استجابة المضيف المناعية للإصابة الممرض هو عملية تنظيم محكم. الاستفادة من وجود عديد السكاريد الشحمي الرئة نموذج التعرض في الفئران، وأنه من الممكن إجراء تقييمات عالية الدقة من الآليات المعقدة المرتبطة المرضية المرض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
والاستفادة من البلعوم الإدارة داخل القصبة الهوائية والقصبات PAMP الغسل لتقييم استجابة المضيف المناعية في الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
استجابة المضيف المناعي لمسببات الأمراض هو عملية بيولوجية معقدة. غالبية العاملين في الدراسات المجراة كلاسيكي لتوصيف التفاعلات المضيف الممرض الاستفادة من الحقن داخل الصفاق من البكتيريا أو الممرض حدد المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMPs) في الفئران. في حين أن هذه التقنيات قد أسفرت عن البيانات الهائلة المرتبطة البيولوجيا المرضية الأمراض المعدية، ونماذج حقن داخل الصفاق ليست دائما ملائمة للدراسات التفاعل المضيف الممرض في الرئة. استخدام نموذج التهاب الرئة الحادة في الفئران، فمن الممكن إجراء تحليل عالية الدقة للمضيف الاستجابة المناعية الفطرية باستخدام عديد السكاريد الشحمي (LPS). هنا، نحن تصف الأساليب لإدارة LPS استخدام غير الجراحية الإدارة داخل القصبة الهوائية والبلعوم، ورصد المعلمات السريرية المرتبطة المرضية المرض، والاستفادة من السائل غسل القصبات لتقييم الاستجابة المناعية المضيف. التقنيات التي تم وصفهاقابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة لمجموعة متنوعة من PAMPs ومسببات الأمراض. وبالمثل، مع تعديلات طفيفة، وهذه التقنيات يمكن أن تطبق أيضا في دراسات تقييم التهاب الشعب الهوائية التحسسي والتطبيقات الدوائية.
المقدمة
الالتهابات الرئوية المرتبطة بالأنواع البكتيريا المسببة للأمراض هي سبب شائع للمراضة والوفيات في العالم. وتحديد الآليات التي تدفع استجابة المضيف المناعية لهذه الجراثيم تعزيز تنمية استراتيجيات الوقاية الرواية والعوامل العلاجية التي من شأنها أن تخفف من وقع هذه الالتهابات. الهدف العام للبروتوكول الموصوفة هنا هو توفير للمستخدم مع طريقة مرنة لتقييم الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة للإصابة الممرض باستخدام الممرض المرتبطة نمط الجزيئية (PAMP) كبديل للبكتيريا حية. وقد ركزت معظم الدراسات السابقة تقييم الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة للبكتيريا على نماذج البريتوني بسبب السهولة النسبية التنفيذ. في حين أن هذه النماذج مفيدة للغاية وأدت إلى تقدم كبير في مجال التفاعلات المضيف الممرض والتهاب النظامية، والبيانات الناتجة من هذه النماذج ليست دائما ملائمة للدراسات involviنانوغرام الجهاز التنفسي. هنا، يقترح نموذجا الرئوي التهاب الرئة الحاد كما توسع عملية وذات الصلة سريريا من النماذج الكلاسيكية حقن داخل الصفاق (IP). تقنية المقترح يسمح للتقييم المحلي للاستجابة المناعية الفطرية في نظام الجهاز نموذج محدد.
