مقالة منهجية

طبقة رقيقة الكروماتوجرافي (TLC) فصل واختبارات بيولوجية من المستخلصات النباتية لتحديد المركبات المضادة للميكروبات

DOI:

10.3791/51411

⸱

مارس 27, 2014

 , 
1Forage-Animal Production Research Unit, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم وصف طرق الكروماتوغرافي طبقة رقيقة (TLC) فصل المستخلصات النباتية وbioautography الاتصال لتحديد نواتج مضادة للجراثيم. يتم تطبيق أساليب لفحص المركبات الفينولية البرسيم الأحمر تثبيط فرط إنتاج الأمونيا البكتيريا (HAB) الأصلي إلى الكرش البقري.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتكون شاشة مشترك لمصنع المركبات المضادة للميكروبات فصل المستخلصات النباتية عن طريق الورق أو اللوني طبقة رقيقة (TLC أو PC)، وفضح المخططات الاستشرابية لتعليق الميكروبية (مثل الفطريات أو البكتيريا في مرق أو أجار)، مما يتيح الوقت للميكروبات أن تنمو في بيئة رطبة، وتصور المناطق مع عدم وجود نمو الميكروبات. فعالية هذا الأسلوب الفرز، والمعروفة باسم bioautography، ويعتمد على كل من نوعية الفصل الكروماتوغرافي والرعاية التي اتخذت مع الظروف الثقافة الميكروبية. وتصف هذه الورقة البروتوكولات القياسية لTLC والاتصال bioautography مع تطبيق رواية لالأمينية البكتيريا تخمر حامض. يتم فصل استخراج على مرونة (المدعومة من الألومنيوم) لوحات السيليكا TLC، وتصور العصابات تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) ضوء. يتم قطع مناطق من وحضنت وجهه لأسفل على أجار تلقيح مع اختبار الكائنات الحية الدقيقة. وتصور العصابات المثبطة التي كتبها تلطيخ لوحة آغارق مع نتروبلو الحمراء. يتم تطبيق طريقة لفصل البرسيم الأحمر (نفل pratense السيرة الذاتية. Kenland) المركبات الفينولية والفرز من أجل نشاط ضد كلوستريديوم sticklandii، على إنتاج الأمونيا بكتيريا فرط (HAB) التي هي أصلية في الكرش البقري. تطبيق أساليب TLC لأنواع عديدة من المستخلصات النباتية والأنواع البكتيرية الأخرى (الهوائية أو اللاهوائية)، فضلا عن الفطريات، ويمكن أن تستخدم الكائنات اختبار إذا تم تعديل الشروط الثقافة لتناسب متطلبات نمو الأنواع.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعاير عن المركبات المضادة للميكروبات في محطات يتطلب فصل مكونات مستخلصات نباتية، وفضح الكائنات الحية الدقيقة اختبار لتلك المكونات، وتحديد ما إذا كان يتم تثبيط نمو الكائنات الحية الدقيقة من قبل أي من المركبات. فصل من ورقة أو اللوني طبقة رقيقة (TLC أو PC) هي مريحة لأن العديد من المركبات يمكن فصل على سطح مستو. ويستند الفاصل على قطبية، مع بعض المركبات ملزمة بإحكام إلى مكثف (السليلوز في حالة الكمبيوتر، ومجموعة متنوعة من الممتزات في حالة TLC) والهجرة أقل من غيرها 1. الشكل 1 يوفر مثالا على الأوضاع النسبية لل المركبات الفينولية القطبية وغير القطبية بعد الانفصال على طبق من السيليكا TLC.

figure-introduction-1
الشكل 1. وتستخدم بياني يوضح توزيع المركبات من أقطاب مختلفة بعد الانفصال على السيليكا طبقة رقيقة الكروماتوغرافي (TLC) لوحة. مركبات الفينول من البرسيم الأحمر (نفل pratense L.) كمثال. مركبات قطبية، مثل clovamide، لديها تقارب قوي لمكثف القطبية مثل السيليكا وتبقى بالقرب من المنشأ (OR)، في حين أن مركبات القطبية أقل، مثل الايسوفلافون ثلاثة قرب الجبهة المذيبات (SF)، والتقسيم بسهولة أكبر في المذيبات (التي هي أقل من السيليكا القطبية ما لم يتم تضمين الماء، والأحماض، أو القواعد) وتهاجر أبعد تصل اللوحة.

