ScanLag هي طريقة عالية الإنتاجية لقياس التأخير في النمو ، أي وقت التأخر ، بالإضافة إلى معدل نمو المستعمرات لآلاف الخلايا بالتوازي. يتيح الفحص باستخدام ScanLag التمييز بين وقت التأخير الطويل والنمو البطيء على مستوى متغير واحد.
مقالة منهجية
ScanLag: عالية الإنتاجية الكمي لمستعمرة النمو والفارق الزمني
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ديناميكيات النمو هي الخصائص الأساسية للكائنات الحية الدقيقة. يعد تحديد النمو بدقة هدفا مهما في علم الأحياء الدقيقة. تتأثر ديناميكيات النمو بوقت مضاعفة الكائنات الحية الدقيقة وأي تأخير في النمو عند الانتقال من حالة إلى أخرى ، التأخر. تتيح طريقة ScanLag توصيف هاتين الخاصيتين المستقلتين على مستوى المستعمرات التي تنشأ كل منهما من خلية واحدة ، مما يولد توزيعا ثنائي الأبعاد لوقت التأخر ووقت النمو. في ScanLag ، يتم قياس الوقت الذي يستغرقه اكتشاف المستعمرات على ألواح أجار المغذيات التقليدية تلقائيا على مجموعة من الماسحات الضوئية التجارية التي يتم التحكم فيها بواسطة تطبيق داخلي. يتم وضع أطباق بتري على الماسحات الضوئية ، ويحصل التطبيق على الصور بشكل دوري. ثم يتم إجراء التحليل الآلي لنمو المستعمرة عن طريق تطبيق يعيد وقت الظهور ومعدل النمو لكل مستعمرة. يمكن استخراج معلمات أخرى ، مثل شكل المستعمرة وملمسها ولونها ، لرسم خرائط متعددة الأبعاد للمجموعات الفرعية للخلايا. أخيرا ، تتيح الطريقة استرجاع المتغيرات النادرة ذات الأنماط الظاهرية المحددة للنمو لمزيد من التوصيف. يمكن تطبيق هذه التقنية في علم الجراثيم لتحديد التأخر الطويل الذي يمكن أن يسبب ثبات المضادات الحيوية ، بالإضافة إلى تقنية عامة منخفضة التكلفة لفحوصات النمط الظاهري.
المقدمة
وقد تطورت البكتريا للرد على العديد من الظروف المجهدة. وثمة سمة عامة من التكيف مع الإجهاد هو تغيير في ديناميات النمو 1،2. وتتميز ديناميات النمو في الغالب من قبل معلمتين: معدل النمو الأسي والوقت الضائع، أي الوقت اللازم للتكيف مع الظروف الجديدة. في حين أن عددا كبيرا من أساليب إنتاجية عالية التركيز على قياسات معدل النمو، وتأخر الوقت غالبا ما تكون المعلمة تجاهلها، على الرغم من أنها هي المعلمة حاسمة لتوصيف التكيف مع الظروف الجديدة. وقد جرت العادة على إجراء القياس الكمي للتكيف مع الظروف المتغيرة باستخدام الطرق اليدوية شاقة 3،4. في الآونة الأخيرة، وقد تم تطوير تقنيات متقدمة لتحليل الخلايا واحد 5،6. ومع ذلك، فإنه لا يزال من الصعب التمييز بين النمو الطبيعي بعد التأخر في النمو (أي تأخر الوقت) 2،3 من النمو البطيء. شيد طريقة الآلي، ScanLag 7، لالتمييز بين هذه الظواهر مماثلة اثنين.
