مقالة منهجية

وهناك طريقة معدلة لغيري مكاني ماوس القلب Transplantion

12.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51423

⸱

يونيو 23, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Collaborative Transplant Laboratory, University of Sydney

في هذه المقالة

ملخص

تم عرض تقنية لإجراء الجراحة المجهرية لزرع القلوب غير المتجانسة في الفئران ، بما في ذلك الطرق المبسطة لحصاد المتبرعين ومفاغرة الأوعية الدموية المتلقية.

الملخص

وغالبا ما تستخدم الفئران كما المانحين والمتلقين زرع القلب في دراسات علم المناعة زرع نظرا لمجموعة واسعة من الفئران المعدلة وراثيا والكواشف المتوفرة. ويرد صعوبة نظرا لصغر حجم الحيوان والتحديات التقنية المجهرية كبير من المتورطين في زرع القلب. على وجه الخصوص، نسبة عالية من عطل فني في وقت مبكر بعد زرع قد تنجم عن وفاة المستفيد ومضاعفات ما بعد الجراحة مثل الشلل أطرافه الخلفية أو القلب غير الضرب. هنا، ويتجلى تقنية كاملة لزرع قلب منتبذ الماوس، التي تنطوي على حصاد قلب المانحة وزرع لاحقا في الماوس المتلقي. يتم حصاد قلب المانحة التالية على الفور نضح في الموقع مع heparinized المالحة الباردة وtransection من الأبهر الصاعد والشريان الرئوي. العملية المتلقي ينطوي إعداد الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف السفلي (IVC)، تليهامفاغرة نهاية إلى جانب الشريان الأورطي مع الشريان الأورطي المانحة المتلقي باستخدام واحد على التوالي 10-0 خيط مجهري ومفاغرة مماثلة من الشريان الرئوي المانحة مع المتلقي IVC. بعد العملية يتم حقن الحيوان مع 0.6 مل تحت الجلد العادي المالحة وسمح لاسترداد على 37 درجة مئوية وسادة التدفئة. وتتلخص النتائج من 227 عملية زرع قلب فأر مع نسبة نجاح في 48 ساعة من 86.8٪. 13.2٪ الإخفاقات في غضون 48 ساعة، 5 (2.2٪) من ذوي الخبرة الشلل أطرافهم هند، 10 (4.4٪) كان له قلب غير الضرب، بسبب الكسب غير المشروع الإصابة الدماغية و / أو تخثر الدم، في حين توفي 15 (6.6٪) في غضون 48 ساعة .

المقدمة

يمكن أن النماذج الحيوانية من زرع الأعضاء تقديم معلومات قيمة لتحسين علاج مرضى زرع السريرية. نماذج الماوس مفيدة بشكل خاص لدراسة آلية المناعة من رفض زرع الأعضاء أو القبول نظرا لمجموعة واسعة من الفئران المعدلة وراثيا والكواشف محددة بالنسبة للفئران التي لا تتوفر لغيرها من النماذج الحيوانية 1-3. وهناك تحد مع نماذج الماوس من زرع هو حجم صغير من المانحين والمستفيدين والتي تتطلب مهارة فنية كبيرة لتحقيق نتائج مرضية.