بعد فصل مقتطف على لوحة TLC، يمكن أن يتعرض الكائنات الدقيقة اختبار لجميع المركبات على لوحة، وبالتالي تسريع التعرف على مكونات نشطة من مقتطف 2. إذا تعرضت ثقافة الفطرية أو البكتيرية إلى اللوني، وسوف يحدث نمو الجراثيم في كل مكان ما عدا في مناطق مع النمو المانعمركبات ذ. مناطق تثبيط ثم يمكن تصور بملاحظة التناقض بين النمو أفطوري والمناطق الخالية من النمو إذا تم تطبيقها الفطريات 3 أو عن طريق الرش مع المركبات التي تغير لونها عندما خفضت أو تحلل من قبل الخلايا الحية 4. على الرغم من أن استخدام ورقة أو رقيقة طبقة المخططات الاستشرابية لفحوصات مضادة للميكروبات تم تطبيق أول من المضادات الحيوية ومبيدات الفطريات 5 3،6، والآن في كثير من الأحيان فحص المستخلصات النباتية للمركبات المضادة للميكروبات مع هذا الأسلوب، وغالبا ما يشار إليها باسم bioautography. البروتوكولات وصف ينطبق هنا لbioautography من المخططات الاستشرابية طبقة رقيقة. ويستخدم على نطاق واسع TLC لأنه سريع نسبيا ويمكن تنفيذها على الممتزات مختلفة (مثل السيليكا، والنشا، والألومينا)، فضلا عن تقديم قرار جيد وحساسية 1.

المستخلصات النباتية يمكن أن تكون على استعداد لTLC في نواح كثيرة. وتشمل الطرق الشائعة استخراج المواد النباتية في ALCمخاليط ohol المياه مثل الايثانول 80٪ 7،8، وربما مع إضافة حمض أو قاعدة 9. بعد استخراج في مثل المذيبات، والتي تحتوي على بعض الماء وربما هي الحمضية أو الأساسية، يجب أن تتركز مقتطفات بحيث يمكن تطبيقها على لوحات TLC في حجم الحد الأدنى. ويمكن تحقيق تركيز الكحول مقتطفات المياه عن طريق تقسيم مع إمتزاج الماء أو المذيبات العضوية 8 مع خليط من هذه المذيبات، مثل إيثيل الأثير، خلات الإيثيل (1:1، ت / ت) 10،11. يتم استخراج نواتج الأيض النباتية المختلفة في المذيبات العضوية المختلفة، اعتمادا على أقطاب بهم. لضمان أن يتم استخراج النباتية الأحماض العضوية أو القواعد الى المذيبات العضوية في هذه المرحلة، ودرجة الحموضة لاستخراج المياه الكحول يمكن رفع أو خفض مع حامض للذوبان في الماء أو قاعدة لتحويل التحاليل فصلها في أشكالها nondissociated، والتي هي ثم قابل للذوبان في المذيبات العضوية محايد 9. ويمكن بعد ذلك تكون المرحلة العضوية البريدvaporated تحت ضغط منخفض أو تحت النيتروجين وتعديلها لحجم المطلوب لTLC. الرقم الهيدروجيني للاستخراج من غير المرجح أن تكون قاتلة للميكروبات الأحيائي بسبب التقسيم من analytes في المذيبات محايدة، صغيرة الحجم النهائي، والتبخر للاستخراج على لوحة TLC قبل الانفصال.