وكشفت مثال صارخ على أهمية دراسة توزيع الوقت الضائع تحت العلاج بالمضادات الحيوية. المضادات الحيوية والضغوط أخرى كثيرة قتل الخلايا بنشاط متزايد فقط، وبالتالي، والخلايا التي هي "متخلفة" محمية 8. لرصد تأخر الوقت، يمكن للمرء أن يلاحظ خلايا مفردة تحت المجهر ورصد الوقت لدوري الدرجة الاولى. والعيب الرئيسي لهذه الطريقة هو أن النطاق الزمني ديناميكية محدودة؛ تغطية تلك الخلايا التي تنمو في وقت مبكر السطح بمعدل هائل، وخفض بشكل فعال في نمو الخلايا وقتا أطول مع تأخر. استخدام غرف تدفق تلتف إلى حد ما هذا 5، ولكن يمكن تتبع عدد محدود من الخلايا والتي لا يمكن لاحظ جزء من البكتيريا التي الخروج من مرحلة متخلفة بعد الغالبية العظمى من السكان قد بدأت في الازدياد. على الرغم من هذه القيود، وقد قيمت عدة دراسات تأثير مستوى ديويؤكد fferent على توزيع الوقت الضائع باستخدام المجهر خلية واحدة 9-12. طريقة أخرى لمراقبة توزيع الوقت الضائع من خلال قياسات التعكر 13،14. تزرع العديد من الثقافات موازاة ذلك، بدأت كل من خلية واحدة، في قارئ الكثافة البصرية الذي يقيس عدد من البكتيريا في الثقافة على مر الزمن. هذه الطريقة محدودة بسبب دقة استقراء وإلى عدد من الآبار في طبق من ذهب.
وقد تم تطوير أسلوب مؤتمت، ودعا ScanLag، التي تمكن مرات تأخر النمو والتوزيعات الوقت على أن يقسم، حتى بالنسبة لنسبة صغيرة من البكتيريا في عدد السكان التي لديها مرات فارق زمني طويل جدا. ويستند هذا الأسلوب على الكشف عن المستعمرات على لوحات أجار التقليدية المغذيات 15 (الشكل 1). لأتمتة الكشف 16،17 مجموعة من الماسحات الضوئية التجارية 18 التي يتم إخراج البرنامج في المنزل للحصول على دوري الصور من لوحات، وهندسيا. وكان البرنامجتهدف إلى تحليل الصور تلقائيا واستخراج المعلمات الكمي 19،20، مثل الوقت من ظهور كل مستعمرة والنمو الوقت من كل مستعمرة، الذي يعرف هنا باسم الوقت لتنمو من 20 بكسل إلى 80 بكسل. هنا نقدم طريقة بالتفصيل، بما في ذلك الإعداد للنظام واستخدام البرمجيات الآلي تحليل الصور التي تم تحسين واجهة المستخدم مع أفضل.
هذه الطريقة يمكن تكييفها لقياس الخصائص الأخرى من المستعمرات، مثل التشكل واللون. وقياس هذه الأنواع من المعلمات السماح باستخدام النظام في phenomics متعددة الأبعاد. كما يكشف الأسلوب مستعمرات من الخلايا واحدة، يمكن للنظام كشف الظواهر الجديدة التي لا يمكن قياسها بواسطة القياسات على مستوى السكان. تقنية تمكن الكشف واسترجاعها من المتغيرات نادرة، ويسهل الكشف عن الصفات المطلوب.
البروتوكول
1. بناء الإعداد
- اختيار ماسحة مسطحة مع قرار بصري: 4،800 نقطة في البوصة؛ قرار الأجهزة: 4،800 خ 9،600 نقطة في البوصة؛ لون عمق بت: 48 بت، التي يمكن أن تعمل في درجات الحرارة والرطوبة ذات الصلة.
- أطباق بتري لديها حجم كبير، على عكس ورقة تستخدم عادة في الماسحات الضوئية التجارية. المستعمرات تقع على الجزء العلوي من طبقة أجار، حوالي 5 مم فوق سطح الماسح الضوئي. ملاحظة: بالنسبة لمعظم الماسحات الضوئية المستعمرات ستكون في التركيز.
- بعض الشركات لا تسمح الماسح الضوئي ربط أكثر من مثيل واحد من الماسح الضوئي من نفس النوع لنفس الكمبيوتر. تأكد من أن الماسح الضوئي أكثر من واحد يمكن تركيبها وتحديدها بشكل فريد.
- إعداد الملحقات كما هو مفصل أدناه:
- شعرت إعداد قطعة من القماش الأسود عقيمة لتغطية لوحات (الشكل 1 الخطوة 2).
- لعقد أطباق بتري في مكان، وإعداد أصحاب وحة بيضاء (المواد والأساليب) التي تتلاءم مع الماسحات الضوئية والتي لديها 6 الحولوفاق حجم الأطباق (الشكل 1 الخطوة 3).
- إذا لزم الأمر لنمو الكائنات الحية الدقيقة، ووضع الماسحات الضوئية في بيئة درجة الحرارة التي تسيطر عليها. توصيل الماسحات الضوئية إلى الكمبيوتر.
