استهداف الخلايا المقيمين في الدماغ لإعادة برمجة المباشر النسب-يقدم آفاقا جديدة للإصلاح الدماغ. نحن هنا وصف بروتوكول لكيفية إعداد الثقافات المخصب لpericytes المقيمين في الدماغ من الكبار قشرة الدماغ البشري وتحويل هذه الخلايا العصبية إلى الناجمة عن الفيروس الارتجاعي بوساطة تعبير عن عوامل النسخ Sox2 وAscl1.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
النسب-إعادة برمجة الخلايا المشتقة من خلية حوطية الدماغ البشري الكبار في الخلايا العصبية المستحثة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مباشر النسب-إعادة برمجة الخلايا غير العصبية إلى الخلايا العصبية التي يسببها (INS) قد توفر نظرة ثاقبة لآليات الجزيئية الكامنة وراء تكوين الخلايا العصبية وتمكين استراتيجيات جديدة لنمذجة في المختبر أو إصلاح الدماغ المريضة. تحديد أنواع الخلايا غير العصبية المقيمين في الدماغ قابلة للتحويل المباشر في دائرة الهجرة والتجنيس قد تسمح لإطلاق مثل هذا النهج في الموقع، أي داخل أنسجة المخ التالفة. نحن هنا وصف بروتوكول وضعت في محاولة لتحديد الخلايا المشتقة من الدماغ البشري الكبار التي تلبي هذه الفرضية. هذا البروتوكول ينطوي على: (1) زراعة الخلايا البشرية من القشرة المخية التي تم الحصول عليها من الخزعات الدماغ البشري الكبار؛ (2) التوسع في المختبر (التي تتطلب حوالي 2-4 أسابيع) وتوصيف الثقافة التي كتبها كيمياء سيتولوجية مناعية والتدفق الخلوي؛ (3) إثراء من قبل الخلية مضان تنشيط الفرز (FACS) استخدام الألغام المضادة للPDGF مستقبلات β والأجسام المضادة للCD146؛(4) تنبيغ بوساطة الارتجاعي مع النسخ العصبية عوامل sox2 وascl1؛ (5) وأخيرا توصيف الخلايا العصبية الناتجة المشتقة من خلية حوطية يسببها (PdiNs) من قبل كيمياء سيتولوجية مناعية (14 يوما إلى 8 أسابيع بعد تنبيغ فيروسات). في هذه المرحلة، يمكن أن دائرة الهجرة والتجنيس سيتم بحثها لخصائصها الكهربائية عن طريق تسجيل التصحيح، المشبك. يوفر هذا البروتوكول إجراء تكرار للغاية لفي المختبر النسب تحويل pericytes المقيمين في الدماغ الإضافية الإنسان الوظيفية.
المقدمة
بدلا من إعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى خلايا الجذعية المحفزة (iPSCs)، والتي بدورها وهبوا مع مجموعة كبيرة من إمكانات التمايز، وتهدف إعادة برمجة المباشر للتحويل مباشرة من نوع واحد خلية معينة إلى أخرى. فيما يتعلق تطبيقها في سياق النمذجة المرض والعلاجات المستندة إلى الخلايا المحتملة، كلا النهجين إعادة برمجة لديها مزايا وعيوب محددة. إعادة برمجة في iPSCs (ط) يوفر مصدرا غير محدود تقريبا من الخلايا؛ (ب) يسمح للهندسة الوراثية؛ (ج) يمنح مع احتمال التمايز غير محدودة تقريبا. ومع ذلك، العيوب الرئيسية لiPSCs تنطوي على خطر tumorigenicity من خلايا غير متمايزة (تشكيل مسخي في الجسم الحي) والحاجة إلى فيفو السابقين زراعة وزرع اللاحقة إذا كانت هذه الخلايا هي لاستخدامها في العلاجات المستندة إلى الخلايا. على العكس، يقتصر المباشر النسب-إعادة برمجة من العائد أقل من الخلايا المطلوبوالذي يرتبط مباشرة مع عدد من الخلايا المستهدفة من السكان بدءا، ولكن تمتلك ميزة أن تظهر الخلايا التي أعيدت برمجتها النسب لعرض أي خطر على مكون للأورام زرع 1،2؛ علاوة على ذلك، يمكن حتى يتحقق إعادة برمجة مباشرة في الموقع، أي داخل الجهاز حيث ستلزم هذه الخلايا، وبالتالي تجنب الحاجة إلى الزرع.