ويعمل كل من الفطريات والبكتيريا مثل الكائنات الحية الدقيقة في اختبار bioautography من المستخلصات النباتية 2. أبواغ الفطريات بعض، مثل المبغثرة الطيرية، تنبت على لوحات TLC (وبصرف النظر عن المناطق مع المركبات المثبطة) إذا رش على لوحات في المحلول المغذي وحضنت في بيئة رطبة لعدة أيام 3. أفطورة المظلم من C. الطيرية على مناطق noninhibitory يوفر تناقض حاد مع المناطق الحرة من النمو أفطوري. على الرغم من أن البكتيريا تم تطبيقها على طبقة رقيقة اللوني (TLC) لوحات بنفس الطريقة 4،12، وسكب البكتيريا أيضا أكثر من TLCالسطوح وحة في أجار يعلو 13،14. الخميرة، مثل المبيضات البيض، ويمكن تطبيقها في تراكب أجار وكذلك 14. بدلا من ذلك، لوحات TLC يمكن وضعها مقلوبة على أجار تلقيح مع البكتيريا أو الخميرة 10،15 8، طريقة تعرف باسم الاتصال bioautography 2.

نحن تصف طريقة للاتصال bioautography للكشف عن المركبات الفينولية المضادة للميكروبات من البرسيم الأحمر (نفل pratense السيرة الذاتية. Kenland). الكائنات الحية الدقيقة الاختبار هو sticklandii كلوستريديوم، وهو فرط انتاج الأمونيا بكتيريا الكرش (HAB) واهوائي مجبر. على الرغم من أن فصل المستخدمة لا حل جميع مكونات استخراج، كانت تسهل تحديد مناطق نشاط مضادات الميكروبات، وبالتالي تضييق مجموعة من المركبات المضادة للميكروبات ممكن. بروتوكول يستخدم إجراءات موحدة لTLC 1. يصف البروتوكول أيضا بعض التقنيات اللازمة لزراعة obliاللاهوائيات بوابة لمثل هذا الفحص، واستخدام الاتصال bioautography 15 وطريقة التصور مع الملح نتروبلو، التي بقع الخلايا الحية 2،4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد مستخلصات نباتية

  1. يرى كاغان وFlythe 10 لاستخراج المركبات الفينولية من نفل pratense السيرة الذاتية. Kenland.
  2. لاستخراج المركبات الأخرى في النباتات الأخرى، والتحقق من الأدب التحليل الكيميائي النباتي لأساليب الاستخراج نبات أو المستقلب محددة (وكثير موصوفة)، أو للبحث عن بروتوكولات مثل تلك التي خرام وآخرون 7،8 الذي عزل العديد من المركبات مع واسعة مجموعة من التناقضات.

