية لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    1. استخدام ماصة 1 مل لاستخلاص 700 ميكرولتر من 0.02٪ طولويدين الحل يا الأزرق. إضافة 700 ميكرولتر من الماء المقطر لشطف خارج طولويدين الأزرق يا سولution. تكرار 3-4x أو حتى حل يغسل واضح. استخدام ماصة 1 مل مع قطع ماصة طرف في مثل هذه الطريقة التي المقاطع يمكن pipetted بها بسهولة دون تعرضها للتلف.
    2. ماصة بلطف أقسام في تلميح وعلى شريحة المجهر وغطاء لهم مع ساترة. مراقبة أقسام تحت الإضاءة مشرق الميدان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقف تضمين وباجتزاء:
استخدام قالب من البلاستيك محلية الصنع لتضمين ينبع في 7٪ الاغاروز ثبت أن تكون سريعة وسهلة (الشكل 1). شطري (A و B؛ الشكل 1) من النظام قارورة جزءا لا يتجزأ من جعلها بسيطة لاطلاق سراح بسهولة الجذعية جزءا لا يتجزأ من الاغاروز كما الاغاروز لا التمسك أجزاء القارورة التي هي خاملة، والحفاظ على نظام نظيفة. قارورة يمكن إعادة استخدامها عدة مرات لسنوات. راحة تخزين الجذعية جزءا لا يتجزأ أيضا يجعل الخطوات المقبلة أسهل. من أجل إنقاذ في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وتستخدم على نطاق واسع أقسام الجذعية A. thaliana لدراسة تنظيم الخلايا في جدار الخلية والثانوية لدراسة نوعيا الاختلافات بين نوع البرية والنباتات المعدلة وراثيا. التقنيات المستخدمة عادة لباجتزاء العينات هي قطع اليد المباشر؛ أو عندما هي جزء لا يتجزأ العينات في الاغاروز أو تثبيتي، باجتزاء يمكن القيام به مع vibratome أو مبضع للفحص المجهري. وعلى النقيض من القطع من جهة، ومشاركة اثنين تسمح الحد من مخاطر ينتج عنها اختلافات دقيقة بين العينات التي من شأنها أن يكون سبب ذلك ببساطة عن ط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي صراعات مالية للكشف عنها.

شكر وتقدير

نحن ممتنون لسابين رسل للمساعدة التحرير. وكان هذا العمل جزءا من معهد الطاقة الحيوية المشتركة وزارة الطاقة (http://www.jbei.org) بدعم من وزارة الطاقة الأميركية، مكتب العلوم ومكتب بحوث البيولوجية والبيئية، من خلال عقد DE-AC02-05CH11231 بين لورانس بيركلي مختبر الوطني ووزارة الطاقة الأميركية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AgaroseEMDMERC2125رقم CAS: 9012-36-6
PhloroglucinolSigmaP 35021،3،5-trihydroxybenzene [رقم CAS: 108-73-6]
حمض الهيدروكلوريكEMDHX0603-75رقم CAS: 7647-01-0
هيدروكسيد الأمونيومEMDAX1303-6رقم CAS: 1336-21-6
توليدين بلو أوسيجماT3260كلوريد بلوتين, كلوريد التلونيوم [رقم سجل المستخلصات الكيميائية 92-31-9] 
برمنجنات البوتاسيومسيجما223468رقم سجل المستخلصات الكيميائية 7722-64-7 
الإيثانول 190 دليلKOPTECV1401رقم CAS: 64-17-5
الكونغو الأحمرسيجما  C6277ثنائي الصوديوم 3،3'- [[1،1'-ثنائي الفينيل] -4،4'-diylbis (azo)] مكرر (4-أمينوأفثالين 1-سلفونات) [رقم سجل المستخلصات الكيميائية 573-58-0]
منير الفلورسنت 28 / كالكوفلور صبغة بيضاءSigmaF3543   ؛4،4'-مكرر [[4-[مكرر (2-هيدروكسي إيثيل) أمينو] -6-أنيلينو-1،3،5-تريازين-2-يل] أمينو] ستيلبين -2،2 '-حمض ديسولفونيك [رقم سجل المستخلصات الكيميائي 4404-43-7] 
VibratomeLeicaLeica تهتز شفرة microtome VT1000Shttp://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
RazorAmerican Safety الحلاقة شركة البند# 60-0139-0000 شفرة مزدوجة الحواف من الفولاذ المقاوم للصدأ (Personna Super)
الطرد المركزي الدقيقة ذات الغطاء اللولبي (2 مل) VWR16466-044
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (0.6 مل)Axygen ScientificMCT-060-C
MittBel-Art380000000SCIENCEWARE  حامي اليد الساخنة ميت
لاصق المناديلاللاصقة تيد بيلا10033مخزن في 4 درجات ؛ C أو 20 درجة ؛ C لمدة 3 أشهر أو أكثر تخزين
ميكروويفباناسونيكNN-SD762SPELCO Pro CA 44 لاصق مناديل فوري   ؛
كاميرا مع رقاقة CCD مع عدم وجود مصراع ميكانيكي كاميرا ملونة عالية السرعة HamamatsuC4742-95
   QImagingMicroPublisher 5.0 RTV
كاميرا البرمجيات   الأجهزة الجزيئيةMetaMorph الإصدار 7.7.0.0
تخيل التحليل أدوبي فوتوشوب CS4
ذات غطاء صغير ، مربعة ، رقم 1VWR48366-06722 × 22 مم (7/8 × 7/8 بوصة) - نظارات الغطاء مقاومة للتآكل وسميكة ومسطحة بشكل موحد. السماكة رقم 1 من 0.13 إلى 0.17 مم.
مايكرو بلوري ، 1 ممVWR48312-00375 × 25 مم - 1 مم
تغليف بارافيلم MAlcanBRNDPM998
TX2 مكعب مرشحLeica11513851 / 11513885مرشح يستخدم لتحليل الكونغو الأحمر مع تمرير نطاق 560/40.
أنابيب نظارات شرائح

المراجع

  1. Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
  2. Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
  3. Humphreys, J. M., Chapple, C. Rewriting the lignin roadmap. Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).
  4. Adler, E. Lignin chemistry—past, present and future. Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).
  5. Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
  6. Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
  7. Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
  8. Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
  9. Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
  10. Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
  11. Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
  12. Liljegren, S. Phloroglucinol Stain for Lignin. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  13. Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
  14. Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
  15. Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
  16. Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
  17. Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
  18. Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
  19. Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
  20. Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
  21. Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
  22. Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

O MALS
تلطيخ النسيجية من
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.