وقد وصفت وهناك تقنية الأولى لزرع منتبذ القلوب في الفئران 4 التي تم تكييفها لاحقا لزرع القلب الماوس عن طريق كوري وآخرون 5. تشارك هذه التقنية إعداد المتلقي قبل العملية المانحة وليس نضح القلب المانحة، وكلاهما من المرجح أن يضر بقاء القلب المزروع أو رانه المتلقي. وقد استخدم على نطاق واسع الإجراء كما هو موضح في الأصل لدراسة آليات رفض الزرع والتسامح 6-8. وقد تكيفت الآخرين الفئران القلب الإجراء زرع الأصلي أونو وليندسي لزرع القلب في الفئران 9،10. مؤخرا، تم نشر تقنية لزرع القلب الماوس التي تغلبت على بعض المشاكل المرتبطة مع أسلوب كوري وآخرون 11. وصف بروتوكول هنا يتضمن تعديلات لدينا، على أساس طريقة موترام وآخرون 12، والتي تشمل: نضح في الموقع مع heparinized المالحة الباردة مباشرة بعد بضع الصدر وتنفيذ العملية المانحة قبل العملية المتلقي لتقليل وقت العملية المتلقي. بالإضافة إلى ذلك، ونحن نستخدم المشابك السفينة ارضحي صغيرة بدلا من 6-0 ربطات العنق الحريرية. على الرغم من أن المشابك السفينة لديها عيب من اتخاذ المزيد من المساحة التي هي أسهل للسيطرة من العلاقات، والتي ينبغي أن لا تكون ضيقة جدا أو فضفاضةوتكون أقل وضوحا لإزالة من المشابك. يستخدم أسلوب لدينا خياطة تشغيل واحد لسفينة مفاغرة، وإن كان في مراحل التعلم الأولية بديل هو استخدام الغرز البقاء في الداني والقاصي زوايا لضمان التوزيع المتساوي من الغرز، وبالتالي المباح من مفاغرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

قبل بدء التجارب، يجب الحصول على موافقة من لجنة الأخلاقيات رعاية الحيوان المؤسسة ذات الصلة من أجل التجارب المخطط لها. الحفاظ على الفئران في فقا لمتطلبات مؤسستك. تمت الموافقة على بروتوكول التالية من قبل لجان جامعة سيدني ومستشفى الأمير ألفريد الملكي.

قبل بدء الجراحة، يجب تنظيف جميع الصكوك جيدا وتعقيمها عن طريق نقع في الايثانول 80٪. بعض المؤسسات تشترط التعقيم ولكن هذا يمكن أن تلحق الضرر الأجهزة المجهرية الدقيقة على المدى الطويل. حيث إمكانية استخدام المعدات القابل للتصرف العقيمة.

1. التخدير

  1. تخدير الماوس مع isoflurane وفي حاوية مغلقة ثم وضعه مستلق على متن التشغيل، بسرعة يربط مخروط الأنف مخدر. اختبار كفاية التخدير بواسطة معسر القدم الخلفية لضمان عدم وجود رد الفعل.
  2. يحلق الجلد بشفرة الجراحية وتعقيم مع الايثانول 80٪. بالإضافة إلى ذلك، الكلورهيكسيدين 2٪ في 70٪ ايزوبروبيل يمكن استخدامها لتعقيم الجلد. أثناء التخدير isoflurane وتركيز 3٪ ولكن لحد هذا 1-1.5٪ للصيانة. إجراء تعديلات طفيفة على هذا التركيز للحفاظ على التنفس ومعدل ضربات القلب العادية. الحفاظ على درجة حرارة الحيوان على وسادة التدفئة.

2. عملية المانحة

  1. جعل بضع الصدر للكشف عن القلب والأوعية بقطع الصدر من خلال جانبي القفص الصدري من على حافة الضلع حتى الإبطين تليها قطع عرضية على مستوى xiphisternum لتشكيل جدار الصدر رفرف. رفع هذا رفرف فوق بجانب الرأس ويعلقون عليه إلى لوحة التشغيل. تمزيق التأمور لفضح القلب والأوعية.
  2. رفع الوريد الأجوف السفلي مع ملقط في يد واحدة والأخرى مع حقن 1 مل heparinized المالحة الباردة الأقرب إلى القلب من خلال IVC، ثم وضع المشبك الشريان صغيرة على IVC إلى المنعتدفق طن من حل نضح الخلفي من خلال ثقب الإبرة.
  3. باستخدام الشاش والقطن برعم، تتراجع قلب النزولي لفضح الأبهر الصاعد والشريان الرئوي. تمرير شفرة واحدة من زوج من microscissors من خلال قناة (الجيوب الأنفية عرضية) الخلفية إلى حزمة من الشريان الأورطي والشريان الرئوي والشريان الأورطي وقطع الشريان الرئوي معا بشكل أقصى حد ممكن لضمان طول كافية لمفاغرة.
  4. التعادل وتقسيم IVC، متفوقة الحق الوريد الأجوف (SVC)، غادر SVC والأوردة الرئوية باستخدام خيط الحرير 6-0. ربط IVC والحق SVC بشكل منفصل ثم وضع موضوع الخلفي واحدة إلى القلب لتطويق SVC ترك جنبا إلى جنب مع الأوردة الرئوية وادراك التعادل. حصاد القلب من موقع المانحة بقطع السفن البعيدة للعلاقات، ثم تخزينه في ملحي معقم الباردة عند 4 درجات مئوية حتى الزرع. هذه النتائج في وفاة المتبرع عن طريق استنزاف.