مع هذا في الاعتبار، مختبرنا اتبعت إمكانية خلايا الدماغ مقيم إعادة برمجة النسب في دائرة الهجرة والتجنيس كما نهجا جديدا نحو العلاجات المستندة إلى الخلايا من أمراض الاعصاب. تتكون خلايا الدماغ المقيمين التي قد يحتمل اعتباره أهداف الخلوية لإعادة برمجة النسب-أنواع مختلفة من الدبق الكبروي (الخلايا النجمية، وخلايا NG2 و oligodendrocytes)، الخلايا الدبقية الصغيرة، وخلايا المرتبطة microvessel (الخلايا البطانية وpericytes). درسنا على نطاق واسع لإعادة برمجة المحتملة في المختبر من دبق نجمي الخلايا الدماغية من مجلس النوابتكس في وقت مبكر بعد الولادة الفئران 3-5. بحثا عن مصادر خلية مناسبة مماثلة لمباشرة النسب-إعادة برمجة الدماغ في الإنسان البالغ، ونحن اجه السكان الخلية التي يمكن برمجتها بنجاح في دائرة الهجرة والتجنيس والدمغات المعرض من pericytes. نحن هنا وصف بروتوكول لكيفية جني هذه الخلايا من الخزعات الدماغ البشري الكبار، لتوسيع وإثراء هذه الخلايا في المختبر، وأخيرا إعادة برمجة بنجاح جزء كبير من هذه الخلايا في المختبر الموسعة (في حدود 25-30٪) في دائرة الهجرة والتجنيس. لا يمكن أن يتحقق عن طريق إعادة برمجة وقت واحد بوساطة الارتجاعي شارك في التعبير عن اثنين من عوامل النسخ، sox2 وascl1. تم العثور على هذه PdiNs لاكتساب قدرة العمل المتكررة إطلاق إمكانات لخدمة أهداف ومتشابك أما الخلايا العصبية الأخرى مما يدل قدرتها على الاندماج في الشبكات العصبية. يوفر بروتوكول لدينا إجراءات واضحة لعزل ونسب التحويل من pericytes الدماغ البشري الكبار في دائرة الهجرة والتجنيس.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. عزل والتثقيف من خلايا الدماغ البشري الكبار
يجب أن يتم تنفيذ التجارب التي تنطوي على الأنسجة البشرية وفقا لجميع الأنظمة الحكومية والمؤسسية ذات الصلة فيما يتعلق باستخدام المواد البشرية لأغراض البحث. وقد تم تطوير هذا البروتوكول وفقا لموافقة اللجنة الأخلاقية لكلية الطب في جامعة ميونيخ ميونيخ وموافقة خطية أبلغ من جميع المرضى.
وقد أنشئ هذا البروتوكول الثقافات إعداد من الكبار قشرة الدماغ البشري باستخدام عينة من المرضى من كلا الجنسين يعانون من الصرع الفص الصدغي أو غير مؤلمة الآفات الأخرى عميقة الجذور، غير الخبيثة. ويعتبر النسيج التي تم الحصول عليها من غرفة العمليات الجراحية تتألف حصرا القناة الوصول إلى آفة الدماغ وبالتالي صحية. كانت الفئة العمرية من المرضى 19-70 سنة.
- إعداد النمو المتوسطة بإضافة الحرارة المعطل مصل العجل الجنين(FCS) لDMEM الجلوكوز عالية مع GlutaMAX للحصول على تركيز النهائي من 20٪ FCS. إضافة 5 مل البنسلين / الستربتوميسين إلى ما مجموعه 500 مل متوسطة النمو. تنفيذ هذه الخطوات اللاحقة وجميع الظروف التي تتطلب ثقافة عقيمة في غطاء تدفق الصفحي المناسبة.
- الحفاظ على خزعة الدماغ البشري الكبار الحصول عليها من غرفة العمليات الجراحية في هانكس "محلول ملحي متوازن مع و CaCl 2 و MgCl 2 (HBSS) المتوسطة بما في ذلك HEPES (10 ملي تركيز النهائي) على الجليد حتى المعالجة. بدء معالجة في أقرب وقت ممكن.
