التصوير مسح النظم البيولوجية السليمة على المستوى الخلوي عن طريق 3DISCO

ملخص

للحصول على صور عالية الدقة للخلايا المصنفة بالفلورسنت داخل الأنسجة الكبيرة ، من الناحية المثالية ، يجب تصوير العينات البيولوجية دون تقسيم. 3DISCO هو إجراء مباشر لإزالة الأنسجة يعتمد على الحضانة المتسلسلة بالمذيبات العضوية. عند التنظيف ، تصبح الأعضاء شفافة مما يسمح بإجراء مسح ليزر شامل للعينة.

الملخص

يعد تطهير الأنسجة والتصوير اللاحق للأعضاء الشفافة طريقة قوية لتحليل الخلايا والجزيئات ذات العلامات الفلورية في 3D ، في الأعضاء السليمة. على عكس الطرق النسيجية التقليدية ، حيث يتم تقسيم الأنسجة ذات الأهمية للتصوير الفلوري ، يسمح التصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة التي تم تطهيرها بفحص الخلايا والجزيئات المصنفة في العينة بأكملها. تحقيقا لهذه الغاية ، يجب جعل الأنسجة غير الشفافة بصريا شفافة من خلال مطابقة المؤشرات المقاومة للحرارة في جميع أنحاء الأنسجة. بعد ذلك ، يمكن تصوير الأنسجة في وقت واحد باستخدام مجاهر المسح بالليزر للحصول على صورة ثلاثية الأبعاد كاملة عالية الدقة للعينة. توفر قائمة متزايدة من بروتوكولات إزالة الأنسجة بما في ذلك 3DISCO و CLARITY و Sca / e و ClearT2 و SeeDB طرقا جديدة للباحثين لتصوير أنسجتهم التي تهمهم ككل. من بينها ، 3DISCO هي طريقة قابلة للتكرار ومباشرة بدرجة كبيرة ، والتي يمكنها تنظيف أنواع مختلفة من الأنسجة ويمكن استخدامها مع تقنيات الفحص المجهري المختلفة. يصف هذا البروتوكول هذا الإجراء المباشر ويعرض تطبيقاته المختلفة. كما يناقش القيود والصعوبات المحتملة وكيفية التغلب عليها.

المقدمة

الفحص النسيجي من الأنسجة البيولوجية هو نهج أساسي في فهم طبيعة الجزيئات / الخلايا في سياقها الطبيعي. من الناحية المثالية، التصوير ذات الدقة العالية للجهاز بأكمله هو أكبر قدر من المعلومات والمطلوب. لأن الضوء لديه عمق الاختراق محدودة، وذلك بسبب تناثر ^1، الأجهزة الثابتة يجب أن تكون مقطوع من أجل أداء عالية الدقة التصوير المجهري. وبالتالي، فإن معظم الدراسات التي أجريت على الأنسجة وقليل من أقسام الأنسجة تمثل سوى جزء صغير من الجهاز. في بعض الدراسات، على سبيل المثال، تلك التي تهدف إلى تعقب من الوصلات العصبية في الدماغ أو الحبل الشوكي، يتم جمع جميع أقسام الأنسجة من الأعضاء المستهدفة وتصويرها لإعادة الإعمار 3D. ومع ذلك، باجتزاء الأنسجة والتصوير لاحقة من المقاطع الفردية والقيود المختلفة. وتشمل هذه كونها مضيعة للوقت ويؤدي إلى إعادة الإعمار 3D غير مكتملة من الأنسجة، وذلك بسبب التشوهات الميكانيكية وصعبةالمنشأ في محاذاة الصور الناتجة.

في الآونة الأخيرة، وقد تم تطوير أجهزة التصوير المقاصة وشفافة سليمة كحل كبيرة لهذا القصور ^2،3. على تبادل المعلومات، يتم تقديم الجهاز بأكمله شفافة تسمح للضوء التصوير في السفر نهاية إلى نهاية (الشكل 1) لإنتاج صور عالية الدقة من الجهاز unsectioned باستخدام مجهر المسح الضوئي ليزر مثل الفوتون أو ورقة خفيفة متعددة المجهر ( الشكل 2). وقد وضعت مجموعات بحثية مختلفة بروتوكولات تبادل المعلومات أنسجة جديدة لتكون قادرة على الصورة أنسجتهم من الفائدة لأغراض مختلفة. وتشمل هذه المذيبات العضوية ^{2-5، 6،7} المياه ومقرها الكهربائي ⁸ بروتوكولات تبادل المعلومات. فيما بينها، والتصوير 3 الأبعاد للمسح المذيبات أو أجهزة 3DISCO هو بروتوكول للتطبيق بسهولة على مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية بما في ذلك الجهاز العصبي المركزي (CNS) أجهزة وأجهزة المناعة والأورام الصلبة. في additأيون، فإنه يمكن الجمع بين تقنيات الفحص المجهري مختلفة مثل المجهر الضوئي ورقة مضان (LSFM)، متعددة الفوتون ومتحد البؤر المسح الضوئي ليزر المجهري. ويستند 3DISCO تنقية مع الكواشف متوفرة وغير مكلفة مثل رباعي هيدرو الفوران (THF) والأثير dibenzyl (DBE) ^4. بروتوكول كامل يمكن أن يستغرق قصيرة قدر 3-4 ساعة. وبالتالي، 3DISCO هي تقنية قوية وسريعة بالمقارنة مع الطرق التقليدية النسيجية التي قد تستغرق أسابيع أو شهور لإكمال ^9.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للIACUC (اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام) اللوائح على الفئران القديمة ~ 3-5 أشهر. يعلن المؤلف لا المصالح المالية المتنافسة.