3. عملية مستلم

  1. تخديرالمتلقي على النحو الوارد أعلاه (القسم 1). يحلق بعناية لتجنب تهيج البطن، ثم جعل البطن عن طريق شق خط الوسط من العانة إلى xiphisternum وسحب باستخدام مشابك الورق عازمة على تشكيل الكامشات. التفاف الأمعاء في الحارة العقيمة المالحة غارقة الشاش والتراجع إلى الجزء العلوي الأيمن من البطن.
  2. لفضح الشريان الأورطي الأشعة تحت الكلوي وIVC، تحرير قطاعات المجمعة من الشريان الأورطي وIVC من الشريان الكلوي الأيسر والوريد إلى التشعب الحرقفي بقسمة لهم من السفن القطنية باستخدام جهاز الكي. الحرص على أن الكي هو في درجة الحرارة الصحيحة واستخدامها لفترة كافية لتقسيم وختم نهايات السفينة.
  3. تطبيق المشابك السفينة الصغيرة ارضحي إلى الشريان الأورطي وشرائح IVC بشكل أقصى وقريب. إجراء شق في الجدار الأمامي من الشريان الأورطي عن طريق ثقب أول حفرة بإبرة G 30؛ ثم قص شق عموديا مع microscissors لتتناسب مع حجم الشريان الأورطي المانحة. مسح التجويف الشريان الأورطي مع heparinized المالحة لإزالة أي BLجلطات العود.
  4. جلب قلب المانحة إلى موقع المتلقي مغطاة بشاش غارقة في المياه المالحة الباردة ووضعه على الجانب الأيمن من البطن. تأكد من وضعه الشريان الأورطي المانحة بجانب شق الشريان الأورطي على المتلقي والشريان الرئوي المانحة وضعه بجانب المتلقي IVC.
  5. يفاغر الشريان الأورطي المانحة نهاية إلى جانب إلى الشريان الأورطي باستخدام المتلقي تشغيل 10-0 الغرز النايلون بدءا من الزاوية القريبة وخياطة على طول الجانب الأيسر أولا حتى تصل إلى الزاوية البعيدة، في المرحلة التي يتم استدارة الحيوان من خلال 180 درجة. بلطف تحريك القلب المانحة إلى الجانب الأيسر من البطن لفضح الجانب الأيمن من الشريان الأورطي وتستمر خياطة من خلال الجانب الأيمن من جدار الشريان الأورطي من نهاية إلى نهاية القاصي الداني. قبل أن يغلق مفاغرة الشريان الأبهر، طرد بلطف لمعة مع heparinized المالحة لإزالة أي جلطة والهواء.
  6. يفاغر الشريان الرئوي المانحة (PA) نهاية إلى جنب مع المتلقي IVC. إجراء شق النسخةtically مع microscissors في الجدار الأمامي للIVC في موقع وفقا للمفاغرة الشريان. يفاغر الجهة المانحة للسلطة الفلسطينية إلى المتلقي IVC مع تشغيل 10-0 الغرز النايلون بدءا من النهاية البعيدة من الجدار الأيسر داخل تجويف IVC. بعد الوصول إلى نهاية الداني، لا تزال الغرز على طول الجبهة جدار الجانب الأيمن حتى نهاية البعيدة لإتمام مفاغرة. قبل أن يغلق مفاغرة، طرد بلطف لمعة لإزالة أي جلطات والهواء.
  7. قبل الافراج عن السفينة والمشابك، وقطع مكان جلفوم حول المواقع مفاغرة، وتطبيق ضغط لطيف مع قضيب من القطن حتى يتم تحقيق الإرقاء. في ذلك الوقت من إعادة التوعي، والإفراج عن المشبك القاصي الأولى، تليها المشبك الداني.
  8. بعد عودة التوعي، وتطبيق المالحة الدافئة عند 37 درجة مئوية إلى الكسب غير المشروع من الخارج للمساعدة في التعافي. الكسب غير المشروع وعادة ما يبدأ الرجفان فورا ويعود تلقائيا إلى إيقاع الجيوب الأنفية في غضون بضع دقائق. حقن 0.6 مل دافئالمالحة تحت الجلد للحفاظ على الماء من المستلم. حقن تحت الجلد لتسكين البوبرينورفين قبل الانتهاء من عملية جراحية
  9. إغلاق الجرح في البطن مع واحدة 5-0 على التوالي خياطة للامتصاص لكل من طبقات. تبدأ من خلال استكمال الطبقة الداخلية ومواصلة السير على الجلد.