- لبدء التفكك إلى خلايا واحدة، ونقل الأنسجة في طبق بتري 65 مم واللحم المفروم إلى قطع صغيرة باستخدام المشارط اثنين معقمة تستخدم مرة واحدة. لاستخدام الهضم الأنزيمي 3-6 مل TrypLE في أنبوب 15 مل المخروطية واحتضان لمدة 15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- إضافة 1 حجم prewarmed المتوسطة النمو لتسهيل التفكك ويسحن بلطف محلول يحتوي على قطعة نسيج صعودا وهبوطا باستخدام الأولى5 مل ماصة للتصرف، تليها باستخدام ماصة باستير الزجاج حتى تجانس تعليق الخلية. عادة، وبعض القطع الأنسجة المتبقية، والتي تتكون في معظمها من المادة البيضاء، سوف تبقى في التعليق.
- تدور باستمرار في 157 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend بيليه في كمية مناسبة من النمو المتوسط (10 مل لكل ثقافة غير المصقول T75 القارورة). استخدام أحد T75 قارورة الثقافة لخزعة من 5-10 مم في الحجم واستقراء من هذا في حالة العينات الكبيرة.
- وضع الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 5٪ O 2.
- استبدال نصف المتوسط كل 3-4 أيام حتى وصلت الخلايا confluency. هذا عادة ما يستغرق فترة تصل إلى أسبوعين (المشار إليها باسم مرور 0 [P0]).
2. في المختبر التوسع وتوصيف خلايا الدماغ البشري الكبار
- في التوسع المختبر:
- نضح مستنبت ويغسل مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وأبقى في غرفة رemperature، قبل أن يضيف 3 مل TrypLE.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق حتى معظم خلايا منفصلة. بلطف الاستفادة من القوارير لتسهيل رفع الخلايا؛ بعد إضافة 3 مجلدات متوسطة النمو، ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل وتدور باستمرار في 157 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend الخلايا في كمية مناسبة من النمو المتوسط.
- مرور الخلايا في نسبة 1:3 لمحصول الأمثل في قوارير جديدة خلية ثقافة T75.
ملاحظة: لقد passaged هذه الخلايا حتى P5 دون أي علامات على انخفاض الكفاءة إعادة برمجة. بينما في P0 ثقافة يحتوي على جزء كبير من الخلايا البطانية (وفقا لتقييم CD34 التعبير)، في المقاطع اللاحقة يصبح عددهم لا يذكر.
- توصيف الثقافات الدماغ البشري الكبار:
- كيمياء سيتولوجية مناعية:
- لتوصيف الخلايا، وبذور ~ 60،000 الخلايا على بولي-D-يسين المغلفة غطاء زجاجي ينزلق في 500 ميكرولتر واسطة نمو جديدةم في 24 جيدا لوحات زراعة الأنسجة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 5٪ O 2.
- لتحليل immunocytochemical من خلايا الدماغ البشري مثقف إزالة المتوسطة وغسل 3X مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نقل غطاء زجاجي ينزلق الى غرفة تلطيخ مرطب مناسب ومنع مع 80 ميكرولتر PBS تحتوي على 3٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة الأجسام المضادة الأولية مخففة في نفس الحل (للعوامل التخفيف انظر الجدول من الكواشف والمعدات محددة)، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: A جزء كبير ولكن متفاوتة من الخلايا في هذه المرحلة من زراعة هي مناعيا للنمو β مستقبلات عامل المستمدة من الصفائح الدموية (PDGFRβ)، مجموعة من التمايز 146 (CD146)، NG2 كبريتات شوندروتن PROTEOغليكان، وأكتين العضلات الملساء (SMA)، أي علامات مميزة للpericytes المرتبطة microvessel. أقلية فقط (<1٪) عن علامات astroglial الدبقية ييفي الحمضية البروتين (GFAP) وS100β. علاوة على ذلك، في هذه المرحلة يجب أن تكون ثقافة خالية من أي خلايا معربا عن العصبية علامة βIII-تويولين. استخدام عدة تركيبات الأجسام المضادة الأولية لاشتراكهما في وضع العلامات من علامات مختلفة. مزيد من التأكيد للتعبير عن الدبقية، الخلايا العصبية، والبطانية خلية حوطية علامات يمكن الحصول على النسخ العكسي والكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (وليس وصفها في هذا البروتوكول). - بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية يغسل ثلاث مرات مع 1 مل PBS وإضافة الأجسام المضادة الثانوية المقابلة (في التخفيفات المناسبة) إلى حل تلطيخ واحتضان 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. غسل الخلايا 3X مع برنامج تلفزيوني. إذا لزم الأمر، وذلك قبل التركيب تشمل تلطيخ مع دابي لمدة 5 دقائق في غرفةدرجة الحرارة.
- استخدام antifading تصاعد المتوسطة وتحليل زلات الغطاء باستخدام المجهر epifluorescence أو المجهر متحد البؤر.
