مقالة منهجية

عزل القائم على تقارب من معلم النواة من ذبابة الفاكهة الأنسجة لتحليل التعبير الجيني

DOI:

10.3791/51418

⸱

مارس 25, 2014

 , 
1Department of Biochemistry, Purdue University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبا ما تحتوي على الأنسجة ذبابة الفاكهة خليط غير متجانس من أنواع الخلايا. لدراسة التعبير الجيني في أنواع معينة من الخلايا من الأنسجة وجه الخصوص، يمكن الموسومة نوى وراثيا وعزل في وقت لاحق باستخدام النهج القائم على النسب. نواة معزولة يمكن استخدامها لتطبيقات المصب مثل تحليل التعبير الجيني والكروماتين مناعي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبا ما تحتوي على الأنسجة الجنينية واليرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن خليط غير متجانس للغاية من أنواع الخلايا، والتي يمكن تعقيد تحليل التعبير الجيني في هذه الأنسجة. وبالتالي، لتحليل خلية محددة ملامح التعبير الجيني من الأنسجة ذبابة الفاكهة، فإنه قد يكون من الضروري عزل أنواع معينة من الخلايا مع نقاء عالية وعلى عوائد كافية للتطبيقات المصب مثل النسخي والكروماتين مناعي. ومع ذلك، فإن التشكل الخلوية في أنسجة غير النظامية مثل الجهاز العصبي المركزي، إلى جانب السكان نادرة من أنواع معينة من الخلايا في هذه الأنسجة، يمكن أن تشكل تحديات للطرق التقليدية من العزلة الخلية مثل تسليخ مجهري الليزر والخلية مضان تنشيط الفرز (FACS) . هنا، وهو نهج بديل للتميز ملامح التعبير الجيني خلية محددة باستخدام العزلة القائم على تقارب من نوى الموسومة، بدلا من خلايا كله، يوصف. نوى في ج محددةنوع الذراع من الفائدة وصفت وراثيا مع المغلف النووية المترجمة علامة EGFP باستخدام نظام ثنائي التعبير GAL4/UAS. هذه النوى الموسومة EGFP يمكن أن تكون معزولة باستخدام الأجسام المضادة ضد GFP التي تقترن لحبات المغناطيسي. النهج الموصوفة في هذا البروتوكول يتيح العزلة ثابت من نوى من أنواع معينة من الخلايا في النظام المركزي اليرقات ذبابة الفاكهة العصبي في نقاء عالية وعلى مستويات كافية لتحليل التعبير، حتى عندما تشكل هذه أنواع الخلايا أقل من 2٪ من مجموع السكان في الخلية الأنسجة. ويمكن استخدام هذا النهج لعزل نواة من طائفة واسعة من ذبابة الفاكهة وأنواع الخلايا الجنينية اليرقات باستخدام برامج تشغيل GAL4 محددة، وربما يكون مفيدا في عزل نواة من أنواع الخلايا التي ليست مناسبة لنظام مراقبة الأصول الميدانية أو تسليخ مجهري الليزر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأنسجة ذبابة الفاكهة مثل الجهاز العصبي المركزي تحتوي على خليط معقد من أنواع الخلايا. وبالتالي، لتحليل خلية محددة ملامح التعبير الجيني من الأنسجة ذبابة الفاكهة، فمن الضروري أولا لعزل السكان متجانسة من خلايا معينة بكميات كافية لتمكين التطبيقات المصب. وتشمل وسائل لعزل الخلايا من أنسجة سليمة تسليخ مجهري ليزر، والخلية مضان تنشيط الفرز (FACS) من الخلايا بأكملها. بينما نظام مراقبة الأصول الميدانية قد استخدمت لعزل الخلايا ونوى من أجنة ذبابة الفاكهة وانواع معينة ايليجانس من لونين والتعبير الجيني التنميط 1-3، ونظام مراقبة الأصول الميدانية تسليخ مجهري ليزر يمكن أن يكون صعبا لتنفيذ بنجاح في الأنسجة التي تحتوي على أنواع الخلايا تتشابك غاية أو أن الخلايا تحتوي على مع مورفولوجيا غير النظامية، مثل الخلايا العصبية. للتغلب على هذه الصعوبة، بدلا من نوى الخلايا يمكن أن تكون معزولة عن أنواع معينة من الخلايا واستخدامها لاحقا الجنراله التنميط التعبير. الأهم من ذلك، مرنا تحليل التعبير المستندة ميكروأري باستخدام عينات الحمض النووي الريبي النووي تظهر نتائج مماثلة عموما مع أن تنفيذها باستخدام الحمض النووي الريبي مجموع 4 و 5. وعلاوة على ذلك، وتحليل التعبير الجيني باستخدام الحمض النووي الريبي النووي وقد استخدم بنجاح لدراسة التعبير الجيني في الكائنات متعددة بما في ذلك C. ايليجانس، نبات الأرابيدوبسيس thaliana، ذبابة الفاكهة، والبشر 4، 5 2، 3.