وقد صممت الطرق الموضحة هنا لتوفير تقنية بسيطة وقوية للسماح للمستخدمين لتقييم الاستجابة المناعية للمضيف LPS، وهو PAMP المشتركة. وتستند طرق على داخل الرغامى (ذلك) من تقطير LPS، والذي يؤدي الى الاستجابة المناعية الفطرية قوية في الرئتين من الفئران ويقلد الكثير من الميزات الفيزيولوجية المرضية التي لوحظت في المرضى من البشر الذين يعانون من التهابات الجهاز التنفسي وإصابة الرئة الحادة 1. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه يتيح للمستخدم لتقييم الاستجابة المناعية المضيف دون عوامل خارجية ومخاوف تتعلق بالسلامة المرتبطة بإجراء الدراسات المجراةاستخدام البكتيريا الحية. وبالمثل، فإن الفم والبلعوم الطريق الادارة انها التعرض الموصوفة في هذا البروتوكول لديه مزايا هامة على التقنيات المستخدمة عادة أخرى، بما في ذلك الأنف (في) الإدارة والإدارة أنه الجراحية. على سبيل المثال، الادارة انها البلعوم يسمح dosaging دقيقة نسبيا وترسب الرئة مقارنة في الإدارة، الذي يعاني عادة من زيادة تقلب ترسب الرئة بسبب فقدان وكلاء في تجويف الأنف والجيوب 2-4. الطريق الادارة انها تلتف هذه التجاويف ويتيح الوصول مباشرة إلى القصبة الهوائية والشعب الهوائية. وبالمثل، فإن النهج الذي الجراحية هو أسلوب الإدارة بشكل ملحوظ أكثر المهووسين ويتطلب التدريب المكثف لإتقان. وتشمل البروتوكولات وصفها هنا أيضا وصفا لتقنيات مشتركة وعلامات بديلة تستخدم لتقييم تطور التهاب وينتهي بروتوكول يصف التقنيات المناسبة لإعداد لوخ ع لتقييم التشريح المرضي. وتركز هذه البروتوكولات على التقليل من عدد من الفئران المطلوبة لكل دراسة من خلال تعظيم البيانات المتولدة من كل حيوان على حدة.
البروتوكولات وصفها مرنة للغاية ويمكن تعديلها بسهولة لتقييم PAMPs مجموعة متنوعة والأضرار المرتبطة أنماط الجزيئية (DAMPs). علاوة على ذلك، مع بضعة تعديلات إضافية، هذه البروتوكولات يمكن أن تطبق أيضا على دراسات تقييم مجرى الهواء حساسية تطور المرض أو التفاعلات المضيف الممرض مع البكتيريا الحية أو الفيروسات أو الفطريات 5-10.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت جميع الدراسات بموجب موافقة لجنة الرعاية المؤسسية والاستخدام (IACUC) لجامعة فرجينيا للتكنولوجيا وفقا للمعاهد الوطنية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. داخل الرغامى (عليه) تلقيح LPS طريق إدارة البلعوم
- تأكد من أن كل حيوان يتم التعرف بشكل فريد باستخدام لكمة الأذن، العلامة الأذن، أو طريقة أخرى وافق مؤسسيا.
- تسجيل وزن الجسم ودرجة حرارة الجسم الأساسية لكل حيوان.
- إعداد الأوراق المالية تعمل من LPS. سوف تتلقى كل الماوس جرعة 50 ميكرولتر من 1 ملغ / كغ LPS في الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS). سوف تتلقى معاملة الحيوانات وهمية جرعة 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X.
- إعداد غرفة المناسبة لإدارة isoflurane وباستخدام طريقة الإسقاط التالية. تختلف المبادئ التوجيهية المؤسسية فيما يتعلق باستخدام isoflurane وكلاء مخدر وغيرها وقبل initiatجي أي دراسات، ينبغي أن الأشخاص الاتصال بقسم مؤسستهم لرعاية الحيوان / رفاهية لضمان استيفاء جميع المبادئ التوجيهية على نحو كاف. إذا الأسلوب انخفاض isoflurane وليس خيارا، وكلاء مخدر الأخرى هي بدائل مقبولة.
- في خزانة السلامة المناسبة، وتطبيق ما يقرب من 3 مل من isoflurane وعلى منشفة ورقية ماصة مطوية ومكان في الجزء السفلي من كوب 500 مل.
- وضع قطعة صغيرة من رقائق الألومنيوم على رأس منشفة ورقية، وتغطي الدورق مع غطاء شفاف.
- إعداد الأدوات والكواشف التي سيتم استخدامها أثناء ذلك التلقيح. ضع الشريط المطاطي من شأنها تأمين الحيوانات يتوجه على الوقوف التنبيب. وهذا الإجراء يتطلب زوج من ملقط على التوالي، وزوج من ملقط الزاوية أو منحنية، وماصة P200 مع نصائح.
- تحميل 50 ميكرولتر من LPS في تلميح ماصة ووضعه في مكان يسهل الوصول إليه بجانب موقف التنبيب.