- اختياري: قم بتوصيل التتابع إلى الكمبيوتر وتجاوز على / قبالة التحول من الماسح الضوئي للتغلب على درجة الحرارة التدرج.
ملاحظة: وحدة التتابع هو غاية لدرجة الحرارة الحساسة الكائنات الحية الدقيقة. أنها تطفئ الماسح الضوئي بحيث الالكترونيات لا تسخن سطح غير متساو. استخدام سوى جزء من سطح الماسح الضوئي قد يحقق نتائج مماثلة.
2. تثبيت مدير الضوئي
- نسخ كافة ملفات التطبيق "مدير الضوئي 'إلى دليل معين من http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html.
- تكوين ملف ScanningManager.exe.config وفقا لأسماء الماسحات الضوئية كما تظهر في إدارة الكمبيوتر> إدارة الأجهزة> أجهزة تصوير ( الشكل 2).
- لاستكشاف تطبيق "مدير الضوئي"، راجع قراءة لي الملف.
- لمزيد من المعلومات حول تطبيق "مدير الضوئي"، انظر Documentation.html.
3. قم بإجراء التجربة
- إعداد أطباق بتري (الشكل 1):
- تمييع الثقافة إلى ما يقرب من 2،000 كفو / مل. لوحة 0.1 مل من ثقافة موحدة على سطح اللوحة.
- للحصول على النقيض جيدة بين المستعمرات والطبق وامتصاص الرطوبة، وتغطي لوحة بقطعة من القماش الأسود العقيمة شعر. وضع غطاء على طبق من ذهب.
- وضع لوحات في حملة على الماسحات الضوئية.
- بدء تشغيل إدارة الضوئي (الشكل 3): اختيار الماسحات الضوئية المشاركة من قائمة الماسحات الضوئية المرفقة. اختيار عدد من الصور التي يتعين اتخاذها (التكرار)، الفاصل الزمني بين الصور اللاحقة (الفجوة الزمنية)، وتأخير الوقت قبل البدء رانه تجربة (ابدأ بعد).
4. تحليل الصور
ملاحظة: يتم توفير الخطوط العريضة للطرق الحسابية لتحليل الصور في MATLAB باستخدام "ScanLag"، وهو متاح مجانا للاستخدام غير التجاري في http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. أتش تي أم أل. وترد تفاصيل وظائف أخرى متاحة في دليل البرنامج، وتستكمل رمز المثال.
- فرز الصور من الماسح الضوئي كل في مجلدات منفصلة.
- باستخدام إطار الأوامر ماتلاب، وتشغيل الإجراءات التالية. يتم تعريف المعلمات المطلوبة لتشغيل هذه الإجراءات في دليل البرنامج.
- تشغيل PreparePictures لأداء تجهيزها: في تجهيزها، يتم محاذاة الصور من الماسح الضوئي. يتم اقتصاص كل طبق بتري من كل سلسلة من الصور. يتم استرداد الوقت الذي تم جمع كل صورة من الطابع الزمني.
- TLAllPlates تشغيل لأداء الكشف والتتبع في البريدطبق بيتري منفصل منظمة العمل ضد الجوع، تم الكشف عن المستعمرات وتعيين رقم تعريف.
- ويتم قياس أحجام من كل مستعمرة الكشف عن وظيفة من الزمن: تحليل البيانات المستخرجة. لاستخراج توزيع ظهور المستعمرات استخدام وظائف التالية في إطار الأوامر مطلب و(مزيد من المعلومات متاحة في دليل البرامج):
- تشغيل ScanLagApp لعرض تحليل طبق بتري معينة إلى جانب مع الرسم البياني للحجم المستعمرات مقابل الوقت (الشكل 4).
- استخدم المنزلق لتغيير الوقت الحالي من لوحة. كما سيتم أشار توقيت بواسطة خط عمودي مطابقة على الرسم البياني منطقة المستعمرات.
- انقر على مستعمرة لرؤية منحنى المرتبط به، والعكس بالعكس، انقر على منحنى للعثور على مستعمرة المرتبط به. بعد تحديد المستعمرة، والنمط الظاهري يمكن استرجاعها عن طريق التقاط مستعمرة من طبق بيتري التي تم تحديدها.