وقد تم مؤخرا وصفت عدة طرق لعزل السكان محددة من النوى وصفت من الأنسجة ذبابة الفاكهة التي هي مناسبة لتحليل التعبير الجيني و / أو لونين مناعي. العزلة دفعة من لونين الأنسجة محددة لطريقة مناعي (بت رقاقة) يستخدم نظام مراقبة الأصول الميدانية لعزل نواة ثابتة على أساس خلية من نوع معين من التعبير GFP المترجمة النووية 2. وكان هذا النهج سوتستخدم ccessfully لتحليل توزيع التعديلات هيستون وعوامل النسخ باستخدام لونين مناعي معزولة من نوى من الأديم المتوسط ​​من أجنة ذبابة الفاكهة 2. ومع ذلك، قد يكون النهج القائمة على نظام مراقبة الأصول الميدانية أقل مناسبة لعزل نواة المسمى التي تشكل إلا نسبة صغيرة من السكان مختلطة بسبب زيادة وقت الفرز اللازمة للحصول على أرقام مناسبة للتطبيقات المصب. للتغلب على هذه القيود، وقد استخدمت عدة جماعات تقنيات العزل القائم على تقارب لتنقية نوى التي وصفت مع حاتمة محددة في نوع خلية معينة. وقد تم مؤخرا تكييفها عزل نواة الموسومة في أنواع معينة الخلية (سليمة) طريقة تم تطويرها للاستخدام في نبات الأرابيدوبسيس thaliana 6، 7 لاستخدامها في ذبابة الفاكهة 8. في هذا الأسلوب، وهو بروتين مغلف الاندماج النووي الذي هو الركيزة لفي الجسم الحي هو biotinylation coexpresااا مع كولاي البيوتين يغاز البيرة في أنواع معينة من الخلايا. نوى المسمى البيوتين يمكن تنقيته في وقت لاحق من السكان مختلطة باستخدام القائمة على streptavidin تقارب العزلة. باستخدام هذا النهج، وصفت بنجاح نوى ومعزولة عن الأديم المتوسط ​​من أجنة ذبابة الفاكهة التي أعرب عن البروتين المغلف الانصهار النووي في ظل رقابة من الأديم المتوسط ​​محسن محددة 8. إنشاء الكتاب أيضا البروتينات المغلف النووية الانصهار التي يمكن التعبير عنها في أي نوع من الخلايا تحت سيطرة تسلسل GAL4 التنظيمية، UAS 9. هذا النهج قادر على عزل مجموعات فرعية من النوى بسرعة وصفت من السكان مختلطة، ولكن يتطلب ثلاثة بنيات منفصلة المعدلة وراثيا، وبالتالي قد تكون غير مناسبة لتطبيقات خاصة الوراثية. في الآونة الأخيرة، وقد وصفت هذا النهج الذي تم الموسومة SUN (S AD1 و C-84 للامم المتحدة) والبروتينات التي تحتوي على المجال الذي توطين إلى الغشاء الداخلي من المغلف النووية معوأعرب عن البروتينات الفلورية تحت سيطرة النظام GAL4/UAS 10. تم عزل نواة في وجود المنظفات غير أيوني لإزالة الغشاء الخارجي المغلف النووية، وتنقية تقارب باستخدام الخرز المغناطيسي لجانب الأجسام المضادة للGFP. وقد استخدم هذا النهج بنجاح لعزل المجموعات الصغيرة من النوى وصفت من أنواع فرعية محددة الخلايا العصبية في الدماغ الكبار ذبابة الفاكهة 10.