1. الإرواء الحيوانية وإعداد الأنسجة

توقيت: 30-60 دقيقة لكل الماوس + تثبيت آخر (بضع ساعات ليلة وضحاها).

1. وزن الحيوان وتخدير باستخدام الكيتامين (80-200 ملغ / كلغ) وزيلازين (7-20 ملغ / كلغ) أو 2.5٪ AVERTIN (0.5 غرام من وزن الجسم ml/25 IP).
2. انتظر بضع دقائق للتخدير نافذة المفعول كاملة.
3. قرصة أخمص القدمين، وذيل الحيوان للتأكد من أن الحيوان هو تخدير كامل.
4. يروي أول حيوان في RT مع 0.1 M الفوسفات العازلة (PB) أو 0.1 M الفوسفات العازلة المالحة (PBS) لمدة 5-10 دقيقة حتى تتم إزالة الدم تماما من الأنسجة.
5. تبديل نضح إلى حل تثبيتي: PFA 4٪ في 0.1 م PB (أو 0.1 M PBS) ومواصلة الترويةمع PFA 4٪ لمدة 30-40 دقيقة بسرعة 3 مل / دقيقة.
6. تشريح الجهاز / ث الاهتمام بعناية دون الإضرار، على سبيل المثال، وتجنب ثقب والضغط على الأنسجة التي يتم تشريح.
7. إزالة الأنسجة المحيطة اضافية الأجهزة (النسيج الضام، السحايا أو المسألة الجافية) في طبق بتري مليئة برنامج تلفزيوني.
8. بعد إصلاح الأجهزة في PFA 4٪ لبضع ساعة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. تجنب طويلة آخر التثبيت بسبب PFA قد يطفئ إشارة أو زيادة الوقت بدل الضائع autofluorecense ¹⁰ وخاصة بالنسبة للقناة GFP (التي هي مشكلة أقل في القنوات أحمر أحمر والأبعد).
9. غسل الأجهزة 2-3X مع برنامج تلفزيوني في RT فقط قبل البدء في إجراء المقاصة.

2. المقاصة الأنسجة

توقيت: 2-3 ساعة للأجهزة الصغيرة و1-4 أيام للأجهزة الكبيرة.

ملاحظات: وضع العلامات الفلورية للأنسجة عن طريق التحوير التعبير، ترنسفكأيشن الفيروسية، وتتبع صبغ أو المضادةينبغي أن يستكمل وضع العلامات الجسم قبل التطهير. يتم تنفيذ جميع الخطوات المقاصة الأنسجة في RT. الحلول المقاصة THF، قسم تعزيز الحدود، BABB (1 جزء البنزيل الكحول و 2 جزء بنزوات البنزيل) وثنائي كلورو ميثان سامة وينبغي تجنب استنشاق (إجراء التجارب في التهوية بشكل صحيح غطاء الدخان) والاتصال المباشر مع الجلد (قفازات استخدام النتريل).