- عيوب مرشح في التحليل التلقائي بواسطة تشوالغناء مستعمرة والنقر على زر استبعادها. وعند النقر على استبعاد عدد من مستعمرة تتحول الصفراء.
- بعد أن يمر على نتائج تحليل كل لوحة، وتلخيص النتائج:
- تشغيل AddHistograms لإنشاء مدرج تكراري مرات المظهر.
- تشغيل plotDeathCurve لإنشاء تمثيل منحنى البقاء للتوزيع.
- تشغيل GetAppearanceTimes للحصول على وقت ظهور جميع المستعمرات في التجربة.
- تشغيل ScanLagApp لعرض تحليل طبق بتري معينة إلى جانب مع الرسم البياني للحجم المستعمرات مقابل الوقت (الشكل 4).
النتائج
كمثال على استخراج توزيع الوقت الضائع، ويبين الشكل 5 قدرة ScanLag لتحديد وتتبع كل مستعمرة ذات خصائص محددة على لوحة واحدة مع مرور الوقت، كما أن يعاملوك في مقايسة الفرز.
عندما ثقافة الكائنات الحية الدقيقة غير المتجانسة، ومجموعات سكانية فرعية مختلفة قد تكشف عن نفسها خلال الفحص. على سبيل المثال، ويبين الشكل 6 الكمي مظهر وبالتالي يكشف توزيع الوقت الضائع في النسقين سلالة متحولة من E. القولونية.
معدل نمو الخلايا يؤثر على مظهر الوقت للمستعمرة. عندما تنمو المستعمرات في نفس المعدل، ويمكن أن يعزى ظهور في وقت متأخر إلى الوقت الضائع (الشكل 7).
للتحقق من أن الأسلوب بل يقيس الوقت الضائع من الخلايا واحد، ونحن مقارنة النتائج مع تلك التي تم الحصول عليها ScanLag باستخدام المجهر وحيدة الخلية؛ هذا هو التحقق من صحة تنازلياribed بالتفصيل في نشرة سابقة 7. هذا الأسلوب يتيح رصد العديد من الخلايا مما يمكن تقييمها مع المجهر. التوزيعات التي تم الحصول عليها باستخدام المجهر والحصول عليها باستخدام ScanLag تتداخل إلى حد كبير. توزيع ScanLag هو أوسع قليلا؛ التحليلات النظرية التنبؤ توسيع لتكون من أجل من الانحراف المعياري من الوقت الانقسام. إذا كان الوقت هو النمو المختلفة لكل سلالة، يجب التحقيق في أصل التأخير في ظهور المزيد من استخدام وسائل أخرى.
تم فحص تأثير المستعمرات الظهور المبكر على ظهور المستعمرات في وقت لاحق. أكدت التجارب أن السيطرة 7 في وقت لاحق مظهر لم تتأثر طالما أن العدد الكلي للمستعمرات في لوحة لم تتجاوز 200 (الشكل 8). أكدت التجربة عنصر تحكم آخر أن موقع مستعمرة على لوحة لم تؤثر الوقت مظهره 7.
تحليل عيتم معايرة المرحومين إلى عتبات محددة قد تحتاج إلى تعديل تبعا المواد المغذية الموجودة في المتوسطة النمو أو نوع من الكائنات الحية الدقيقة. ومع ذلك، فإن التحليل هو قوي جدا بالنسبة لمجموعة كبيرة من العتبات كما هو مبين في الشكل 9.
الشكل 1. رسم تخطيطي من الخطوات اللازمة لإنشاء توزيع مظهر المستعمرة.
الشكل 2. لقطة شاشة إدارة الأجهزة تظهر أسماء الماسحات الضوئية المرفقة، وملف التكوين. الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.
الرقم 3. لقطة شاشة مدير الضوئي.
الشكل 4. لقطة شاشة ScanLagApp. صورة من لوحة على الجزء الأيمن، ومنحنيات النمو في كل مستعمرة هي في الجزء الأيسر، كما هو مفصل في الدليل. المسامير في بعض المنحنيات منطقة المستعمرات تحدث عند دمج اثنين أو أكثر من المستعمرات. عندما يحدث دمج المستعمرات، ويعتبر مجال هذه المستعمرات على أنها منطقة مشتركة.