هنا، يوصف بروتوكول لعزل نواة صفت من السكان خليط من الخلايا من الأنسجة ذبابة الفاكهة اليرقات. وقد تم تطوير هذه الطريقة بشكل مستقل، ولكن هو مماثل لنهج وصفها هنري وآخرون 10 الأولى، وصفت نوى مع علامة الفلورسنت التي يتم التعبير فقط في أنواع معينة من الخلايا في ذبابة الفاكهة السوداء البطن لتسهيل العزلة لاحقة من نوى الموسومة من السكان مختلطة استخدام النهج القائم على النسب. لتسمية نوى،وقد استخدمت KASH (K larsicht / A-NC 1 / S yne ح omology) المجال. المجال هو مجال KASH عبر الغشاء الذي يموضع إلى الغشاء الخارجي المغلف النووية، في جزء منه من خلال التفاعل مع SUN البروتينات التي تحتوي على النطاق داخل الفضاء محيط بالنواة 11. المجال KASH C-محطة من البروتينات مثل ذبابة الفاكهة MSP-300 وKlarsicht المراسي هذه البروتينات إلى الغشاء النووي الخارجي، في حين أن التفاعل المجالات-N محطة مع بروتينات الهيكل الخلوي الأكتين مثل الأنابيب الدقيقة أو في السيتوبلازم 12-14. تم إنشاؤها في بنيات الذي تنصهر المجال KASH من ذبابة الفاكهة MSP-300 إلى C-محطة من EGFP، تحت سيطرة تسلسل تنظيمي GAL4، UAS في pUAST-attB ناقلات 15 و 16. باستخدام التكامل في مواقع محددة phiC31، تم إنشاؤها الذباب المعدل وراثيا الذي UAS-EGFP :: تم إدراج MSP-300 KASH التحوير في مواضع attP2 على الصبغي3L 17. وUAS-EGFP :: MSP-300 KASH الذباب يمكن تجاوزه مع الذباب التي تعبر عن السائق GAL4 في نوع خلية معينة، مما أدى إلى التعبير المستهدفة من EGFP على الغشاء النووي الخارجي في نوع من الخلايا في المصالح. ويمكن بعد ذلك أن وصفت نوى تنقيته من السكان الخلية المختلطة باستخدام الأجسام المضادة ضد GFP جانب لحبات المغناطيسي. في هذا النهج، لا يلزم استخدام المنظفات غير أيوني لأن يتم ترجمة العلامة EGFP إلى الجانب حشوية من الغشاء النووي الخارجي، ويمكن الوصول إلى الأجسام المضادة وبالتالي.

البروتوكول هو موضح أدناه يمكن استخدامها لعزل / إثراء نوى المسمى EGFP من أنواع معينة من الخلايا في أنسجة اليرقات ذبابة الفاكهة، لقياس العائد من النقاء والنوى معزولة، واستخراج الحمض النووي الريبي النووي مناسبة لكمية العكسية النسخ البلمرة سلسلة من ردود الفعل (QRT -PCR) تحليل التعبير الجيني. عزل وتنقية تقارب من نوى (باستثناء TISSUه تشريح) لا يمكن أن يؤديها في أقل من ساعة واحدة. يتم عرض النتائج تبين أن نوى الدبقية يمكن أن تكون معزولة بنجاح من الفص البصري اليرقات والعين القرص تخيلي، وتستخدم لاحقة تحليل التعبير الجيني. ومن المتوقع أن هذا النهج سوف يكون من المفيد لعزل / إثراء نوى صفت من الأنسجة الجنينية واليرقات في الخلايا المستهدفة التي تشكل أقل من 5٪ من إجمالي عدد السكان. تتوفر جميع الأسهم ذبابة الفاكهة والبلازميدات ولدت في هذه الدراسة من الكتاب عند الطلب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جيل وتوصيف EGFP :: KASH ذبابة الفاكهة