4. الإنعاش والكسب غير المشروع الرصد

  1. حقن الأمبيسلين للوقاية من العدوى ووضع المتلقي على وسادة التدفئة على 37 درجة مئوية لمدة الانتعاش. معظم الحيوانات استرداد بسرعة، وعادة ما الشرب والأكل في كثير من الأحيان خلال 3 ساعة. إذا تبين الماوس علامات الضائقة، ودراسة عن كثب لتحديد السبب. إذا لم يكن هناك سبب واضح، وعلاج مع البوبرينورفين ومراقبة عن كثب. استشارة الطبيب البيطري إذا ظهرت أعراض شديدة أو تستمر أكثر من 8 ساعات والنظر في القتل الرحيم. إذا لزم الأمر، وإعطاء الحقن المستمر 12 ساعة من البوبرينورفين حتى حل الأعراض. إذا تبين الماوس علامات الضائقة بعد 8 ساعات، وإعطاء المستمرة 12الحقن ساعة من البوبرينورفين حتى حلها. استشارة الطبيب البيطري إذا استمرت الأعراض لأكثر من 48 ساعة والموت ببطء إذا لزم الأمر.
  2. مراقبة الكسب غير المشروع ضربات القلب عن طريق ملامسة البطن مباشرة وتسجيل قوة ضربات كما + + + + لالكسب غير المشروع صحية ل+ لضعف ضربات بسبب رفض المتقدمة و- على أنها غير الضرب بسبب إكمال رفض الكسب غير المشروع. رصد الفئران يوميا خلال 10 يوما الأولى، ثم 3X في الأسبوع لمدة التجربة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد فترة التدريب الأولي، تم تحليل 227 حالة من حالات الماوس منتبذ زرع القلب في مجموعتنا. كان معدل النجاح في أول 24 ساعة 90.3٪ و في 48 ساعة كان 86.8٪. من 30 (13.2٪) فشل في غضون 48 ساعة، 5 (2.2٪) من ذوي الخبرة أطرافهم الشلل الخلفيتين وكان لا بد من الموت الرحيم، وكان 10 (4.4٪) غير القلب النابض بسبب الاصابة الكسب غير المشروع نقص التروية و / أو تخثر الدم، في حين 15 (6.6٪) توفي في غضون 48 ساعة. وتظهر بعض الاحياء الكسب غير المشروع التجريبي في الجدول 1 مع مجموعة متنوعة من ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الماوس زرع القلب هي طريقة صعبة المجهرية التي تتطلب مهارة جراحية كبيرة لسيده. الجانب الأكثر تحديا هو قطر صغيرة من السفن. بالإضافة إلى ذلك، فمن الضروري للحد من المستلم وقت العملية والنزيف. وقد وصفت هذه التقنية لزرع القلب الماوس أول من كوري وآخرون. في عام 1973 وبعد ذلك موترام وآخرون 12. وتشمل التعديلات لدينا النقاط التالية. أولا، نضح على الفور من القلب المانحة مع heparinized المالحة الباردة التالية بضع الصدر وtransection من الشريان الأورطي والشريان الرئوي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC) في أستراليا منح المشروع 1029205، من قبل مؤسسة Microsearch من أستراليا، ومؤسسة Myee كودرينغتون البحوث الطبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجهر التشغيل Leica, Heerbrugg, SwitzerlandM65110-25X آلة
التخدير المكبر Vet Quip Pty Ltd ، سيدني ، أسترالياVett3قادرة على توصيل مزيج من الأيزوفلوران والأكسجين في الهواء   ؛
مجلس التشغيل متجر لاجهزة الكمبيوتر أو موردالفلين الكثيف أو الاصطناعية قادرة على أخذ دبابيس
محلول ملحي هيبارين (5 وحدة / مل ، 4 درجة ؛ ج)شركة فايزر ، الولايات المتحدة الأمريكيةFW25في حقنة 1 مل مع إبرة 23 جم على الثلج
محلول ملحي عادي (37 درجة ؛ ج)AstraZeneca Pty Ltd ، أستراليا4538في حقنة 1 مل مع إبرة 23 جم على وسادة
دافئة خيوط 10- نايلون ، 5-0 VicrylEthicon، Inc. نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية2870G / J421H
Buprenorphine (0.05 مجم / كجم في محلول ملحي 0.1 مل)ريكيت بينكيزر ، سيدني ، أستراليافي حقنة 1 مل مع إبرة 23 جم على الثلج
أمبسيلين (5 مجم / كجم في محلول ملحي 0.1 مل)أسبن ، سيدني ، أستراليافي حقنة 1 مل مع إبرة 23 جرام على ثلج
جل رغوةفارماسيا & شركة Upjohn Co. الولايات المتحدةالأمريكية 801289304مقطعة إلى قطع صغيرة
جهاز كي بدرجة حرارة عاليةMedtronic ، الولايات المتحدة الأمريكية8444000
وسادة تسخين / درجة الحرارة اليمنىكينت العلمية ، تورينجتون ، CT 06790
<قوي >أدوات الجراحة المجهرية: < / قوي>Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. ،   ؛  
Microneedleholdersشنغهاي ، الصينWT2020
Microscissors        "                  "WT1020
Microlegps (طرف مستقيم)        "                  "الملقط الدقيق WA3010
(طرف منحني)        "                  "WA3020
مشابك البعوض الصغير (1 زوج)  ؛       "                  "W40350
المشابك الرضحية للأوعية الدقيقة (1 زوج)  ؛       "                  "W40130 / W40150
المكاتب شركة