- التدفق الخلوي:
- لتحليل السطح علامة التعبير باستخدام التدفق الخلوي، وتنمو الخلايا لconfluency في T25 T75 غير المصقول أو قوارير خلية ثقافة.
- فصل الخلايا باستخدام TrypLE كما هو موضح من قبل وresuspend في حل تلطيخ تتكون من برنامج تلفزيوني + 0.5٪ BSA. في رد فعل تلطيخ، في resuspend 100،000-200،000 الخلايا في 100 ميكرولتر من الحل تلطيخ. إعداد ردود الفعل تلطيخ واحد لكل الأجسام المضادة المستخدمة (CD146-FITC، CD140b-PE، CD34-APC، CD13-FITC، والأجسام المضادة isotype السيطرة منهما).
- إضافة الأجسام المضادة تألقي مترافق إلى كل حل تلطيخ (لالتخفيفات انظر الجدول من الكواشف والمعدات الخاصة) مباشرة في تعليق خلية واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
- غسل الخلايا ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني وتدور باستمرار بين كلخطوة الغسيل في 157 x ج لمدة 5 دقائق.
- resuspend الكرية خلية في حل 0.5-1 مل تلطيخ الخلايا ونقل من خلال مصفاة الخلية (70 ميكرومتر) إلى أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية. حماية عينة من التعرض للضوء.
- عينات دوامة قبل وضعها في الصك نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- لتحليل الخلايا الحية واستبعاد الحطام والركام الخلية، بوابة FSC-A وSSC-A. هي بوابات duplets الخلايا على وجه التحديد من قبل FSC-A وFSC-W. لتحديد الظروف النابضة الصحيح للعلامات سطح الخلية تعيين البوابات مع التحكم الضد مطابقة نمط إسوي مترافق إلى تألقي منها. ثم تحديد نسبة الخلايا محددة الأجسام المضادة.
- كيمياء سيتولوجية مناعية:
3. إثراء للخلايا خلية حوطية المستمدة من قبل خلية الإسفار المنشط الفرز
- تنقية السكان الخلية خلية حوطية (معلق في النمو متوسطة) قبل تنبيغ عبر نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز باستخدام فوهة 70 ميكرون. استخدام CD34-APC بالاشتراك مع CD140b-PE-CD146 وFITC لتحديد لpericytes. الفرز لل-CD34 السلبية، خلايا CD140b، وCD146 إيجابية.
- جمع الخلايا فرزها في متوسطة النمو وعلى لوحة بولي-D-يسين المغلفة غطاء زجاجي ينزلق في 24 جيدا لوحات زراعة الأنسجة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 5٪ O 2.
- 48 ساعة بعد فرز استبدال المتوسطة مع المتوسطة النمو الطازجة وأداء تنبيغ كما هو موضح في البروتوكول 4.
4. فيروسات الرجعية تنبيغ من الخلايا المشتقة من خلية حوطية وإعادة برمجة الخلايا العصبية في المستحثة
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى المبادئ التوجيهية للسلامة الأحيائية المحلية عند التعامل مع جسيمات فيروس. في ألمانيا استخدام الفيروسات القهقرية المستخدمة هنا تتطلب مستوى السلامة الحيوية 2. لإنتاج جزيئات فيروس الرجوع إلى بروتوكول 6. ليبني فيروسات المستخدمة لإعادة البرمجة، راجع Karow وآخرون (2012). وكانت الفيروسات القهقرية pseudotyped مع VSV-G (التهاب الفم الحويصلي الفيروسات غليكوالبروتين) 5. لإنتاج يرجى الرجوع إلى غافريلسكو وآخرون 6.
- 24 ساعة قبل البذور تنبيغ فيروسات ~ 60،000 الخلايا على بولي-D-يسين المغلفة غطاء زجاجي ينزلق في 500 ميكرولتر المتوسطة النمو الطازجة في لوحات جيدا 24 زراعة الأنسجة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 5٪ O 2 .
- في اليوم التالي، استبدال المتوسطة النمو مع 500 ميكرولتر الطازجة والمتوسطة النمو prewarmed وإضافة 1 ميكرولتر من supernatants تتركز منها تحتوي على جزيئات فيروس (pCAG-IRES dsred للسيطرة، وخصوصا خلال إنشاء البروتوكول في المختبر)، pCAG-ascl1 -IRES dsred، pCAG-sox2-IRES-GFP.