  1. السائق عبر GAL4 تسير رحلات الى UAS-EGFP :: MSP-300 KASH الذباب. بدلا من ذلك، يمكن أن تتولد الذباب المؤتلف التي تحمل كل من السائق GAL4 والتحوير UAS-EGFP :: MSP-300 KASH باستخدام تقنيات وراثية القياسية. هذا النهج الثاني هو مفيد إذا كانت هناك حاجة أعداد كبيرة من النسل.
  2. تميز تعبير عن علامة EGFP :: KASH باستخدام تقنيات المجهر القياسية. ملاحظة: EGFP التعبير يمكن ملاحظتها بواسطة تقنيات المجهر القياسية في تشريح ثابتة الأنسجة ذبابة الفاكهة، أو في اليرقات كله، و لا يتطلب استخدام الأجسام المضادة.
    1. تحديد نمط التعبير عن EGFP :: KASH علامة في الكائن الحي بأكمله تحت المجهر مضان تشريح (انظر المواد PDF). ملاحظة: العديد من السائقين GAL4، بما في ذلك السائق الريبو-GAL4 هو مبين في الشكل 1، ن المعرضأنماط onspecific التعبير في أنسجة اليرقات الأخرى مثل الغدة اللعابية (انظر نتائج).
    2. تحليل نمط التعبير EGFP :: KASH في الأنسجة تشريح ذات الاهتمام باستخدام متحد البؤر المجهري.
      1. إصلاح الأنسجة من الاهتمام باستخدام الفورمالدهيد بتركيز نهائي من 4٪، والحمض النووي وصمة عار باستخدام دابي في تركيز النهائي من 0.1 ميكروغرام / مل لتصور توطين EGFP :: KASH العلامة نسبة إلى الحمض النووي.
      2. الحصول على الصور باستخدام إما الهدف 40X / 1.30 النفط الغمر أو الهدف 20X / 0.75 الغمر النفط، وهذا يتوقف على حجم الأنسجة من الاهتمام. الشروط الإثارة / الانبعاثات التالية يمكن استخدامها لالتقاط صور: 408 nm/425-475 نانومتر (دابي)؛ 488 نانومتر / 525-550 نانومتر (GFP).