1. إعداد 50٪ (المجلد / المجلد)، 70٪، و 80٪ التخفيفات THF في الماء المقطر في عبوات زجاجية منفصلة على النحو التالي: 50٪ لTHF، على سبيل المثال، مزج 25 مل THF و25 مل من الماء المقطر في زجاجة مع حجم من أكبر من 50 مل.
2. مزيج الحلول عن طريق هز بلطف الزجاجة ل1-2 دقيقة.
3. تسمية زجاجة بوضوح.
4. آمن إغلاق الزجاجات والحفاظ على حلول العمل في خزانة مظلمة. للحصول على أفضل النتائج، لا تستخدم حلول العمل نفسه أطول من 1-2 أسابيع. لذلك، من أجل الحلول المقاصة باعتبارها أصغر حجم المتاحة لتكون قادرة استخدام الكواشف الأسهم الطازجة.
5. ملء قوارير زجاجية (على سبيل المثال، 2-3 مل) مع الحل المقاصة الأولى، و 50٪ THF، ونقل الأجهزة من برنامج تلفزيوني في قارورة زجاجية لبدء المقاصة.
6. آمن إغلاق قارورة من الزجاج مع الأغطية واستخدام المدورة (على سبيل المثال، وهو النمام عجلة) لاثارة.
7. استخدام رقائق الألومنيوم لتغطية والحفاظ على قارورة زجاجية في الظلام. بدء المدورة لتحريك العينات في قوارير الزجاج للمرة المشار إليه (الجدول 1) بسرعة ثابتة (~ 30 دورة في الدقيقة).
8. إزالة الحل المقاصة وإضافة واحد القادم في البروتوكول عند اكتمال الوقت في الجدول 1.
9. جمع النفايات في حاويات النفايات المقاصة الزجاج التي يتم الاحتفاظ بها في غطاء محرك السيارة.
   كرر الخطوة السابقة لكل حل المقاصة في البروتوكول حتى النهاية. استخدام باستور ماصة جديدة عند إضافة محلول المقاصة جديدة (على سبيل المثال، تغيير من THF إلى DBE).
10. في خطوة المقاصة النهائي مع BABB أو DBE، ومرات الحضانة يمكن تمديدها او ركلات الترجيحortened حتى تصبح العينات شفافة تماما في الضوء المرئي (أو مصفر / شفاف إذا كانت الأنسجة كبيرة جدا مثل الدماغ).
11. الحفاظ على أجهزة مسح في الحل النهائي المقاصة في جميع الأوقات بما في ذلك الخطوات التصوير.

3. إعداد أجهزة مسح للتصوير

توقيت: 5-15 دقيقة.

ملاحظة: صورة أجهزة مسح في أقرب وقت يتم التوصل إلى المقاصة كاملة. تحقيقا لهذه الغاية، اتبع الخطوات التالية لإعداد العينات للفحص المجهري ورقة خفيفة (على سبيل المثال، فحص بالمجهر الفائق) أو متحد البؤر / متعددة الفوتون التصوير المجهري.

ملاحظة: سوف تفقد قوة أجهزة مسح مضان على مر الزمن (البروتينات الفلورية وخصوصا على سبيل المثال، GFP؛ وضع العلامات الأجسام المضادة هي أكثر مقاومة، وربما حتى تعطي نتائج أفضل مع حضانات أطول). للتصوير، ومختلف تقنيات المجهر الفلورسنت يمكن استخدامها طالما التعامل السليم مع الأجهزة في الحريهويتحقق الحل الحلبة.

1. لورقة ضوء المجهر
   1. وضع أو تركيب العينة بشكل مناسب.
   2. إصلاح الجهاز تطهيرها من خلال تحويل المسمار من صاحب العينة ⁴ يدويا.
   3. تراجع العينة إلى غرفة التصوير (ويفضل المصنوعة من الزجاج) المجهر ورقة thelight مليء BABB أو DBE، أيهما كان يستخدم في خطوة المقاصة النهائي.
2. متعددة الفوتون / متحد البؤر المجهري
   1. جبل العينة على الشريحة التصوير (أو غرفة التصوير) مع الحل النهائي التصوير لتكون قادرة على الصورة مع الفوتون متعددة أو المجهري متحد البؤر، والتي تستخدم عادة النفط أو الأهداف المياه مغمورة.
   2. استخدام الاسمنت الأسنان لجعل الحدود في جميع أنحاء الأنسجة.
   3. ملء حوض السباحة مع BABB أو DBE قبل يحصل الاسمنت الأسنان جامدة تماما.
      ملاحظة: يتصلب الاسمنت الأسنان بسرعة؛ ممارسة عدة مرات للحصول على دراية به قبل محاولة عينات الفعلية.
   4. وضع على الفورمسح العينة في منتصف حمام السباحة وتغطية ذلك مع غطاء زجاجي.
   5. اضغط على غطاء زجاجي حتى يتم مختومة تماما من الاسمنت الأسنان واللمسات على سطح الجهاز مسح، الأمر الذي سيتيح الوصول إلى عمق التصوير القصوى التي كتبها متحد البؤر / متعدد الفوتون المجهري.
      ملاحظات: هذا يضمن أنه لا يوجد حل المقاصة سيسفك أثناء التصوير. تجنب غمس عدسة التصوير مباشرة في حل المقاصة، والتي يمكن أن تضر العدسة ما لم تكن مقاومة للBABB / قسم تعزيز الحدود أو لديه الغطاء الواقي.