2. إعداد لوحات رقيقة طبقة

  1. لوحات TLC نظيفة من خلال تطوير في واحدة أو أكثر القطبية والمذيبات محايدة، من أجل التحرك الملوثات كثف بعيدا عن منطقة النمو.
    1. في غطاء الدخان، وإعداد ما يكفي من تنظيف المذيبات (مثل 15-100 مل من خلات الإيثيل الميثانول 2:1، ت / ت) لتغطية الجزء السفلي من الغرفة TLC النامية، فضلا عن الحافة السفلية من لوحة TLC عندما مجموعة داخل الغرفة.
    2. استخدام تسويقيةالزجاج المتاحة cially TLC النامية غرف (الأحجام المختلفة المتاحة، مع الأغطية) أو المغطاة احباط الأكواب بيركس أو الجرار المحافظة.
    3. استخدام مقص لقطع الألومنيوم أو (مرنة) لوحات هلام السيليكا المدعومة من البلاستيك، والتي تأتي في مختلف الأحجام (20 سم × 20 سم وأصغر)، لتناسب غرفة النامية المتاحة. (تنبيه: السيليكا يمكن أن تسبب تلفا رئويا في حالة استنشاقه العمل في غطاء الدخان، والتعامل مع لوحات TLC مع قفازات لتجنب الحصول على زيوت الجلد على السيليكا.)
    4. إدراج لوحات في غرفة، مع قمم يتكئ على جدران الغرفة. يجب أن لا تلمس لوحات بعضها البعض. تغطية القاعة والسماح للمذيب تتحرك صعودا لوحة من قبل عمل شعري.
    5. عندما وصلت المذيبات الجزء العلوي من لوحات، وإزالة لوحات من غرفة وترتيب في وضع الوقوف داخل غطاء الدخان حتى يتبخر المذيب.
    6. تحقق لمعرفة ما إذا كان قد هاجر الشوائب بالقرب من أعلى لوحة TLC التي كتبها تبحث عن الفرقة الصفراء تحت مرئيةالضوء، أو فرقة الفلورسنت تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) ضوء (انظر "الجبهة النجاسة" أو IF في الشكل 2B). إذا كانت الغالبية العظمى من لوحة لا يزال لديه لون مصفر، وتكرار عملية التنظيف.
    7. بعد إزالة لوحات TLC من الغرفة، وتجاهل المذيبات. تسمح المذيبات المتبقية لتتبخر تماما قبل استخدام الغرفة لبروتوكول 2.
    8. لإزالة الرطوبة المتبقية التي يمكن أن تؤثر الهجرة من المركبات على السيليكا 16، دعم لوحات تستقيم في فرن التجفيف عند 100 درجة مئوية (10-15 دقيقة ل20 سم × 20 سم لوحة، و 5 دقائق لمدة 7 سم × 10 سم لوحات ).
    9. إذا فرن تجفيف 100 درجة مئوية ليست متاحة، لوحات حرارة لفترة أطول من الوقت في درجات حرارة منخفضة (أي 40 دقيقة في 60 درجة مئوية).
    10. بعد لوحات جافة، والسماح لهم يبرد إلى درجة حرارة الجو المحيط قبل التحميل.

3. إعداد النامية غرف لاستخراج الفصل

  • استخدام مقص لقطع قطعة من ورق الترشيح أقل قليلا ارتفاع الغرفة، وحوالي نصف محيط الدائرة في العرض. تعمل هذه الورقة بمثابة الفتيل لرسم مذيب يصل جدار الغرفة وتشبع الغرفة مع أبخرة المذيبات، وبالتالي تحسين استنساخ فصل 1.
  • في غطاء الدخان، ومزيج المذيبات (خلات الإيثيل الميثانول 4:1، ت / ت، لهذه الدراسة). صب خليط المذيبات في غرفة وتغطية. الانتظار حتى الفتيل كله هو الرطب مع المذيبات، مشيرا غرفة التشبع، لوضع لوحات في الغرفة.

    • 4. التحميل والتنمية من لوحات TLC

    1. بخفة بمناسبة الأصل مع قلم رصاص. إذا كانت لوحة مكثف TLC لينة وتلف بسهولة، وجعل علامات على الحواف. يجب أن تكون مركبات فوق سطح المذيب النامية عندما يتم إدراج لوحات في غرفة TLC.
    2. تذوب في المذيبات العضوية مقتطفات يكفي (في هذه الحالة، والميثانول) أن يكون لها حل المركزة بدلا من عكرالتعليق.
    3. تحميل عينات والمعايير كما نطاقات ضيقة مع حقنة ميكروليتر أو بال micropipettes الشعرية، وترك الحدود 1 سم على جانبي اللوحة. السماح للعصابات لتجف (تأجيج وحة أو تحميله في غطاء الدخان يساعد).
    4. إذا كانت هناك حاجة إلى تركيز أكبر من العينة على طبق من ذهب، "overspot" حسب العينات التحميل مرة أخرى على العصابات المجففة.
    5. بالملقط أو ملقط، تعيين لوحة (ق) داخل غرفة TLC المشبعة. يجب أن لا تلمس لوحات الفتيل لأنها قد توفر المذيبات إلى لوحات في نقاط الاتصال، وبالتالي تغيير مسار الهجرة المجمع. تغطية القاعة والسماح لوحات تطويرها.