2. عزل النواة من ذبابة الفاكهة اليرقات الأنسجة

  1. إعداد المعدات اللازمة لتشريح الأنسجة اليرقات والعزلة نوى اللاحقة. لاحظ أنويمكن أيضا أن تستخدم الأجنة dechorionated كله في بدء المواد اذا شئت. فمن المستحسن أن استخدام أنسجة اليرقات تشريح جزئيا بدلا من اليرقات بأكمله إذا كان نوع من الخلايا في المصالح موجود في الأنسجة محددة مثل القرص تخيلي. هذا يقلل غير محددة ملزمة، وكذلك يلغي المشاكل التي يمكن أن تسببها التعبير عن بعض السائقين GAL4 في الخلايا غير المستهدفة.
    1. إعداد اثنين من أزواج من ملقط حاد (انظر المواد PDF)، واحدة siliconized 9 جيدا لوحة من الزجاج (انظر المواد PDF)، وPBT (1X PBS، ودرجة الحموضة 7.4؛ 0.1٪ توين 20).
    2. Prebind الأجسام المضادة GFP إلى حبات المغناطيسي. يجب أن تبدأ هذه الخطوة قبل البدء في تشريح. إضافة 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي (إينفيتروجن، انظر المواد PDF) و 2 ميكروغرام من GFP الضد (روش، انظر المواد PDF) إلى 400 ميكرولتر من غسل العازلة (1X PBS، ودرجة الحموضة 7.4؛ 2.5 ملي MgCl 2) في أنبوب 1.5 مل . كمية من الخرز والأجسام المضادة المستخدمة يمكن أن يكون الأمثل إذا لزم الأمر على أساس كمية من الهدف في سامالتنوير القائل وتقارب ملزم من الأجسام المضادة إلى الخرز.
    3. احتضان حبات والأجسام المضادة مع دوران لا يقل عن 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. وضع أنبوب 1.5 مل يحتوي على الخرز والأجسام المضادة في رف المغناطيسي (انظر المواد PDF) والسماح حبات لربط المغناطيسي لحوالي 1-2 دقائق. إزالة طاف يحتوي على الأجسام المضادة غير منضم وغسل العازلة باستخدام ماصة 1 مل. ستظل منضمة إلى حبات جدار أنبوب 1.5 مل على الجانب المجاور إلى المغناطيس.
    5. شطف حبات مرتين مع 1 مل من غسل العازلة في كل مرة كما هو موضح في القسم 2.1.4. إزالة أنبوب 1.5 مل من رف وعكس المغناطيسية لفترة وجيزة لمزج الخرز وغسل العازلة خلال كل خطوة الغسيل.
    6. تخزين حبات محددة الأجسام المضادة في غسل العازلة حتى على استعداد لمواصلة الخطوة 2.7. لا ينبغي أن يسمح حبات لتجف في أي مرحلة من البروتوكول.
  2. تشريح الأنسجة اليرقات في PBT ونقل الأنسجة تشريح لكذلك واحدة من الطبق 9 جيدا. عادة، تشريح الفص البصري والعين القرص تخيلي من 100 يرقات العمر الثالث يوفر مادة كافية لتحليل التعبير الجيني المصب التالية العزلة نوى.
  3. شطف الأنسجة المعزولة في استخراج العازلة النووية (10 ملي HEPES-كوه، ودرجة الحموضة 7.5؛ 2.5 ملي MgCl 2 و 10 ملي بوكل) في أنبوب 1.5 مل. نقل أنسجة اليرقات معزولة إلى 1 مل الخالط Dounce (انظر المواد PDF) على الجليد يحتوي على 1 مل من العازلة استخراج نووية جديدة. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. فإنه ليس من الضروري إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني إذا RNA هو استخراجها التالية العزلة نوى.
  4. تعطيل الأنسجة بنسبة 20 السكتات الدماغية مع مدقة فضفاضة وثم احتضان العينة على الجليد لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا لتنتفخ. استخراج النواة من الخلايا باستخدام 15 السكتات الدماغية مع مدقة ضيقة. يحتاج عدد من السكتات الدماغية مع المطاحن فضفاضة وضيقة ليكون الأمثل لأنسجة مختلفة وأنواع الخلايا؛ التجانس الزائد يمكن أن يؤدي إلىالمنفصمة النوى، في حين أن عدم كفاية التجانس لا استخراج كافة النوى من الأنسجة.
  5. تحديد جناسة، الذي يحتوي على نواة والحطام الخلوية، من خلال 40 ميكرون مسام الحجم مصفاة (انظر المواد PDF) التي تم prerinsed مع العازلة التجانس النووية. جمع جناسة تصفيتها في أنبوب جديد.