أجهزة 4. التصوير مسح

توقيت: 15-45 دقيقة.

1. جمع المسح ض تغطي الأنسجة تطهيرها بالكامل (إذا كان يسمح للعدسة المستخدمة) بأفضل القرار الذي يمكن أن يحقق المجهر.
2. التكبير في المناطق ذات الاهتمام لجمع الصور دقة أعلى.

5. فحص البيانات مع برمجيات أميرة

1. تحميل الصورة السلسلهق لبرنامج أميرة مع وحدة ResolveRT.
2. أدخل أحجام فوكسل الصحيح في "صورة مقروءة معلمة" نافذة واضغط موافق.
3. حدد "متعدد إستواء عرض" التطبيق الفرعي. ثم استخدم "سمك" شريط التمرير لاختيار عتبة المثلى للقيم الرمادية، وتعديل 2D و 3D القيم.
4. تصور عينة من تصفح شرائح مختلفة في التوجهات 2D وباستخدام وحدة المحاصيل الزاوية في عرض 3D.
   ملاحظة: دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها مفصلة للبروتوكول يمكن العثور عليها في إرتورك وآخرون ^4.

النتائج

الخلايا العصبية وخلايا الاستقطاب للغاية مع التشكل طويلة للغاية. وظيفتها يعتمد على الاتصالات التي كانت تشكل بين بعضها البعض ومع الأنسجة الأخرى. وبالتالي، ورسم خرائط التنظيم الهيكلي من الخلايا العصبية مهم للغاية من أجل فهم كيفية عملها في الصحة والمرض. ومع ذلك، تتبع مثل هذه الاتصالات العصبية هائلة في جميع أنحاء بأكمله العصبي connectomics اسمه نظام في الآونة الأخيرة ¹¹ - لا تزال واحدة من أصعب التحديات في علم الأعصاب. تحقيقا لهذه الغاية، وقد بدأت كل من الولايات المتحدة والاتحاد الأوروبي ^{12 13} المشاريع الكبيرة إلى خريطة الدماغ البشري.

بينما 3DISCO يمكن استخدامها على الأجهزة المختلفة، فقد كان مفيدا بشكل خاص لتتبع الوصلات العصبية طويلة في الحبل الشوكي والدماغ. على سبيل المثال، وذلك باستخدام بالاشعة فحص بالمجهر الفائق من شرائح الحبل الشوكي تطهيرها كبيرة، ويمكن أن يتبع اتصالات محور عصبي أكثر من سم في النخاع الشوكي القوارض (الشكل 2). بطريقة مماثلة، كامل الدماغ تطهيرها الماوس (الشكل 3A) وقرن آمون (الشكل 3B) ولا يمكن تصوير لمتابعة الوصلات العصبية في الدماغ.

عند استخدام متحد البؤر أو متعدد الفوتون المجهري على أجهزة مسح والتصوير القرار يمكن تحسينها بشكل كبير، خصوصا في ض البعد. على سبيل المثال، متعددة الفوتون التصوير من النخاع الشوكي تطهيرها من الفئران خط GFP-M (الشكل 4A) يحقق صورة سلس في جميع أنحاء عمق بأكمله (~ 1.5-2 ملم) من الحبل الشوكي. microcopy متحد البؤر على الحبل الشوكي مسح يسلم تحسين القرار بطريقة مماثلة (أرقام 4B و ج). متعددة التصوير الفوتون المجهري من العقول مسح صورا عالية الدقة جدا لتصور التفاصيل الدقيقة من الهياكل العصبية بما في ذلك العمود الفقري شجيري (الشكل 5). العينات ل3DISCO يمكن أن توصف بطرق مختلفة بما في ذلك التحوير التعبير، فيرآل ترنسفكأيشن، تتبع صبغ ووضع العلامات الأجسام المضادة. على سبيل المثال، فمن الممكن لتسمية الأوعية الدموية بأكملها من الدماغ (أرقام 6A وب) والحبل الشوكي (أرقام 6C ود) باستخدام كتين مترافق استشفاف الفلورسنت ^4، والتي يمكن استخدامها لدراسة الدماغ من العوائق الدم (BBB ) في الصحة والمرض.

كلا الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية وتورط للغاية في علم الأمراض من تنكس عصبي بما في ذلك الأمراض الزهايمر والإصابات ^14،15. باستخدام 3DISCO، يمكن دراستها كثافتها وتوزيعها في الحبل الشوكي (الشكل 7) أو الدماغ.

كما يمكن تصوير الأنسجة غير العصبية. على سبيل المثال، خلايا كلارا في الرئتين القوارض بأكمله يمكن immunolabeled مع الأجسام المضادة وتصويرها دون باجتزاء على مستوى خلية واحدة (الشكل 8). وبالمثل، فمن الممكن لمسح الصورة والخلايا مثلاخلايا ألفا في البنكرياس الأنسجة unsectioned (الشكل 9).

الشكل 1. يجعل 3DISCO المقاصة الأنسجة الأنسجة unsectioned شفافة للتصوير الأنسجة العميقة. غير مطهرة (أ) وتطهيرها (ب) أنسجة الحبل الشوكي كما يراها الضوء المرئي. على تبادل المعلومات، ويصبح العميق الأنسجة المسح المجهري بالليزر ممكن. (ج) تم تصوير أنسجة الحبل الشوكي غير مطهرة وتطهيرها بنسبة 2 الفوتون المجهري. أشرطة النطاق في أ، ب = 0.5 مم وج = 100 ميكرون.

الشكل 2. ينقسم 3DISCO تصوير النخاع الشوكي لمتابعة التمديدات محور عصبي الحبل الشوكي تشريح من لدنك-1 GFP المعدلة وراثيا خط الماوس (GFP-M) إلى أجزاء أصغر (~4 ملم). بعد اتباع بروتوكول المقاصة لأنسجة صغيرة (الجدول 1) كانت تصور النخاع الشوكي شفافة باستخدام فحص بالمجهر الفائق. اعادة البناء 3D من 4 مم شريحة الحبل الشوكي ~ في الأفقي (أ)، الاكليلية (ب) وعرض السهمي (ج). (د) تتبع الممثل محاور عصبية (الحمراء) وترد في عرض شفافة الرمادي. (ه) بترف التكبير من المنطقة المشار إليها في الفقرة (د). أشرطة النطاق في أ، ب، ج، د = 0.5 مم وه = 20 ميكرون.

الشكل 3. التصوير 3DISCO من الدماغ والحصين تطهيرها. تم تصوير أمثلة على العقول وتطهيرها الحصين من الفئران GFP-M مع مجهر فائق. تصورات 3D من الدماغ بأكمله (أ) وقرن آمون (ب) مما يدل على الشبكات العصبيةRKS في الأنسجة شفافة تصويرها. أشرطة النطاق في = 2 مم وب = 20 ميكرون.

الشكل 4. المقاصة الأنسجة يعزز القرار التي حصلت عليها ومتعددة الفوتون المجهري متحد البؤر. شفاف شرائح من الحبل الشوكي الفئران GFP-M التقط بواسطة متعدد الفوتون (أ) أو المجهري متحد البؤر (ب، ج). نلاحظ أن يحسن إلى حد كبير بمسح القرار وعمق التصوير الكشف عن هيكل غرامة من المحاور والتشعبات. أشرطة النطاق في = 100 ميكرون وفي ب، ج = 20 ميكرون.

الرقم 5. 3DISCO التصوير من العمود الفقري شجيري. أنسجة المخ شفاف من الفئران GFP-M التقط بواسطة متعدد الفوتون. تصورات 3D من المنطقة الممسوحة ضوئيا القشرة المقدمة في النسخةوجهات نظر تلك الواقعة على الدولة (أ) والأفقي (ب). (ج) ~ 50 ميكرون الإسقاط من المستويات المشار إليها في (أ، ب). (د) التكبير العالية من المنطقة المشار إليها في (ج) مما يدل على التفاصيل الدقيقة من الهياكل العصبية بما في ذلك العمود الفقري شجيري (السهام). أشرطة النطاق في = 50 ميكرون، في ب، ج = 25 ميكرون، في د = 5 ميكرون.

الرقم 6. 3DISCO من الأوعية الدموية. لتسمية الأوعية الدموية في الأجهزة بأكمله، وكان يستخدم كتين-FITC صبغ خلال نضح (قبل المقاصة) كما هو موضح ^16. من الجدير بالذكر الإشارة إلى أن وجدنا أن حقن الوريد الذيل من التتبع يعطي إشارة أفضل على نضح القلب من التتبع. بعد جمع العقول الثابتة والنخاع الشوكي، وأنها أزيلت وطماجد عن طريق فحص بالمجهر الفائق. 3D تصور كامل الأوعية الدموية في الدماغ في الماوس heatmap (أ) ومقياس الرمادية (أ). (ب) 3D التصور من الأوعية الدموية من شريحة الماوس الحبل الشوكي في heatmap (ج) والرمادي النطاق (د). تم إنشاء heatmaps استنادا إلى شدة كتين تلطيخ؛ الزرقاء: كثافة منخفضة (الخلفية) والحمراء: كثافة عالية (الأوعية الدموية). أشرطة النطاق في = 2 مم، ب = 1 مم، وفي ج، د = 250 ميكرون.