الرقم 5. ونتيجة ممثل تحليل لوحة واحدة. (A) صورة من إخراج تطبيق الكشف في نهاية التجربة. يتم تعريف كل منطقة مستعمرة، وتعيين الملونة مع رقم معرف فريد. تشير الأسهم إلى المستعمرات ممثل تقاس B. يتم الكشف عن مستعمرة على أساس عتبة كثافة (للE. المستعمرات القولونية على LB أجار أجار أو M9 هذا الحد هو 0.03. لوسائل الإعلام أو غيرها من البكتيريا، ويمكن تعديل هذه العتبة في ProcessPictures ظيفة ). تحسب فقط كائنات فوق 10 بكسل (يمكن تعديل هذه العتبة في MatchColonies وظيفة). الكشف عن مستعمرة يبدأ في حوالي الساعة 10 5 البكتيريا. (B) المؤامرات في المنطقة بالبكسل مقابل الوقت من أربع مستعمرات ممثل في هذه اللوحة. في "وقت ظهور 'من كل مستعمرة هو عندما يتم الكشف عن المستعمرة. يتم تعريف "الوقت النمو 'من كل مستعمرة هنا كما الوقت لتنمو جيئة وذهابام 20 بكسل إلى 80 بكسل (تلك حدود قابلة للتعديل باستخدام وظيفة getAppearanceGrowthByVec). البرنامج لا يشمل المستعمرات التي اندمجت قبل الوصول إلى الحد الأعلى. تحديد مستعمرة محددة وفقا لخصائصها ويعود الفضل سهل الى رقم تعريف واللون المخصصة لكل مستعمرة. على سبيل المثال مستعمرات رقم 1، ويسلط الضوء على 56 و 77 و 124 في كل من الرسوم البيانية.
الرقم 6. المظهر الكمي يمكن أن تكشف عن النسقين توزيع الوقت الضائع. مقارنة بين رسوم بيانية تحليل ScanLag مرات ظهور لهما سلالات مختلفة. الخط الأزرق: نوع السلالة البرية المتنامية باطراد (المجموع: 1،320 المستعمرات)؛ أحمر خط عالية استمرار متحولة المخصب مع البكتيريا متخلفة (المجموع: 1،529 المستعمرات). (أ) رسوم بيانية ظهور تطبيع. ذروةمن ظهور الخلايا تنمو باطراد هي المرة نموذجي ليصل إلى مستعمرة كشفها. أقحم: نفس الرسم البياني من سلالة متحولة بعد طرح الوقت من ذروة الثقافة الأسي للحصول على الوقت الضائع الفعلي على صناديق متباعدة سجل تبين توزيع الوقت الضائع النسقين. (B) البقاء على قيد الحياة وظيفة من نفس البيانات كما في (أ) على مقياس لوغاريتمي. هذا التمثيل يعزز أواخر الذيل ظهور سلالة متحولة.
الرقم 7. توزيع المظهر وتوزيع الوقت النمو. (A) و (B) تظهر رسوم بيانية الأبعاد اثنين من الوقت المظهر والوقت نمو اثنين من ظروف مختلفة (البرنامج لا يشمل المستعمرات التي اندمجت قبل الوصول إلى الحد الأعلى). (C) وبمقارنة رسوم بيانيةمن سلالتين تظهر الفرق في الوقت المظهر، في حين أن النمو مرات (D) متشابهة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8. ظهور المستعمرات في وقت مبكر لا تتداخل مع ظهور المستعمرات في وقت لاحق. (A) تأخر توزيع الوقت من البرية من نوع الخلايا مطلي وحدها. (ب) تأخر توزيع الوقت من سلالة الحساسة الباردة وحدها، وبعد نقلها إلى درجة حرارة متساهلة. (C) تأخر توزيع الوقت لكل من سلالات مطلي معا تحت نفس الظروف. يمثل خط أسود توزيع المتوقع استنادا إلى البيانات التي تم الحصول عليها عند قياس كل سلالة على حدة. A جيدةيتم الحصول على greement بين التوزيعات المتوقعة وقياس ما دام مجموع عدد المستعمرات في لوحة هو أقل من 200.
. الرقم 9 عتبة الكشف لا يؤثر على شكل توزيع مظهر مستعمرة تم تحليل توزيع مظهر مستعمرة لنفس مجموعة البيانات باستخدام اثنين من أحجام مختلفة عتبة؛ (أ) حجم عتبة هو 10 بكسل؛ (ب) حجم عتبة 50 بكسل. عدد الخلايا في الرسم البياني: تقريبا. 1،500. النتائج عتبة الكشف مختلفة فقط في التحول من الوقت الكشف.