    5. إعداد لوحات للالأحيائي

    1. إزالة لوحة (ق) من خزان TLC قبل أن تصل الجبهة المذيبات الجزء العلوي من لوحة، وعلامة على ارتفاع الجبهة مذيب مع قلم رصاص. السماح لوحة جافة في الدخان غطاء محرك السيارة.
      1. وضع أي لوحات TLC المتبقية في نفس الغرفة TLC، وهو جنرال الكتريكnerally صالحة للاستعمال لمدة يوم كامل إذا ما واصلت مغلقة. إعادة تشكيل خليط مذيب للغرفة TLC إذا كانت كمية المذيب في غرفة يقلل أبرزها.
    2. بعد لوحات جافة، تصور العصابات تحت الضوء المرئي أو الأشعة فوق البنفسجية، وترسيم العصابات مع قلم رصاص. وغرفة عرض مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية المحمولة غير مريحة، وخاصة إذا كان مصباح يمكن الكشف عن المركبات في كل 254 نانومتر (الموجة القصيرة الأشعة فوق البنفسجية) و 365 نانومتر (الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة).
      ملاحظة: عند هذه النقطة أو بعد الخطوة التالية، لوحات يمكن أن تكون ملفوفة في غلاف بلاستيكي، مع تغطية احباط، وتخزينها في -20 درجة مئوية. الحد الأقصى للوقت تخزين يعتمد على الاستقرار المجمع. لأن السيليكا ليست محايدة، قد تكون بعض المركبات تتحلل بينما على لوحة TLC.
    3. تصوير أو رسم لوحات.
      1. استخدام نظام هلام photodocumentation إذا كان أحد مجهزة للأشعة فوق البنفسجية النفقات العامة و / أو أضواء مرئية هو متاح.
      2. إذا لم يكن هناك نظام photodocumentation التجارية متاحة، واصطف لوحات صورة داخل مربع مع ورقة أو قطعة قماش داكنة، وايمجموعة ال الكاميرا على ترايبود وضوء الأشعة فوق البنفسجية المحمولة فرضت لحلقة الوقوف 17. عند تصوير لوحات التي لديها أي مؤشر الفلورسنت، واستخدام عامل تصفية الضوء الأزرق خلال عدسة الكاميرا لتحسين مظهر الفرقة 17.
    4. للمساعدة في تشخيص العصابات، وحساب عامل الاستبقاء (R و) القيم عن طريق قياس المسافات التي تقطعها المركبة وجبهة المذيب، وتقسيم السابق من قبل (2A الشكل) الأخير.

    6. البكتيرية الثقافة والفحص

    1. إعداد وتطعيم وسائل الاعلام تحت الظروف اللاهوائية. كانت الثقافة المستخدمة في هذه الحالة كلوستريديوم sticklandii سلالة ريال، والتي تم الحصول عليها من مجموعة ثقافة جيمس ب. راسل، جامعة كورنيل، إيثاكا، نيويورك.
      1. انظر Flythe وكاغان 13 وقائمة المواد للحصول على وصف HAB سائل الإعلام.
    2. تنمو ثقافة إلى مرحلة الأسي أو ثابتة. استخدام معقم اللاهوائية التقنيهوفاق عند العمل مع الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية.
    3. تطعيم ثقافة (1٪ ت / ت) في أجار المنصهر بعد درجة حرارة أجار (0.75٪ ث / ت) قد انخفض إلى أقل من 60 درجة مئوية. المزيج بلطف وجلب على الفور الى غرفة اللاهوائية (95٪ CO 2 -5٪ H 2 الغلاف الجوي للHAB سائل الإعلام) لتصب.
    4. تصب 15 ملم × 100 ملم البلاستيك أطباق بتري، والسماح ليصلب.
    5. مع مقص، وقطع لوحة TLC في المناطق التي تحتوي على الفرقة (ق) من الفائدة. وضع العصابات وجهه لأسفل على لوحات أجار، بمناسبة العصابات على دعم لوحة لتتبع التوجه الأصلي على لوحة TLC. وضع الشريط على TLC غير المستخدمة على لوحة أجار كمجموعة تحكم.
    6. احتضان لوحات أجار، جنبا أجار أسفل، في غرفة اللاهوائية (24 ساعة و 39 درجة مئوية).