الرقم 7. الخلايا الدبقية 3DISCO في أنسجة الجهاز العصبي المركزي تطهيرها. تم تطهير والنخاع الشوكي من الفئران المعدلة وراثيا معربا عن GFP في الخلايا الدبقية الصغيرة TGH (CX3CR1-EGFP) أو الخلايا النجمية تيراغرام نتروز (hGFAP-ECFP) والتقط بواسطة متعدد الفوتون المجهري. ويرد 3D جعل من الخلايا الدبقية الصغيرة كما سطح حجم التصور (أ) وعرض شفافة ( (ج) يتم تقديم أحد الإسقاط الضوئية (~ 50 ميكرون) لإظهار تفاصيل الخلايا الدبقية الصغيرة في النخاع الشوكي. ويرد 3D جعل من الخلايا النجمية كما حجم سطح التصور (أ) و شفافة الرأي (ب). (و) يرد أحد الإسقاط الضوئية (~ 50 ميكرون) لإظهار تفاصيل عن الخلايا النجمية في الحبل الشوكي. أشرطة النطاق في أ، ب، د، ه = 100 ميكرون وج، و = 50 ميكرون.

الرقم 8. 3DISCO من كل جبل الفص الرئة مع تلوين الأجسام المضادة للخلايا كلارا. لكامل جبل تلوين الأجسام المضادة من فصوص الرئة، وperfused عمره 10 أسابيع الفئران BALB / C الإناث من خلال البطين الأيمن مع برنامج تلفزيوني من أجل إزالة الدم من الرئتين. وتضخم الرئتين في وقت لاحق مع PFA 4٪ وثابتة O / N في RT في تثبيتي على الأقل ثلاثة أضعاف حجم اله الأنسجة. اليوم التالي، تم تشطف الرئتين لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني، وكان وضع الفص الأيمن في 5 مل من 1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني عن permeabilization لمدة 48 ساعة أو حتى غرقت الأنسجة. أجريت جميع stainings في 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني تحتوي على 5٪ FBS و 2٪ BSA وكانت يشطف في 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني. تلطيخ مع المضادة للCC10 كان لمدة 72 ساعة في 4 درجات مئوية تليها يغسل واسعة لحوالي 6 ساعة. وقد تحقق وضع العلامات الفلورية من الأجسام المضادة الأولية مع مكافحة الماعز اليكسا فلور-594 الضد الثانوية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية تليها يغسل واسعة لمدة 6 ساعة ليلة وضحاها. في اليوم التالي، تم تطهير فصوص الملون من خلال 50٪، 70٪، و 80٪ THF لمدة 30 دقيقة كل تليها ثلاث غسلات 30 دقيقة في 100٪ THF، تليها 20 دقيقة في DCM، تليها 30 دقيقة في قسم تعزيز الحدود. أشرطة النطاق في أ و ب = 1 مم وج = 100 ميكرون.

شخصية 9. 3DISCO من البنكرياس. بعد نضح من الفئران كما هو موضح أعلاه في البروتوكول، تم تشريح البنكرياس وتطهيرها مع بروتوكول قصيرة. مشتق من مضان ROSA26 LSL tdTomato إعادة التركيب الناجمة عن العلاج تاموكسيفين من الفئران يحمل 200 كيلو بايت BAC التحوير تمتد الماوس الذاتية الجلوكاجون مكان مع CreERT2 إدراجها في ATG من الجلوكاجون. والنصال احتفال بعض الخلايا ألفا الفلورسنت المسمى في جزيرة. أشرطة النطاق في أ، ب، ج = 1 مم ود = 500 ميكرون.

الجدول 1. بروتوكولات تبادل المعلومات الأنسجة لالأنسجة المختلفة. أمثلة من الأنسجة بروتوكولات تبادل المعلومات عن الأنسجة المختلفة. لاحظ أن الوقت المقاصة لكل خطوة يمكن اختصارها أو تمديدها حسب الحاجة لتحسين أداء المقاصة. وزن تقريبي من الأنسجة الصغيرة ~ 20-100 ملغ والدماغ هو ~ 300-500 ملغ.ال تي تي بي :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.