  6. جمع عينات ما قبل العزلة لتحليلها لاحقا لتحديد العائد النوى، نوى النزاهة، وتحديد مستويات النص من الجينات المستهدفة قبل النوى العزلة.
    1. نقل 50 ميكرولتر من جناسة تصفيتها إلى الطازجة أنبوب 1.5 مل باستخدام ماصة. هذا هو نموذج ما قبل العزلة. إضافة 500 ميكرولتر من كاشف Trizol (انظر المواد PDF، تنبيه)، قلب لخلط، وتخزينها في -20 درجة مئوية لعزل الحمض النووي الريبي لاحقة (الخطوة 3.1).
    2. نقل 20 ميكرولتر من جناسة تصفيتها إلى الطازجة 1.5 مل أنبوب.
      1. إضافة دابي لتركيز النهائي من 0.1 ميكروغرام / مل، والمؤتمر الوطني العراقيعينة أوباتي على الجليد لمدة 10 دقيقة.
      2. نقل نوى دابي الملون إلى ساترة المغلفة بولي يسين، ووضع على شريحة المجهر. ختم ساترة باستخدام طلاء الأظافر واضحة.
      3. التحقق من سلامة نوى، وجود نواة GFP الموسومة ذات الاهتمام باستخدام المجهر الفلورسنت. ملاحظة: ليس من الضروري لإصلاح نوى، أو وصمة عار لGFP إذا تم تحليل هذه الشرائح بسرعة معقولة التالية إعداد (في غضون 24 ساعة).
    3. نقل 10 ميكرولتر من جناسة تصفيتها إلى الطازجة 1.5 مل أنبوب وإضافة 90 ميكرولتر من غسل العازلة (1X PBS، ودرجة الحموضة 7.4؛ 2.5 ملي MgCl 2). إضافة دابي لتركيز النهائي من 0.1 ميكروغرام / مل، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. تحديد العائد نوى في العينة قبل العزل باستخدام عدادة الكريات لحساب نوى-دابي إيجابية باستخدام epifluorescence تحت هدف الهواء 10X.
  7. وضع أنبوب 1.5 مل تحتوي على حبات محددة الأجسام المضادة (المعد في القسم 2.1.6) في رفوف المغناطيسي،وتسمح حبات مغناطيسية لربط المغناطيس لمدة 2 دقيقة على الأقل كما هو موضح في القسم 2.1.4. إزالة غسل العازلة من الخرز محددة الأجسام المضادة باستخدام ماصة 1 مل، وإضافة جناسة تصفيتها من الخطوة 2.5 إلى أنبوب 1.5 مل باستخدام ماصة 1 مل.
  8. عكس بلطف الأنبوب عدة مرات لخلط، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع نهاية الإفراط في نهاية الانفعالات. تجنب فقاعات في أنبوب إذا كان ذلك ممكنا لأن هذه يمكن أن يؤدي إلى تراكمها من نوى.
  9. وضع أنبوب 1.5 مل تحتوي على حبات محددة الأجسام المضادة وجناسة في رفوف المغناطيسي، والسماح حبات مغناطيسية لربط المغناطيس لمدة 2 دقيقة على الأقل كما هو موضح في القسم 2.1.4. إزالة جناسة تحتوي على جزء نوى غير منضم باستخدام ماصة 1 مل.
  10. غسل العينة 3X مع 1 مل من غسل العازلة في كل مرة. إزالة أنبوب 1.5 مل تحتوي على الخرز، ونوى ملزمة وغسل العازلة من رف وعكس لخلط عدة مرات، ثم وضع أنبوب في رف المغناطيسي كما هو موضحفي الخطوة 2.9 وإزالة طاف باستخدام ماصة 1 مل.
  11. إضافة 150 ميكرولتر من غسل العازلة إلى الخرز، والتي ينبغي أن تكون ملزمة لنواة الهدف. هذا هو نموذج آخر العزلة. تحضير عينات للتحليل المجهري واستخراج الحمض النووي الريبي لاحقة.
    1. نقل 20 ميكرولتر من العينة آخر العزلة إلى أنبوب 1.5 مل الطازجة وصمة عار مع دابي وتحليل كما هو موضح في القسم 2.6.2. عد GFP + / + دابي وGFP-/DAPI + نوى استولت عليها حبات مغناطيسية لتحديد نقاء GFP + نوى التخصيب في عينة آخر العزلة.
    2. إضافة 1 مل من كاشف Trizol إلى ما تبقى من العينة آخر العزلة، عكس لخلط، وتخزينها في -20 درجة مئوية لعزل الحمض النووي الريبي لاحقة (الخطوة 3.1). ملاحظة: يمكن تخزين العينات في Trizol لعدة أسابيع إذا لزم الأمر في -20 درجة مئوية. فإنه ليس من الضروري أزل النوى من حبات مغناطيسية قبل استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام Trizol كاشف، becausه حبات لا تتداخل مع عزل الحمض النووي الريبي لاحقة.

3. تحديد مستويات النص في النواة المعزولة من اليرقات الأنسجة

  1. عزل الحمض النووي الريبي من قبل العزلة والعزلة آخر عينات أعدت في الأقسام 2.6.1 و2.11.2 باستخدام بروتوكول قياسي لاستخراج الحمض النووي الريبي وصفت مقرها Trizol (انظر المواد PDF) مع إجراء التعديلات التالية:
    1. بعد هطول الأمطار من بيليه الحمض النووي الريبي، إضافة 19.2 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه و 0.8 ميكرولتر من كاشف RNASecure (انظر المواد PDF) لبيليه واحتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة إلى تعطيل RNAses.
  2. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي مع صبغة الفلورسنت الحمض النووي الريبي ملزمة مثل مجموعة RNA و qubit فحص (انظر المواد PDF) باستخدام QubitR 2.0 التألق التالية بروتوكول الشركة المصنعة.
  3. توليف [كدنا] باستخدام الناسخ العكسي تضخيم مثل EpiScrIPT عكسي عدة الناسخ والاشعال oligodT باتباع إرشادات الشركة المصنعة. ملاحظة: عادة، و 50 إلى 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي [كدنا] يولد كافية لإجراء تحليلات متعددة التعبير الجيني. المبالغ المعادلة من قبل العزلة والعزلة RNA آخر ينبغي أن تستخدم لتوليد [كدنا].
  4. إضافة 180 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه لعينة [كدنا] 20 ميكرولتر لتمييع هذا 10 أضعاف قبل الوقت الحقيقي PCR الكمي (QPCR) التحليل. هذا التخفيف هو خطوة مهمة، وذلك لأن عينات [كدنا] مخفف يمكن أن تمنع QPCR.
  5. إعداد مزيج الرئيسي QPCR مع البلمرة وdNTPs، 4 pmoles كل من الأمام وعكس التمهيدي، تتكون مع الماء المعقم لحجم رد الفعل النهائي من 20 ميكرولتر.
    1. تصميم الاشعال QPCR لاستهداف الجينات التي من المتوقع أن يتم التعبير عنها في نوع من الخلايا في المصالح، وفي المرحلة التنموية التي يتم جمعها الأنسجة. الاشعال تصميم لتمتد على إنترون إذا أمكن، بحيث الجيني وويمكن التمييز بين المنتجات [كدنا] PCR. ملاحظة: إذا كان الوضع التعبير الجيني من نوع الخلية المستهدفة غير معروف، الاشعال ضد EGFP، والتي ينبغي أن تتجلى على وجه التحديد في عدد السكان نوى الموسومة، ويمكن استخدامها لتحسين بروتوكول لنوع خلية معينة والأنسجة (الجدول 1).
  6. تحديد مستويات النص النسبية لكل الجينات في المصالح في عينات ما قبل وبعد العزلة العزلة من خلال المقارنة إلى سلسلة التخفيف من [كدنا] أعدت من النسيج كله. وينبغي تطبيع مستويات النص من الجينات المستهدفة لجين مرجعية مثل Rpl32 (أو يفضل العديد من الجينات المرجعية).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأعرب السائق الريبو-GAL4 (بلومنجتون الأسهم رقم 7415) وتحديدا في الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي ذبابة الفاكهة في مراحل متعددة من التنمية 18. تم إنشاؤها الذباب التي تعبر عن ثابت UAS-EGFP :: MSP-300 KASH تحت سيطرة السائق الريبو-GAL4 باستخدام تقنيات وراثية القياسية. لتوصيف نمط التعبير عن EGFP :: KASH التحوير في هذه الذباب، تم فحص نمط GFP التعبير في الفص البصري وتشريح العين قرص تخيلي من يرقات العمر الثالث باستخدام متحد البؤر ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يمكن استخدامها لعزل أو إثراء للغاية على وجه التحديد نوى الموسومة من السكان الخلية المختلطة في ذبابة الفاكهة أو الأنسجة الجنينية اليرقات. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن عزل نواة من أنسجة تشريح في حوالي 1 ساعة. يجب تحديد نقاء والعائد من النوى معزولة تجريبيا لكل نوع من الخلايا. يمكن أن يكون من الصعب تحديد نواة محددة حبة في مرحلة ما بعد العزلة للبروتوكول باستخدام عدادة الكريات بسبب حبات موجودة في العينة. وبالتالي، إذا كانت هناك حاجة الأعداد الدقيقة للنواة لتطبيق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر جانيس فيشر لتوفير البلازميد UAS-EGFP :: MSP-300 KASH. تم الحصول على الضد mAB24B10 من دراسات البنك التنموي ورم هجين وضعت تحت إشراف معاهد الصحة القومية والتي تحتفظ بها جامعة ولاية ايوا، قسم الأحياء. تم الحصول على الأوراق المالية الريبو-GAL4 (BL7415) من مركز بلومينغتون الأسهم في جامعة إنديانا. بدعم من جمعية السرطان الأمريكية المؤسسية بحوث غرانت (IRG # 58-006-53) لمركز جامعة بوردو لأبحاث السرطان هو اعترف بامتنان. ويدعم Jingqun ما قبل البحوث الزراعية في جامعة بوردو في مساعدة مالية للأغذية والزراعة من جامعة بوردو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الجسم المضاد للشاوبتين (فأر ، أحادي النسيلة)دراسات التنموية بنك الورم الهجينmAB24B10
الجسم المضاد المضاد ل GFP (الفأر ، أحادي النسيلة)روش11814460001يوصى بهذا الجسم المضاد المحدد لهذا البروتوكول. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة البديلة.
2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix مع ROXMidSciBEQPCR-R
DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole ، ملح ثنائي هيدروكلوريد)Biotium40011
Dounce Homogenizer (1 مل)VWR62400-595
Dumont # 5 Tweezers ، 11 سمWorld Precision Instruments14095
Dynabeads Protein G للترسيبالمناعيInvitrogen10003Dيوصى بهذه العلامة التجارية المحددة من الخرز المغناطيسي لهذا البروتوكول.
EpiScript Reverse TranscriptaseEpicenterERT12910Khttp://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf< / a>
مصافي خلايا الصقر ، 40 & mu ؛ حجم المسام مVWR21008-949يمكن استخدام أحجام المسام البديلة ، اعتمادا على حجم نوى الخلية المستهدفة.
حامل مغناطيسي (8 × 1.5 مل أنابيب)MilliporeLSKMAGS08 
أنبوب دوار صغيرGenemateH-6700
Qubit طقمبدء تشغيل Life TechnologiesQ32871يمكن استخدام طرق مماثلة قائمة على التألق لتحديد كمية إنتاجية الحمض النووي الريبي. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ< / a>
RNAsecure (Ambion)Life TechnologiesAM7010يعد استخدام هذا الكاشف لتعطيل الحمض النووي الريبي اختياريا.
RT-PCR آلة Thermal CyclerBioRadCFX Connect Thermal Cycler
السيليكون 9 آبار صفيحة زجاجيةهامبتون ريسيرشHR3-134
محول مضان المجهر المجسم (أزرق ملكي (440-460 نانومتر) إثارة + حاجز أصفرNightseaيتيح هذا المحول فحص مضان GFP باستخدام مجهر تشريح نموذجي (مثل نيكون)
مجموعة مجهر StereoZoom 83604 مع عدسات مجال عريض 10X وحامل بوم عالمينيكونSMZ 745
Thermal CyclerBioRadT100
Trizol ReagentLife Technologies15596018الحذر ؛ يمكن استخدام طرق بديلة لاستخراج الحمض النووي الريبي. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf< / a>
Tween 20Amresco0777-1L

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weake, V. M., et al. Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation. Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).
  2. Bonn, S., et al. Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP. Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).
  3. Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq. Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).
  4. Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells. BMC Genom. 8, 340 (2007).
  5. Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei. Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).
  6. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).
  7. Deal, R. B., Henikoff, S. A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue. Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).
  8. Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genom. Res. 22, 766-777 (2012).
  9. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  10. Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).
  11. Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Curr Biol. 21, 414-415 (2011).
  12. Fischer, J. A., et al. Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye. Genetics. 168, 1385-1393 (2004).
  13. Patterson, K., et al. The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye. Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).
  14. Yu, J., et al. The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).
  15. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).
  16. Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye. Fly. 1, 75-85 (2007).
  17. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).
  18. Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).
  19. Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Gal4 UAS EGFP

مقالات ذات صلة