الرقم 10. درجة الحرارة قياسات الاستقرار ACROSS سطح الماسح الضوئي (أ) صورة من لوحة مع مستعمرات subtillis العصوية نمت على الماسح الضوئي دون إدارة الطاقة. السطح أكثر دفئا في الجزء السفلي، وبالتالي المستعمرات تنمو بشكل أسرع. خط التدريجي بجانب لوحة هو تمثيل التخطيطي التدرج الحراري. (B) وقد تم قياس درجة الحرارة الاستقرار مع اثنين من المزدوجات الحرارية وضعت عبر سطح الماسح الضوئي. الماسح الضوئي مع ارتفاع درجات الحرارة خلال كل من مسح ومع مرور الوقت. (C) وإدارة الطاقة، ودرجة حرارة موحدة والمستعمرات تنمو بمعدلات مماثلة. (D) مثل (B) مع وحدة إدارة الطاقة. استقرار درجة الحرارة من ± 0.2 درجة مئوية.
الرقم 11. قد تكون الاختلافات في التوزيع بسبب ظهور ديfferences في أحجام متوسطة الصلبة. كان مطلي نفس الثقافة البكتيرية على لوحات بأحجام مختلفة من LB أجار، مما أدى إلى ارتفاع مختلفة من سطح أجار. قاد ارتفاعات مختلفة إلى التعتيم مختلفة من لوحات، وبالتالي وقت الكشف مختلفة. تم فحص لوحات الفرق بين والفرق بين الارتفاعات المختلفة. (أ) الاختلافات بين نموذجي لوحات من كميات متساوية من 30 ± 0.5 مل من LB آجار. (ب) الفرق بين الارتفاعات المختلفة: تم قياس توزيع مظهر لوحات بأحجام من 20 ± 0.5 مل (الحمراء)، من 30 ± 0.5 مل (الأخضر) و40 ± 0.5 مل (الازرق). كل شرط هو متوسط 6 لوحات مختلفة. طالما أن حجم لوحات ضمن نطاق ± 5 مل، غموض مشابه ويؤدي إلى توزيع مماثلة الوقت المظهر.
المناقشة
وغالبا ما ينظر إلى الأساليب المجهرية يعتمد على الملاحظة المباشرة ب "معيار ذهبي" لدراسة السلوك وحيدة الخلية. يوفر ScanLag، والتي تمكن من قياس توزيع مرات تأخر في السكان البكتيرية والبيانات في اتفاق جيد مع التوزيع تم الحصول عليها من تحليل وحيدة الخلية ويحقق الإحصاءات أعلى من ذلك بكثير.
العديد من الخطوات الحاسمة يجب أن تؤديها لهذا الأسلوب للعمل بشكل جيد: أولا، لا نساوم على القرار الماسح الضوئي، الذي ينبغي أن يكون 4،800 9،600 س للحصول على صور جيدة. الثاني، أن ندرك أنه بدون وحدة إدارة الطاقة (الخطوة 1.6)، ودرجة الحرارة التدرج قد وضع على سطح مسطحة وتؤثر على النمو. خطوة هامة أخرى هو الترشيح من العيوب مثل الغبار التي قد تم فرزها عن طريق الخطأ كما المستعمرات من قبل البرنامج. الطرح خلفية المدمج في البرنامج عادة ما يتغلب على هذه العيوب، ولكن لديها المستعمرات أحيانا "كاذبة" لتتم تصفيته يدويا.