المناقشة

تهدف أساليب المقاصة الأنسجة للحد من تشتت الضوء التصوير عن طريق مطابقة معاملات الانكسار من طبقات الأنسجة المختلفة في أجهزة مسح. ونتيجة لذلك، لا يمكن للضوء التصوير التوغل عميقا في الأنسجة وتحفيز الخلايا المسمى / الجزيئات. وقد اكتسب هذا المفهوم القديم للأنسجة تطهير ¹⁷ الاهتمام المتزايد بعد أول تطبيق لهذه التقنية المتطورة على أدمغة فئران سليمة من قبل Dodt والزملاء ^2. منذ ذلك الحين، هناك قائمة متزايدة بسرعة أساليب جديدة بما في ذلك تبادل المعلومات 3DISCO، هيئة السلع التموينية / ه، ClearT2 والوضوح وSeeDB ^{3،4،7،18-20.} في جوهرها، وأنهم جميعا تهدف إلى جعل أجهزة شفافة للتصوير الأنسجة العميقة من خلال الحفاظ على التسمية الفلورسنت. من بينها، 3DISCO تبرز باعتبارها واحدة من الطرق الأكثر مباشرة وقابلة للتكرار. فهو سريع نسبيا بالمقارنة مع الطرق الأخرى المذكورة أعلاه المقاصة (1-5 أيام مقابل 2-3 أسابيع لأدمغة البالغين، على التوالي) ^21. وقد تم بالفعل النجاحيطبق بالكامل إلى الأجهزة المختلفة مثل المخ والحبل الشوكي، والعقد اللمفاوية والطحال والرئة، والأورام الصلبة، والبنكرياس، والغدد الثديية ^3،4،9. بالإضافة إلى ذلك، العديد من المنشورات من قبل مجموعات بحثية مستقلة استخدمت بالفعل هذه الطريقة للحصول على النتائج التصوير ^22،23. ومع ذلك، يمكن أن تختلف إجراءات المقاصة الأنسجة يكون من المفيد لظروف مختلفة. على سبيل المثال، في حين أن هيئة السلع التموينية / ه وSeeDB قابلة للتطبيق أفضل على الأنسجة الجنينية ^6،7، فهي طرق تبادل المعلومات تعتمد على الماء، والتي يمكن أن يكون أسهل في التعامل معها أثناء التصوير. في المقابل، والوضوح هو أسلوب المقاصة معقدة ومكلفة. ولكن يمكن أن يكون من المفيد في سياق وضع العلامات الضد، وخاصة في الأنسجة الكبيرة مثل الدماغ ^8.

الخطوة الأكثر أهمية للحصول على أفضل النتائج من التصوير 3DISCO هو وضع العلامات الأنسجة، والذي تحقق قبل المقاصة الأنسجة. فمن الضروري أن تبدأ مع أقوى إشارة الفلورسنت ممكن. هذا يمكن به تحقيقها بطرق مختلفة بما في ذلك التعبير المعدلة وراثيا من البروتينات الفلورية والبحث عن المفقودين من قبل الأصباغ الاصطناعية، ترنسفكأيشن الفيروسية أو وضع العلامات الأجسام المضادة. ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن أي إجراء المقاصة سوف يقلل من إشارة الفلورسنت من الأنسجة. وبالتالي، إذا كانت إشارة الفلورسنت ليست قوية بما فيه الكفاية في بداية - أي أنه لا يمكن كشفها بسهولة أمام المقاصة التصوير من الأنسجة مسح سيلقي النتائج السيئة.