- في وقت لاحق يوم واحد، وإزالة المتوسطة بما في ذلك الجزيئات الفيروسية من الخلايا وإضافة 1 مل الطازجة، prewarmed B27-التمايز المتوسطة، ويتألف من 49 مل DMEM الجلوكوز عالية مع GlutaMAX و 1 مل B27 المصل خالية الملحق. الحفاظ على الخلايا في الثقافة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 و 5٪ O 2 لمدة 4-8 أسابيع دون تغيير المتوسطة وتصبح التغييرات المتكررة المتوسطة الضارة كما INS تنضج.
5. توصيف الخلايا العصبية المستحثة بواسطة كيمياء سيتولوجية مناعية
- لتحديد هوية الخلوية للخلايا transduced، ولا سيما للتدليل على الاستحواذ على النمط الظاهري العصبية، نفذ مناعية ضد مستضدات الخلايا العصبية مثل bIII-تويولين، MAP2، وNeuN (عن الأجسام المضادة والتخفيفات كل منها، انظر الجدول الكواشف محددة و المعدات؛ اتباع نفس الإجراء كما هو مبين في 2.2.1).
- لتحسين نضوج PdiNs، وشارك في ثقافة هذه الخلايا مع الخلايا العصبية المشتقة من E14 الماوس القشور الدماغي. تحقيقا لهذه الغاية، تشريح قشرة الدماغ وفصل الأنسجة ميكانيكيا مع كوب باستور ماصة مصقول النار. إضافة 10،000-50،000 الخلايا العصبية الفئران على الثقافات من الخلايا المشتقة من خلية حوطية 2-3 أسابيع التالية تنبيغ مع sox2 وascl1 إعادة ترميزtroviruses ومواصلة زراعة. خلايا Transduced يمكن تمييزها عن الخلايا العصبية الفئران بحكم مراسل (GFP وdsRed) التعبير، إما عن طريق epifluorescence حية أو التالية للكيمياء سيتولوجية مناعية GFP وdsRed.
- لتقييم تكوين نقاط الاشتباك العصبي على PdiNs بواسطة الخلايا العصبية الفئران، نفذ مناعية ضد مستقبلات الناقل العصبي الحويصلي مثل نقل الغلوتامات الحويصلي 1 (vGluT1).
- بحث الخلايا transduced لخصائصها الكهربائية (أي القدرة على توليد إمكانات العمل) وإنشاء نقاط الاشتباك العصبي وظيفية من قبل التصحيح، المشبك الكهربية. للاطلاع على تفاصيل الإجراء نرى هاينريش آخرون (2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
والنتيجة الأولى لهذا البروتوكول بعد بنجاح إرساء ثقافة من عينة من الكبار الإنسان قشرة الدماغ يتكون في تحديد تركيبة الخلوية للثقافة. كيمياء سيتولوجية مناعية لبروتينات معينة نوع من الخلايا يكشف عن درجة كبيرة من التجانس بين الثقافات المستمدة من عينة من المرضى مختلفة (الشكل 1A). كما كميا بواسطة التدفق الخلوي هناك دائما جزء كبير من الخلايا التي تعبر عن PDGFRβ (في المتوسط ~ 75٪، وتتراوح بين 30 إلى ما يصل إلى 99٪)؛ وعادة ما يتم التعبير عن علامات أخرى من pericytes مثل CD...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول التوسع في المختبر وإثراء الخلايا المشتقة من خلية حوطية التالية بمعزل عن الكبار قشرة الدماغ البشري وتحويل اللاحقة في دائرة الهجرة والتجنيس من قبل بوساطة التعبير الارتجاعي من النسخ العصبية عوامل Sox2 وAscl1. يوفر هذا البروتوكول تجريبية في نظام المختبر لدراسة نسب التحويل للخلايا المقيمين في الدماغ في الخلايا العصبية، وربما أيضا الدبقية، مع الهدف في الاعتبار أن تترجم في نهاية المطاف هذا النهج التحويل المباشر في الجسم الحي في وضع ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
نحن ممتنون للدكتور ماغدالينا غوتس لإدخال لها خلال تطوير هذا البروتوكول. نشكر الدكتور ماريوس Wernig (جامعة ستانفورد) لتزويدنا بسخاء مع تسلسل sox2 الترميز. ونحن أيضا ممتنون جدا للدكتور الكسندرا Lepier لإنتاج الفيروس. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من تلقى الفنون إلى MK [بكس] وبتمويل من SYSTHER-ثنائية القومية جمعية الألمانية للبحوث (BE 4182/2-2) وBMBF (01GN1009A) إلى BB، وزارة ولاية بافاريا للعلوم والبحوث و INREMOS المعهد الافتراضي (الألمانية والسلوفينية الوزارات الاتحادية للتعليم والبحوث) وDFG (SFB 824).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 558821 استخدام مضاد CD140b-PE | BD Biosciences | 1: 100 | |
| مضاد CD146-FITC | ABD Serotec | MCA2141FT | استخدام 1: 100 |