    7. تصور Bioassayed آجار لوحات

    1. مع ملقط، إزالة العصابات من لوحات أجار أثناء وجودهم في غرفة اللاهوائية.
    2. إضافة 1٪ (ث / ت) الشركة المصرية للاتصالاتtrazolium الأحمر، الذي أعد في الماء، قطرة قطرة على أسطح لوحات أجار. تسمح اللون لتطوير لمدة 20 دقيقة على الأقل، أو حتى يتحول لوحة تحكم الحمراء تماما، قبل إزالة من غرفة اللاهوائية. وسوف تبدأ البكتيريا اللاهوائية أن تفقد صلاحية مباشرة بعد إزالة من غرفة اللاهوائية، ولكن اللون هو مستقر لأكثر من 24 ساعة.
    3. تصوير تحت الضوء المرئي.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    وتظهر ممثل فصل السيليكا TLC من البرسيم الأحمر (نفل pratense السيرة الذاتية. Kenland) مقتطفات، التي تحتوي على مركبات فينولية، في الشكل 2. فصل الأحمر استخراج البرسيم في خلات الإيثيل الهكسان (9:1، ت / ت)، وأكثر من 8.5 سم، وأسفرت عن خمسة فرق، واحدة حل غير كامل من أصل (الشكل 2A). ومع ذلك، يوضح الشكل 2B التي كشفت عن العديد من ضعف العصابات عندما تم فصل عينة مختلفة من استخراج البرسيم الأحمر (من نفس الصنف، ولكن نمت في مؤامرة منفصل...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لفصل مقتطف إلى مجموعات فرعية من المركبات ومعايرة تلك المجموعات الفرعية عن طريق الاتصال bioautography. طريقة مماثلة تماما لتلك المستخدمة من قبل 15 Chomnawang آخرون للكشف عن نواتج النبات المثبطة للبكتيريا المسببة للمرض السيلان. نوع bioautography المستخدمة للكشف عن المركبات النباتية المضادة للجراثيم يعتمد على عوامل كثيرة، بما في ذلك الكائنات الحية الدقيقة الاختبار، وإعداد المختبر، وتفضيلات الشخص (الأشخاص) أداء الأحيائي. الاتصال bioau...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذه المادة هو فقط لغرض توفير معلومات محددة، ولا تعني توصية أو تأييد من قبل وزارة الزراعة الأميركية. الكتاب تعلن أي مصلحة مالية المتنافسة.

    شكر وتقدير

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    نشكر المرحوم الدكتور نورم تايلور، النبات وقسم علوم التربة في جامعة كنتاكي، على إتاحة الفرصة لنا لاستخدام عينات من له المؤامرات البرسيم الأحمر لهذه الدراسة. وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل وزارة الزراعة في الولايات المتحدة.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    ألواح

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    TLC السيليكا F254< / sub> ، مدعومة من الألومنيوم ، سمك 0.2 مم ، 20 سم × 20 سمEMD Chemicals5554/7هذه الألواح مطلية بالسيليكا التي تحتوي على مؤشر فلور عند 254 نانومتر. تظهر المركبات التي تمتص عند هذا الطول الموجي داكنة على خلفية خضراء فلورية. تشمل المصادر البديلة Analtech و Selecto Scientific و Fluka. قد تكون هناك حاجة إلى مواد ماصة أخرى غير السيليكا. قد تكون الألواح المدعومة بالبلاستيك مناسبة، اعتمادا على المذيبات المراد استخدامها.
    مقص حاد شديد التحمل  أي شركة توريد خياطةمشابهة ل Fiskars 175800-1002لقطع لوحات TLC. يمكن أيضا استخدام قاطع الورق بشفرة حادة. لا تستنشق غبار السيليكا.
    فرن التجفيف على درجة حرارة 100 درجة ؛ C (الحمل الحراري الميكانيكي)Thermo ScientificPR305225MQuincy Lab، Inc ، شيكاغو ، إلينوي (www.quincylab.com) ؛ Cascade Technical Sciences ، Hillsboro ، OR (www.cascadetek.com)
    غرفة TLCKimble Chase416180-0000مصادر بديلة:  الدريتش. يمكن استخدام أكواب بيركس أو برطمانات الحفظ للأطباق الصغيرة (أي 5 سم × 10 سم).  قم بتغطيتها بورق الألمنيوم (قد تحتوي أغطية البرطمانات على مادة قابلة للاستخراج بواسطة أبخرة المذيبات).
    50 وميكرو ؛ ل حقنة مع طرف إبرة مسطحةهاميلتون80965لتحميل كميات قياسية أو عينة تتجاوز 5-10 µl.  المصادر البديلة متكافئة.
    الماصات الدقيقةDrummond2-000-001لتحميل كميات صغيرة من المعايير أو العينات. مصادر بديلة:  VWR.  أيضا ، يمكن تمديد ماصات باستور إلى قطر أرق باستخدام شعلة البوتان.  
    ورق الترشيح (#1 الصف)Whatman1001 917بمثابة فتيل الغرفة.  الدرجات الأخرى من ورق الترشيح على ما يرام. يمكن قص هذا الحجم للغرف التي تحمل ألواح 20 سم × 20 سم.      
    ملقط دورقفيشر العلمي15-186لوضع الألواح داخل وخارج غرفة TLC كبيرة. المصادر البديلة: VWR 
    ملقط مسطحالحواف فيشر Scientific10-275لوضع الألواح داخل وخارج غرفة صغيرة. مصادر بديلة: VWR
    مصباح صغير محمول للأشعة فوق البنفسجية مع مصابيح 4 واط أو 6 واط لإضاءة ضوء الأشعة فوق البنفسجية قصيرة وطويلة الموجة (254 و 365 نانومتر ، على التوالي) منتجاتالأشعة فوق البنفسجية95-0271-01مصادر بديلة: شركة Spectronics Corporation (www.spectroline.net)
    خزانة عرض للاستخدام مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية المحمولة باليدمنتجات الأشعة فوق البنفسجيةChromato-Vue C-10Eيتم وضع دائرة حول العصابات النشطة للأشعة فوق البنفسجية بسهولة أكبر إذا كان من الممكن ضبط الألواح هنا. مصادر بديلة: شركة Spectronics Corporation. 
    نظام التوثيق الضوئي مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية العلوي والمصباح المرئيKodakGel Logic 200& nbsp; مصادر بديلة: منتجات الأشعة فوق البنفسجية (www.uvp.com).  انظر بروتوكول البديل محلي الصنع.
    غرفة لاهوائية, نوع أ, فينيلكوي7150000هذه الغرفة مناسبة للبكتيريا اللاهوائية, مثل Clostridium sticklandii< / em>, كما هو موضح.   ومع ذلك ، يجب أن تكون ظروف النمو مصممة للكائن الحي المستخدم في الفحص. يجب اتخاذ خزانة السلامة الحيوية وغيرها من الاحتياطات في حالة استخدام الكائنات المسببة للأمراض. مصادر بديلة: Anaerobe Systems و BioRad و Plas Labs وغيرها ؛
    تيترازوليوم الأحمرSigma-AldrichT8877مصادر بديلة: MP Biomedicals ، Santa Cruz Biotechnology ، Alfa Aesar
    مكونات وسائط HAB < / strong >
    Pyridoxamine & middot ؛ 2HClSigma-AldrichP9380لهذا ولجميع الكواشف الأخرى في هذا الجدول ، تكون المصادر البديلة متكافئة.
    ريبوفلافينسيجما ألدريتشR4500
    ثيامين هيدروكلوريكسيجما ألدريتشT3902
    نيكوتيناميدسيجما ألدريتشN3376
    الكالسيوم D-PantothenateSigma-AldrichC8731
    حمض الليبويك  سيجما ألدريتشT5625
    ف-حمض أمينوبنزويك  سيجما ألدريتشA9878
    حمض الفوليكسيجما ألدريتشF8798
    البيوتينسيجما ألدريتشB4639
    الكوبالامين سيجما ألدريتشC3607
    بيريدوكسال هيدروكلوريكسيجما ألدريتشP9130
    بيريدوكسينسيجما ألدريتشP5669
    EDTAسيجما ألدريتشE6758
    كبريتات الحديد & 7H2< / sub>Oسيجما ألدريتشF8263
    كبريتات الزنك & middot ؛ 7H 2 < / sub >Oسيجما ألدريتشZ0251
    كلوريد المنغنيز · 4H2< / sub>OSigma-AldrichM8054
    حمض البوريكSigma-AldrichB6768
    كلوريد الكوبالت · 6H2< / sub>OSigma-AldrichC8661
    كلوريد النحاس · 2H2< / sub>OSigma-Aldrich459097
    كلوريد النيكل · 6H2OSigma-Aldrich203866
    موليبدات الصوديوم & middot; 2H2OSigma-Aldrich331058
    Trypticase (هضم البنكرياس للكازين)ثيرمو فيشرB11921
    فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة اللامائيثيرمو فيشرP284
    كربونات الصوديوم & middot; H2O ثيرمو فيشرS636
    أجارثيرموفيشر 50841063
    كبريتات المغنيسيوم & middot ؛ 6H 2< / sub>OThermo Fisher7791-18-6
    كلوريد الكالسيوم · ؛ 2H 2< / sub>OThermo FisherBP510
    Cysteine HClThermo Fisher19464780
    البوتاسيوم الفوسفات ثنائي القاعدة اللامائيثيرمو فيشرP290
    كلوريد الصوديومثيرمو فيشرBP358

    المراجع

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
    2. Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
    3. Homans, A. L., Fuchs, A. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. J. Chromatogr. 51, 327-329 Forthcoming.
    4. Lund, B. M., Lyon, G. D. Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms. J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).
    5. Betina, V. Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field. J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).
    6. Weltzien, H. C. Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm. Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).
    7. Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique. Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).
    8. Khurram, M., et al. Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).
    9. Robinson, T. The Organic Constituents of Higher Plants. , Burgess Publishing Co. (1963).
    10. Kagan, I. A., Flythe, M. D. Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium. Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).
    11. Mattila, P., Kumpulainen, J. Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection. J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).
    12. Hamburger, M. O., Cordell, G. A. A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity. J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).
    13. Flythe, M., Kagan, I. Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii. Curr. Microbiol. 61, 125-131 Forthcoming.
    14. Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).
    15. Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract. J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).
    16. Stahl, E., Kaldewey, H. Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 Forthcoming.
    17. Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola. J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).
    18. Kline, R. M., Golab, T. A simple technique in developing thin-layer bioautographs. J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).
    19. Wedge, D. E., Nagle, D. G. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).
    20. Beck, A. B., Knox, J. R. The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover. Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).
    21. Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum. Plant Physiol. 115 (4), (1997).
    22. Peterson, C. A., Edgington, L. V. Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique. J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    Clostridium Sticklandii

    مقالات ذات صلة