- تخدير الماوسعن طريق وضع الحيوان في غرفة isoflurane وتغطي وغرفة مع غطاء شفاف. مراقبة أنماط التنفس الحيوان، والتي سوف يكون سريعا وسطحية عندما وضعت لأول مرة في الغرفة. سيتم تخدير الحيوان بما فيه الكفاية عندما تقترب معدلات التنفس التنفس 1/2 ثانية، والتي يتم التوصل عادة في غضون 30 ثانية من وضع في الغرفة. يجب تخدير الماوس كما جاء في بروتوكول الحيوانية المعتمدة باستخدام طريقة انخفاض isoflurane و.
- إزالة الماوس تخدير من غرفة وتعليق الحيوان على الوقوف إلى جانب القواطع التنبيب صدر صفحتها الأولى. تأكد من أن الحيوان هو ضبط النفس بشكل آمن والفم واللسان يمكن الوصول إليها.
- تأمين بلطف اللسان مع ملقط على التوالي. فهم اللسان مع ملقط الزاوية وسحب بلطف عليه للخروج من الفم حتى يشعر مقاومة طفيفة. هذا العمل هو كاف لمنع سان المزمار والوصول إلى القصبة الهوائية.
- مع الاستمرار في عقد اللسان فيموقف الموسعة، إدارة جرعة 50 ميكرولتر من LPS في الجزء الخلفي من الحلق، وتغطي على الفور الخياشيم الحيوان مع إصبع القفاز. سوف LPS تكون مرئية في الجزء الخلفي من الحلق حتى يستنشق الماوس.
- مواصلة لتغطية الأنف وعقد اللسان تمديدها لمدة 5-10 الأنفاس إضافية.
- إزالة الماوس من الوقوف التنبيب ووضع الحيوان مرة أخرى في قفص جديدة حتى يتعافى من التخدير.
- رصد علامات بديلة متوافقة مع تطور المرض. وينبغي رصد وزن الجسم ودرجة حرارة الجسم كل 4-8 ساعة لمدة الدراسة. وبالمثل، وتقييم الخصائص السلوكية والأعراض السريرية يرتبط مع زيادة المراضة.
- لتقييم تطور المرض والفئران الحصاد عند نقطة زمنية محددة عقب التعرض LPS. نموذجية الوقت نقاط للحصاد بعد التعرض LPS تشمل 0، 6، 12، 18، 24، و 48 ساعة. لتقييم الانتعاش والبقاء على قيد الحياة، وتقييم الفئران لمدة 7 دايس بعد التلقيح.
2. المصل والقصبات الغسل الموائع (BALF) جمع
- التضحية الماوس باستخدام أسلوب معتمد مؤسسيا.
- وضع الحيوان على ظهرها وثبته إلى لوحة التشريح، من الناحية المثالية 0.5 في (1.27 سم) في الطول.
- الرطب الماوس كامل مع الايثانول 70٪.
- باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 27 G، إجراء ثقب في القلب قبل اتخاذ أي شقوق. وينبغي أن يكون من الممكن سحب 500-800 ميكرولتر من الدم الكامل من ماوس واحدة.
- إزالة الإبرة من الحقنة ونقل الدم الكامل إلى prelabeled 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. لجمع المصل، والسماح للتخثر الدم الكامل لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بالإضافة إلى جمع مصل، ويمكن أيضا أن يتم تعديل هذا الإجراء من خلال دمج مضاد للتخثر في أنبوب والمحاقن، وقبل جمع الدم كله، لدراسة تعميم الخلايا المناعية.
- جعل شق أفقي وعبور طول التجويف البريتوني وشق عمودي من التجويف البريتوني في الفك السفلي من الماوس.
- باستخدام ملقط، فهم كلا الجانبين من شق وبرفق الجلد بعيدا عن تجاويف البريتوني والصدري الأساسي.
- إجراء شق كبير على طول التجويف البريتوني من الأعضاء التناسلية إلى القص، مع الحرص على تجنب قطع الحجاب الحاجز. تحول بلطف الأمعاء في التجويف البريتوني للسماح بالوصول إلى واحدة من الكليتين.
- قطع الوريد الكلوي مما يؤدي إلى الكلى لتكون بمثابة نقطة الصرف لنضح.
- نيك الحجاب الحاجز باستخدام مقص، مع الحرص على تجنب الرئتين والقلب، لفضح الجانب الأيسر من القلب.
- يدويا يروي القلب باستخدام حقنة 10 مل مع إبرة 27 G والحل برنامج تلفزيوني 1X. تجنب استخدام القوة المفرطة خلال نضح لضمان أن المياه المالحة لا اضطر إلى الرئتين. الدم المتبقية يجب أن تستنزف من شق الوريد البابي.
- قطع بعناية القفص الصدري على طول القص باستخدام كليلة / مقص حادة، مع الحرص على تجنب قطع القلب والرئتين. وقطع بطريق الخطأ الرئتين أثناء هذا الإجراء خفض كبير في كمية BALF جمعها وسوف يؤدي إلى عدم القدرة على تضخيم الرئتين بشكل صحيح مع مثبت.
- بلطف عزل القلب والرئتين بعيدا عن القفص الصدري باستخدام ملقط. قطع بعناية كل قسم من القفص الصدري باستخدام مقص حادة / حادة أقرب إلى العمود الفقري ممكن، وإزالة كل المقاطع بشكل كامل.
- فصل الغدد اللعابية باستخدام ملقط أو إزالتها باستخدام مقص، لفضح القصبة الهوائية.
- قطع بعناية العضلات التي تراكب القصبة الهوائية باستخدام المقص. فمن الضروري أن لا يتم قطع القصبة الهوائية أثناء هذه العملية.
- باستخدام مقص، فصل الترقوة المغطي القصبة الهوائية.
- فهم بلطف الغدة الصعترية باستخدام ملقط ورفع الأنسجة بعيدا عن القلب. إزالة الغدة الصعترية باستخدام مقص، مع الحرص على تجنب قطع القلب أو الرئتين.
- جعل شق أفقي صغير في القصبة الهوائية 1-2 حلقات تحت الحنجرة باستخدام مقص الزاوية (زاوية 45-90 درجة مئوية، حاد / حاد). ينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي لشق تأمين بحزم قنية.
- إدراج قنية بحيث نهاية مدبب يمتد 2-3 حلقات القصبة الهوائية أسفل شق وتأمين قنية في مكان باستخدام الخيط الحرير. تأكد من أن يمر بين خياطة القصبة الهوائية والمريء ويتم سحبها مشددة على قنية.
- ملء حقنة 1 مل مع 1 مل من محلول هانكس مخزنة المالحة (HBSS) وإدراج بلطف بالتركيبة لها في قنية.
- باستخدام حركة بطيئة، ولكن ثابتة، وضخ 900 ميكرولتر ~ في القصبة الهوائية، تضخيم الرئتين، والانسحاب فورا HBSS. وضع BALF تعافى في أنبوب مخروطي 15 مل.
- كرر هذا غسل 2 مرات إضافية لجمع ما يقرب من 3 مل من BALF لتحليل المستقبل. تخزين BALF على الجليد أو على 4 º مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
الحمار = "jove_title"> 3. إعداد التشريح المرضي
- إدراج حقنة 10 مل في موقف التضخم الرئة. تجميع أنابيب إلى بالتركيبة، وبالتركيبة إلى محبس، ومحبس إلى الحقنة. ضمان محبس هو في موقف مغلقة. سوف الحقنة 10 مل بمثابة خزان تدفق الجاذبية. يجب أن يرفق الخزان إلى الوقوف التضخم 4.75 في أعلاه الحيوان والجزء العلوي من الخزان ينبغي أن تمتد 10.5 في أعلاه الحيوان.
- ملء المحاقن مع حل الفورمالين محايدة مخزنة. تأكد من أن حقنة يمتلئ تماما مع تثبيتي.
- وضع منشفة ماصة تحت نهاية مفتوحة للأنابيب وفتح محبس للسماح للتثبيتي لملء الأنابيب. مرة واحدة يبدأ تثبيتي تتدفق من الأنابيب، فورا بإغلاق محبس وإعادة ملء الحقنة إلى الأعلى مع تثبيتي. من المهم أن حقنة يكون شغلها تماما لتوفير كمية مناسبة من الضغط للتضخم الرئة.