الخطوات الرئيسية استكشاف الأخطاء وإصلاحها قد تعالج بين لوحة التباين في الإعداد، ويرجع ذلك إلى عدة أسباب: (أ) ويتأثر معدل نمو الكائنات الدقيقة في درجة الحرارة. يمكن أن تحدث درجة الحرارة والرطوبة ظروف مختلفة بسبب التهوية غير المستوية أو موقع الطبق في الحاضنة. (ب) والالكترونيات من الماسح الضوئي قد تسخن وتسبب التدرج في درجة الحرارة عبر سطح الماسح الضوئي. الشكل 10 يظهر تأثير هذا الانحدار الحرارة على البكتيريا العصوية المكانية، جنبا إلى جنب مع قياسات لدرجة الحرارة على سطح الماسح الضوئي قبل و بعد تنفيذ وحدة إدارة الطاقة (الخطوة 1.6). لاحظ أن هذه الوحدة قد لا يكون ضروريا لأحدث الماسحات الضوئية، وإذا تم استخدام سوى جزء من سطح الماسح الضوئي، قد تكون إدارة الطاقة لا لزوم لها. (ج) لوحات مع التعتيم مختلفة من المغذيات أجار قد تؤدي إلى مستويات مختلفة من الكشف. الشكل 11 يظهر اله التسامح لأحجام مختلفة من المغذيات آجار التي تؤدي إلى عتامة مختلفة.
تجريبيا تقنية ScanLag من السهل لتنفيذ ويتطلب فقط لوحة الكائنات الحية الدقيقة على أطباق بتري القياسية، ووضعها على سطح الماسح الضوئي. البرنامج الذي تم تطويره تسيطر على الإجراء بأكمله. ويتم الحصول على الصور تلقائيا، وتحليل الصور لتتبع المستعمرة هو أيضا التلقائي. وعلاوة على ذلك، فإن النظام يمكن زيادتها المتابعة لقياس ظروف عديدة ومختلفة في نفس الوقت. أخيرا، تعتمد الطريقة على الماسحات الضوئية المكاتب التجارية، وبالتالي، هو التكلفة المنخفضة.
ويمكن تمديد هذه التقنية لدراسة الكائنات الحية الدقيقة والتي تختلف من E. القولونية K-12، ولكن عدة اعتبارات يجب أن تتم. الأولى، وتأثير المستعمرات التي تظهر في وقت مبكر على تلك في وقت لاحق لابد من تقييمها، كما هو موضح بالتفصيل في نشرة سابقة 7. لE. القولونية K-12، والكثافة القصوى من كفو لكل لوحة 200. سلالات أخرى ذات أحجام مختلفة من المستعمرات، وغيرها عبر الحديث محتملة بين المستعمرات، قد تتطلب كثافة مختلفة. الثاني، هو معايرة تحليل لوحات عتبات البرمجيات القائمة المحددة التي قد تحتاج إلى تعديل، اعتمادا على التناقض بين المتوسطة الصلبة والمستعمرات. ويمكن تمديد البرنامج أيضا لاستخراج الخصائص مستعمرة أخرى، وراء تأخر ومعدل النمو. رمز البرمجيات مفتوحة ويمكن تعديلها لاستخراج شكل مستعمرة، والسطوع، نعومة ولون.
لأنه يتم إجراء القياسات على المستعمرات التي تنشأ من الخلايا واحدة، تكشف البيانات الظواهر الجديدة التي لا يمكن قياسها بواسطة القياسات على مستوى السكان. وكشفت أهمية توزيع الوقت الضائع في وجود المضادات الحيوية. ومن المعروف أن العديد من المضادات الحيوية تكون فعالة فقط ضد الخلايا المتنامية؛ ولطالما بقيت الخلايا في مرحلة متخلفة والتي لا تنمو، فهي المواليةtected من آثار تلك المضادات الحيوية 21. عندما يتم تقييم أعداد البكتيريا الناجين في فترات زمنية أثناء العلاج بالمضادات الحيوية 15،22،23، وغالبا ما يتم كشف جزء من السكان من البكتيريا، ودعا صوامد،. في بعض الحالات، والحصانة للعلاج بالمضادات الحيوية تنبع من تأخر لفترة طويلة. باستخدام هذا الإعداد، تبين هذا التأخر، ولها توزيع غير تافهة 24 (الشكل 6) في كثير من الأحيان. هذه الطريقة تمكن أيضا استرجاع المسوخ نادرة. على سبيل المثال، بعد الطلاء السكان mutagenized، يمكن تحديد المسوخ على أساس النمط الظاهري ومعزولة مباشرة، دون التحديد. يمكن أن الإعداد أيضا رصد التفاعلات خلية خلية عن طريق قياس نمو المستعمرات بوصفها وظيفة من كثافة المستعمرات المجاورة وتحديد الظواهر مثل الاستشعار عن النصاب أو انتشار البكتيريا يحتشدون. والمعلومات التي كشفت عنها التجارب المتعددة الأبعاد في المستقبل باستخدام هذا الأسلوب يؤدي إلى توصيف أفضل من السكان الميكروبيةق والتقدم في البحوث الطبية والبيئية.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر Eliq Oster على صور Bacillus subtillis. يتم دعم العمل من قبل مجلس البحوث الأوروبي (# 260871) ومؤسسة العلوم الإسرائيلية (# 592/10).