| مضاد CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | استخدام 1:100 |
| مضاد ل CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | استخدام 1: 100 |
| مضاد PDGFR & beta ؛ | استخدام إشارات الخلية | 3169S | 1: 200 |
| مضاد ل CD146 | Abcam | Ab75769 | استخدام 1: 400 |
| مضاد ل NG2 | Millipore | AB5320 | استخدام 1: 400 |
| مضاد ل SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | استخدام 1: 400 |
| مضاد للبيتا ؛ III-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | استخدام 1: 400 |
| مضاد ل MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | استخدام 1: 200 |
| مضاد ل GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | استخدام 1: 600 |
| مضاد ل GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | استخدام 1: 1،000 |
| مضاد لطلب تقديم | Chromotek | 5F8 | استخدام 1: 500 |
| مضاد ل S100 & بيتا ؛ | يستخدم Sigma-Aldrich | S2532 | 1: 300 |
| مضاد ل NeuN | Millipore | MAB377 | يستخدم 1: 200 |
| مضاد ل GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | يستخدم 1: 500 |
| مضاد لكالريتينين | Millipore | AB5054 | يستخدم 1: 500 |
| مضاد ل vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | استخدام 1: 1,000 |
| النمط المتشاوي Rat IgG1 FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | استخدم 1: 100 |
| النمط المتشاوي للجرذ IgG1 PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | استخدم 1: 100 |
| التحكم في النمط النظيري للفأر IgG1 APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | استخدام 1: 100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 مكمل خال من المصل | Invitrogen | 17504044 | |
| مصل ربلة الساق الجنينية | Invitrogen | 10106-169 | إجراء تعطيل الحرارة عن طريق الحضانة عند 56 درجة ؛ C لمدة 30 دقيقة |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (محلول الملح المتوازن Hanks) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS بدون CaCl2< / sub> و MgCl2< / sub> (D-PBS ، 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine هيدروبروميد (PDL) | سيجما ألدريتش | P0899 | |
| PFA (بارافورمالدهايد) | سيجما ألدريتش | P1648 | |
| ألبومين مصل الأبقار | سيجما ألدريتش | A9418 | |
| تريتون X-100 | سيجما ألدريتش | T9284 | |
| DAPI (4 & prime ؛ ، 6-Diamidin-2-phenylindole) ثنائي اللاكتات | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly / جبل | بوليساينس | 18606-20 | |
| أنابيب البولي بروبيلين المستديرة القاع | BD Biosciences | 352063 | |
| أنابيب البوليسترين المستديرة القاع مع غطاء مصفاة الخلية ؛ | بي دي بيوساينسز | 352235 | |
| 24 بئر ألواح | أورانج ساينتفيك | 5530305 | |
| 75 سم < سوب > 2 < / سوپ > قوارير ثقافة | جرينر بيو ون | 658175 | |
| 25 سم < سوب > 2 < / سوپ > قوارير ثقافة | جرينر بيو ون | 690175 | |
| ماصات يمكن التخلص منها 10 مل | سارستيدت | 86.1254.001 | |
| باستور زجاجي ماصات (150 مم) | أغطية زجاجية | FB50251 | |
| بقطر 12 مم | Menzel | CB00120RA1 | |
| مشارط جراحية يمكن التخلص منها | أطباق | الأنسجة 5518083 | |
| براون | Greiner Bio-One | 633180 | |
| أنابيب مخروطية 15 مل | BD Biosciences | 352095 | |
| مركزي لغطاء التدفق | |||
| الصفحي ودوار متأرجح مع محولات لأنابيب 15 مل و 50 مل | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| فارز خلايا قياس التدفق: FACSAria l مع برنامج FACSDiva | BD Biosciences | ||
| حاضنة زراعة الخلايا المرطبة | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather حمام عند 37 درجة ؛ C | |||
| FACSFسائل غمد منخفض | BD Biosciences | 342003 | |
| مجهر التألق BX61 | مجهر أوليمبوس | ||
| متحد البؤر LSM710 | زايس |
المراجع
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