- بلطف تمرير قطعة ثانية من خيوط الجروح تحت القصبة الهوائية، ما يقرب من 1-2 حلقات القصبة الهوائية أسفل نهاية قنية.
- ربط عقدة فضفاضة واحد في خياطة؛ ومع ذلك، لا سحب ضيق عقدة.
- إدراج أنابيب من التضخم الماوس الوقوف في قنية.
- فتح محبس والسماح لملء الرئتين عن طريق التضخم الجاذبية.
- مرة واحدة تصل إلى الرئتين أقصى مستوى التضخم بها، وسحب الخيط ضيقة وربط عقدة الثاني.
- إغلاق محبس وإزالة أنابيب من قنية.
- بلطف إزالة قنية من القصبة الهوائية من خلال استيعاب خياطة مع زوج من ملقط وعقد قنية مع الأصابع. بحزم سحب الخيط إلى أسفل نحو التجويف الصدري وقنية إلى الخلف نحو الأنف الفأر.
- فهم بلطف القصبة الهوائية أو الغرز مع ملقط ورفع القصبة الهوائية بعيدا عن تجويف الرقبة.
- قطع القصبة الهوائية والذيلية للخياطة مرتبطة باستخدام مقص حادة.
- مرة واحدة في القصبة الهوائيةوخالية من الأنسجة الكامنة، والبدء في سحب القصبة الهوائية بعيدا عن الماوس. رفع بلطف الرئتين من التجويف الصدري.
- قطع بعناية النسيج الضام عقد الرئتين في التجويف الصدري. مواصلة سحب القصبة الهوائية بعيدا عن الجسم الماوس، وتطبيق قوة صاعد مستمر في حين قطع الاتصالات الأساسية. الحرص على تجنب قطع الرئتين. نلاحظ أن القلب ينبغي أن يترك تعلق على الرئتين باستخدام هذا الأسلوب.
- بمجرد إزالة الرئتين، ووضعها في 10 مل من الفورمالين مخزنة.
- إزالة جزء من ذيل الماوس لالتنميط الجيني.
- التخلص من الذبيحة الماوس التالية المبادئ التوجيهية المؤسسية المناسبة.
4. التقييم خلوى
- أجهزة الطرد المركزي الدم كله، جمعت تحت الخطوة 2.5، في 12،000 x ج لمدة 5 دقائق لعزل المصل. نقل المصل إلى prelabeled 1.5 مل أنبوب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- تقييم سيرومستويات م خلوى بواسطة ELISA أو مقايسة أخرى مماثلة. تمييع الدم 1:05 حتي 1:20 في وجود مخزن مؤقت التخفيف المناسبة، اعتمادا على الفحص، بعد بتصنيع التعليمات. وينبغي أن تحدد هذه التخفيفات تجريبيا قبل تشغيل الجزء الأكبر من العينات.
- ويرجع ذلك إلى انخفاض حجم الدم التي تم جمعها، والحد من حجم العينة تحميلها على لوحة ELISA بمقدار النصف. على سبيل المثال، فإن معظم ELISAs التجارية الاستفادة من 100 مجلدا ميكرولتر من المعايير والعينات. للحفاظ على العينات، تحميل 50 ميكرولتر من المعايير والمصل المخفف لكل بئر.
- أجهزة الطرد المركزي في BALF في جهاز للطرد المركزي الطاولة المبردة في 200 x ج لمدة 5 دقائق. نقل طاف الخلية الحرة إلى قسمين prelabeled 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- تقييم السيتوكينات BALF بواسطة ELISA أو مقايسة أخرى مماثلة دون تمييع.
- مخزن المصل غير المستخدمة وBALF في -80 درجة مئوية.
5. الفرق تلطيخ وBAL الخلوية التقييم
- بعد الطرد المركزي BALF وكاملة إزالة HBSS، ليز خلايا الدم الحمراء مكعبات باستخدام المياه المالحة ناقص التوتر. resuspend الخلايا في 900 ميكرولتر من الماء المقطر. إضافة على الفور 100 ميكرولتر من 10X PBS.
- ليز بشكل فردي كل عينة. إذا العينات تحتوي على كميات كبيرة من خلايا الدم الحمراء، وخلايا يمكن مكعبات في أجهزة الطرد المركزي في أعلى الجدول 400 x ج لمدة 5 دقائق ويمكن تكرار الدم الحمراء بروتوكول تحلل الخلية.
- تحديد إجمالي الخلوية BALF في تعليق 1 مل باستخدام عدادة الكريات تحت 10X أو 20 X التكبير مع التريبان الأزرق تلطيخ. تقييم وتقديم هذه البيانات في خلية / مل.
- إعداد مواد للcytospin تلطيخ والتفضيلية. تسمية شرائح المجهر القياسية باستخدام قلم رصاص أو قلم مقاومة المذيبات. تأمين الشرائح في شريحة cytospin والقمع. تأمين الشريحة التجمع في الدوار cytospin.
- Cytospin 150 ميكرولتر من BALF في 100 x ج لمدة 5 دقائق. إذا كانت كثافة الخلية كبيرة جدا على نحو فعالتقييم مورفولوجيا الخلايا والحد من حجم نسج أسفل على الشرائح. تسمح الشرائح على الهواء بين عشية وضحاها الجافة.
- الفرق وصمة عار على الشرائح التالية المصنوعات البروتوكولات. تسمح الشرائح على الهواء بين عشية وضحاها الجافة. ساترة الشرائح باستخدام Permount وتقييم الشرائح باستخدام المجهر مجهزة الهدف 20X 40X و.
- حصاد الخلايا المتبقية لتحليلها لاحقا، مثل نظام مراقبة الأصول الميدانية، المجهر الإلكتروني، المجهري متحد البؤر، واستخراج الحمض النووي الريبي لتقييم التعبير الجيني، و / أو استخراج البروتين لطخة غربية.
6. تقييم التشريح المرضي
- إعداد الرئتين لتقييم التشريح المرضي. بعد 24-48 ساعة من الفورمالين التثبيت، توجيه البطني تضخم الرئتين كله وجزءا لا يتجزأ من البارافين. قطع الكتل الناتجة لفضح الهوائية الموصلة الرئيسي.
- لتحسين دقة التهديف، ضع الرئتين في نفس الموقف وتقليم كل كتلة لأقصى قدر من التصور طولية رانه داخل الرئة الهوائية المحوري الرئيسي. من هذه النقطة، وقطع 5 ميكرون المقاطع المسلسل وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E). أقسام إضافية ويمكن خفض وإعدادها للفي الموقع التهجين باستخدام البروتوكولات القياسية.
- تقييم التشريح المرضي باستخدام نظام التهديف نصف الكمية على أساس المعايير التالية التهابات، والتي سجل بين 0 (تغيب) و 3 (شديدة): وحيدات النوى والنوى تسلل خلية؛ مجرى الهواء تضخم الخلايا الظهارية والإصابات؛ التسرب؛ حول الوعاء واستكفاف peribroncheolar؛ و٪ من الرئة تشارك مع التهاب. وينبغي تقييم التشريح من قبل الطبيب الشرعي الرئة من ذوي الخبرة.
- متوسط جميع الدرجات المعلمة لتوليد ما مجموعه نقاط التشريح المرضي أو استخدام عشرات الفردية لقياس جوانب معينة من تطور المرض. إجراء جميع التهديف بطريقة التعمية المزدوجة، مع المراجعين أعمى إلى كل من النمط الجيني والعلاج. وكان هذا النظام التهديف previouslوصف ذ 6،7،10.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وتتكون جدران الخلايا من البكتيريا سالبة الجرام من LPS، والتي هي وفيرة للغاية في البيئة. استنشاق LPS في التجمعات البشرية حساسة يزيد من تفاقم تفاعل مجرى الهواء، وقادر على إحداث response11 مناعية قوية. LPS هو أيضا PAMP الشائعة المستخدمة في نماذج الماوس لاستثارة الاستجابة المناعية الفطرية القوية. في وصف بروتوكول هنا، تلقت الفئران جرعة من أنها معزولة عن LPS E. القولونية (المصلي 0111: B4) باستخدام الادارة انها الفم والبلعوم. في نماذج من التعرض LPS، سواء درجة حرارة الجسم والوزن ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخطوات الأكثر أهمية لتقييم بنجاح استجابة المضيف المناعية في الماوس الرئتين هي كما يلي: 1) اختيار سلالة الفأر المناسبة والجنس لنموذج يجري تقييمها؛ 2) تحسين تسليم PAMP إلى الرئتين؛ 3) جمع بشكل صحيح ومعالجة BALF؛ و4) إصلاح بشكل صحيح وإعداد الرئتين لتقييم التشريحية المرضية.
اختيار سلالة الفأر هو عامل مهم في تقييم الاستجابة المناعية المضيف. تعتبر C57BL / 6 الفئران عادة الخلفية الماوس الأمثل لدراسة المناعة الفطرية بسب...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
شكر وتقدير
المؤلفين أشكر كلية VA-MD الإقليمي للطب البيطري لتوفير الأساسية والدعم التقني لهذا المشروع. ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح التطوير المهني (K01DK092355).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| C57Bl / 6J | مخزون مختبر جاكسون | 000664 | |
| مقياس مضغوط | Ohaus Scale Corporation | 71142845 | |
| حرارة المستقيم للحيوانات الصغيرة | Braintree Scientific | TH 5 | |
| مسبار المستقيم للقوارض | Braintree Scientific | RET 3 | |
| لكمة الأذن | Braintree Scientific | EP-S 901 | |
| عديد السكاريد الدهني من E. القولوني< م > 0111: B4 | InvivoGen | LPS-EB | |
| 1x تقنيات الحياة المالحة المخزنة بالفوسفات | 10010-023 | ||
| Isoflurane | Baxter | 40032609 | |
| إدارة القصبة الهوائية وحامل تضخم الرئة | ICAP تصنيع | N / A | |
| تنبيب القوارض | Braintree Scientific | مقص RIS 100 | |
| (حاد / حاد) | ملقط فيشر ساينتفيك | 13-806-2 | |
| (مستقيم) | فيشر ساينتفيك | 22-327-379 | |
| (45 & ordm;, منحني) | فيشر ساينتفيك | 10-275 | |
| (حاد / حاد) | فيشر ساينتفك | 08-940 | |
| ماصة (200 & micro; ل السعة) | جيلسون | F123601 | |
| الإيثانول | سيجما | 459844 | |
| 1 مل حقنة | BD الطبية | 301025 | |
| 10 مل حقنة | BD الطبية | 301604 | |
| 27 جم × 0.5 بوصة إبرة | BD الطبية | 305109 | |
| أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المبردة | فيشر Scientific | 13-100-676 | |
| 1.2 مم قنيات القصبة الهوائية مع محول لور | هارفارد | 732836 | |
| المتوازن محلول الملح | تقنيات الحياة | 14025-076 | |
| 4-0 خياطة جراحية مضفرة من الحرير | Ethicon | A183 | |
| مجموعات موصل الأنبوب من لور إلى الأنبوب | هارفارد | 721406 | |
| Luer Stopcock Kit | هارفارد | 721664 | |
| Tygon formula E-3603 مختبر الأنابيب | Sigma | R-3603 | |
| محلول الفورمالين ، محايد مخزن ، 10٪ | Sigma | HT501128-4L | |
| Mouse IL-1 & beta ؛ OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 | |
| Moons IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 | |
| Mouse TNF- & alpha ؛ OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 | |
| مقياس الدم | Hausser Scientific | 3520 | |
| غطاء مقياس الدم نظارات | Thermo Scientific | 22-021-801 | |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 | |
| Cytology Funnel Clips | Fisher Scientific | 10-357 | |
| Cytology Funnels | Fisher بطاقات التصفية العلمية | 10-354 | |
| فيشر ساينتفيك | 22-030-410 | ||
| شرائح المجهر | فيشر العلمي | 12-544-1 | |
| غطاء نظارات | فيشر Scientific | 12-540A | |
| Cytospin جهاز الطرد المركزي للخلايا | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Diff طقم تلطيخ سريع | فيشر Scientific | 47733150 | |
| Permount متوسط | فيشر Scientific | SP15-500 |
المراجع
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
- Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164(2012).
- Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
- Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
- Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
- Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
- Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
- Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
- Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
- Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