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| باكتو أجار | BD | 214010 | |
| مرق ديفكو LB | BD | 240230 | |
| طبق بتري 90 مم | مينيبلاست | 20090-01 | |
| إبسون بيرفكشن v37 | إبسون | B11B207201 | بدقة بصرية: 4,800 نقطة في البوصة ، دقة الأجهزة: 4,800 × 9,600 نقطة في البوصة، عمق بت اللون 48 بت. |
| إبسون بيرفكشن v200 | إبسون | B11B188011 | |
| إبسون بيرفكتال 3490 | إبسون | B11B177011 | |
| ADU200 USB Relay | ONTRAK | ||
| قطع من القماش الأسود المعقم | حسب الطلب | تقريبا 100 × 100 | |
| مم حاملي الألواح البيضاء | حجم السطح حسب الطلب | ، مع فتحة | |
| قطرها 6 × 99 ممحلقات Delerin بحجم طبق Petri | حسب | القطر الداخلي: 72 مم القطر الخارجي: 86 مم القطر الخارجي العلوي: 90 مم |
المراجع
- Bochner, B. R. Global phenotypic characterization of bacteria. FEMS Microbiol Rev. 33, 191-205 (2009).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Reviews in Microbiology. 3, 371-394 (1949).
- Penfold, W. J. On the Nature of Bacterial Lag. J Hyg (Lond. 14, 215-241 (1914).
- Powell, E. O. Growth rate and generation time of bacteria, with special reference to continuous culture. J Gen Microbiol. 15, 492-511 (1956).
- Elfwing, A., LeMarc, Y., Baranyi, J., Ballagi, A. Observing growth and division of large numbers of individual bacteria by image analysis. Applied and Environmental Microbiology. 70, 675-678 (2004).
- Hertog, A., et al. Simplified automated image analysis for detection and phenotyping of Mycobacterium tuberculosis on porous supports by monitoring growing microcolonies. PloS one. 5, (2010).
- Levin-Reisman, I., et al. Automated imaging with ScanLag reveals previously undetectable bacterial growth phenotypes. Nature Methods. 7, (2010).
- Lewis, K. Persister cells. Annual review of microbiology. 64, 357-372 (2010).
- Metris, A., George, S. M., Baranyi, J. Use of optical density detection times to assess the effect of acetic acid on single-cell kinetics. Applied and Environmental Microbiology. 72, 6674-6679 (2006).
- Niven, G. W., Fuks, T., Morton, J. S., Rua, S. A. C. G., Mackey, B. M. A novel method for measuring lag times in division of individual bacterial cells using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 65, 311-317 (2006).
- Niven, G. W., Morton, J. S., Fuks, T., Mackey, B. A. Influence of environmental stress on distributions of times to first division in Escherichia coli populations, as determined by digital-image analysis of individual cells. Applied and Environmental Microbiology. 74, 3757-3763 (2008).
- Pin, C., Baranyi, J. Single-cell and population lag times as a function of cell age. Applied and Environmental Microbiology. 74, 2534-2536 (2008).
- Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. Influence of stress on individual lag time distributions of Listeria monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology. 71, 2940-2948 (2005).
- Metris, A., George, S. M., Peck, M. W., Baranyi, J. Distribution of turbidity detection times produced by single cell-generated bacterial populations. Journal of Microbiological Methods. 55, 821-827 (2003).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Glaser, D. A., Wattenburg, W. H. An automated system for the growth and analysis of large numbers of bacterial colonies using an environmental chamber and a computer-controlled flying-spot scanner. Ann N Y Acad Sci. 139, 243-257 (1966).
- Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells. Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).
- Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).
- Ernebjerg, M., Kishony, R. Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking. Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).
- Rotem, E., et al. Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).
- Bigger, J. The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes. Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).
- Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli. BMC Microbiol. 13, 25 (2013).
- Moyed, H. S., Bertrand, K. P. Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis. Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).
- Balaban, N. Q. Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 768-775 (2011).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