هناك بعض القيود المفروضة على تطهير الطرق التي تنتظر التحسينات. وجود قيود أهمية هو أنه منذ الكواشف تطهير تغيير هيكل أجهزة مسح، فإنها لا يمكن أن تستخدم على الأنسجة الحية. وبالتالي، والتجارب مع مثل mEos2 photoactivatable ²⁴ يجب أن يتم تنفيذ قبل تحديد والمقاصة. على المقاصة، فائقة التصوير القرار من إشارة الفلورسنت من البروتينات مشرق وصامد يصبح ذلك ممكنا. بالإضافة إلى ذلك، لأن البروتوكول المقاصة يقلل منكثافة البروتينات الفلورية وأجهزة مسح لا يمكن تخزينها لفترات طويلة. من المهم أن نلاحظ أن بعض الأجهزة من الصعب أن يتم مسح. خصوصا، إذا كانت أجهزة تشريح الاحتفاظ كميات عالية من خلايا الدم (على سبيل المثال، الطحال، الكبد)، فهي صعبة نسبيا لمسح والصورة. بل هو أيضا أكثر صعوبة نسبيا لتحقيق المقاصة كاملة للأنسجة كبيرة، مثل القوارض الكبار الدماغ. مثل هذه الأنسجة قد تحتاج مرات الحضانة لفترة أطول، والتي يمكن، من ناحية أخرى، والحد من إشارة الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك، تطوير أساليب الفحص المجهري يمكن أن صورة أجهزة شفافة كبيرة في آن واحد بدرجة وضوح عالية هو ضرورة انتظار لمعالجتها. آخر قيود هامة لهذه التقنية هي وضع العلامات الأنسجة. في حين أن إشارة قوية الفلورسنت عبر التعبير الجيني أو فيروس مثالية، وليس كل خلية أو جزيء يمكن أن توصف وراثيا أو فيروسي. من ناحية أخرى، ووضع العلامات الضد من الأنسجة سميكة ليس إجراءات واضحة أو حتى لا بوssible في معظم الحالات. قد تحتاج إلى بروتوكولات permeabilization الخاصة ومرات حضانة طويلة (عدة أيام إلى بضعة أسابيع) ^3. من المهم أيضا أن نأخذ في الاعتبار أن الأنسجة يتقلص ~ 20٪ في كل البعد (قياس للأنسجة الحبل الشوكي) بعد تطهير ويرجع ذلك أساسا إلى الجفاف وإزالة الشحميات. يحدث هذا الانكماش ratiometrically وينبغي تصحيحه في الخطوات الكمي. كما لوحظ في النتائج المقدمة، لا تزال هياكل fluorescently المسمى سليمة، وهو مؤشر على سلامة البروتين في أنسجة تطهيرها. بسبب طبيعة مسعور من الأنسجة تطهيرها النهائي، فإنه لا يمكن زيادة ملطخة الأجسام المضادة أو جزءا لا يتجزأ من الحلول التي تحتوي على الماء على سبيل المثال، Focusclear-والذي يستخدم في وضوح أو 80٪ الجلسرين. أخيرا، فإنه يشكل تحديا لتحليل أحجام الساحقة من بيانات التصوير. على سبيل المثال، عندما يتم فحص دماغ الفئران كامل في قرار الخلوية، فإنه سيكون من الصعب جدا تتبع وقياس شارع المطلوبuctures (على سبيل المثال، أو الشبكات العصبية الدبقية) وقارن بين أكثر من عينات مختلفة بطريقة آلية. باختصار، في حين تهدف الباحثين لمعرفة أساليب جديدة المقاصة، ينبغي تحسين مختلف التحديات أعلاه (صعوبة تطهير الأنسجة المختلفة، والتصوير بدقة عالية من مناطق أوسع، وتحليل البيانات المعقدة) في نفس الوقت.

في الختام، الأنسجة وضعت مؤخرا تقنيات المعلومات بما في ذلك 3DISCO، تثبت أن بأناقة التصوير ذات الدقة العالية 3D الأجهزة سليمة هو ممكن الآن. باستخدام هذه الطرق، يمكن للعلماء الحصول على معلومات تشريحية من الخلايا والجزيئات في الجهاز سليمة. هذه الدراسات التصوير 3D الرائدة على أجهزة شفافة مصدر إلهام لعدد متزايد من الباحثين فك التشريحية المعقدة والمنظمات الجزيئي للأنسجة / أجهزة في هيث والمرض.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
على ماوس			) من جاكسون.
		CX3CR1 GFP	من مختبر ليتمان في جامعة نيويورك.
على ماوس			من جاكسون.
بارافورمالديهايد	سيجما	P6148
Na2HPO4	Mallinckrodt	7917-16
NaH2PO4	Mallinckrodt	7892-04
2-2-2 Tribromoethanol	Sigma	T48402
2-Methyl-2-butanol	Sigma	152463	المستخدمة لتحضير محلول أفرتين.
سالين	براون
تتراهيدروفوران	سيجما	186562-12X100ML
ثنائي كلورو ميثان	سيجما	270997-12X100ML
ثنائي بنزيل إيثر	سيجما	سيجما ، 108014-1 كجم
كحول بنزيل	سيجما	305197-100 مل
بنزوات بنزيل	سيجما	B6630-250ML
ليكتين FITC	Sigma	L0401-1MG
مضاد ل CC10	سانتا كروز	SC-9772	0.388888889
هيبارين	APP المستحضرات الصيدلانية	504001	تستخدم في التروية.
قوارير زجاجية	VWR	548-0554
ملقط	FST	11251-10
Mini Rotator	VWR	100498-878
رقائق الألومنيوم	Fisherbrand	01-213-104
100 مل زجاجات تخزين الوسائط	زجاجات Kimax Media	EW-34523-00
مضخة نضح تطور Minipuls مع رأس	مضخة التدفق المتوسط MF4 *Gilson، Inc	F110701 و F117606
الفحص المجهري الشريحة	VWR	48311-703
FastWell	Grace Bio-Labs	FW20
غطاء زلة	Corning	2940-245
طبق بتري زجاجي	Corning Pyrex	3160-101
أسمنت الأسنان	Lang Dental	1223PNK
اختبار بيروكسيد الكم شرائط	سيجما	37206
أميرة مع RT حل وحدة الفحص المجهري	Visage Imaging برنامج		تحليل الصور
Imaris	Bitplane التصوير	برنامج
تحليل الصور ImageJ	المعاهد الوطنية للصحة	مجانا