المراجع

  1. Aramaki, O., et al. Interleukin-10 but not transforming growth factor-beta is essential for generation and suppressor function of regulatory cells induced by intratracheal delivery of alloantigen. Transplantation. 79, 568-576 (2005).
  2. Chen, R. H., Bushell, A., Fuggle, S. V., Wood, K. J., Morris, P. J. Expression of granzyme A and perforin in mouse heart transplants immunosuppressed with donor-specific transfusion and anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 61, 625-629 (1996).
  3. Poulin, L. F., et al. Interleukin-9 promotes eosinophilic rejection of mouse heart allografts. Transplantation. 76, 572-577 (2003).
  4. Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57, 225-229 (1969).
  5. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
  6. Larsen, C. P., et al. CD40-gp39 interactions play a critical role during allograft rejection. Suppression of allograft rejection by blockade of the CD40-gp39 pathway. Transplantation. 61, 4-9 (1996).
  7. Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61, 1642-1647 (1996).
  8. Callaghan, C. J., et al. Regulation of allograft survival by inhibitory FcgammaRIIb signaling. J. Immunol. 189, 5694-5702 (2012).
  9. Qian, S., et al. Impact of donor MHC Class I or Class II antigen deficiency on first- and second-set rejection of mouse heart or liver allografts. Immunology. 88, 124-129 (1996).
  10. Wang, C., et al. Spontaneous acceptance of mouse kidney allografts is associated with increased Foxp3 expression and differences in the B and T cell compartments. Transpl. Immunol. 24, 149-156 (2011).
  11. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic Heart Transplantation in Mice. J. Vis. Exp. , (2007).
  12. Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovasc. Res. 22, 315-321 (1988).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة