مقالة منهجية

تصنيع المركزة، الأوكسجين القائم على الدهون Microbubble المستحلبات بواسطة High القص التجانس والتركيز المسلسل

DOI:

10.3791/51467

⸱

مايو 26, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology and Critical Care, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف أساليب لتصنيع كميات كبيرة من الدهون على أساس microbubbles الأكسجين (LOMs) مصممة للتسليم الأوكسجين عن طريق الوريد باستخدام التجانس عالية القص وتركيز المسلسل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وضعت microbubbles مليئة بالغاز مثل الموجات فوق الصوتية وكلاء النقيض تسليم المخدرات. يمكن أن تنتج عن طريق معالجة Microbubbles السطحي باستخدام صوتنة، والإثارة الميكانيكية، وأجهزة ميكروفلويديك، أو التجانس. مؤخرا، تم تصميمها على أساس الدهون microbubbles الأكسجين (LOMs) لتسليم الأكسجين عن طريق الوريد أثناء حالات الطوارئ الطبية، وعكس نقص الأكسجة التي تهدد الحياة، ومنع الإصابة اللاحقة الجهاز، وتوقف القلب والموت. نقدم طرق لإنتاج مصغرة تتكون من microbubbles الاوكسيجين للغاية باستخدام حلقة مغلقة عالية القص الخالط. عملية يمكن أن تنتج 2 L من LOMs المركزة (90٪ من حيث الحجم) في 90 دقيقة. فقاعات الناتجة لديها قطر متوسط ​​~ 2 ميكرون، والتشكيل rheologic يتفق مع الدم عندما تضعف إلى 60٪ حجم. هذه التقنية تنتج LOMs في قدرة عالية وعالية النقاء مع الأكسجين، مما يشير إلى أن هذه التقنية قد تكون مفيدة لمختبرات البحوث متعدية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وضعت Microbubbles تتكون من البروتين، والبوليمر، وقذائف الدهون كذلك ناقلا لتسليم المخدرات، والعلاج الجيني، وعوامل التباين الموجات فوق الصوتية 1-5. لأن هذه الاستخدامات العلاجية تتطلب استمرار microbubble داخل الأوعية الدموية، وتمتلئ هذه microbubbles عادة مع الخاملة، الغازات عالية الوزن الجزيئي مثل الهيدروكربونات المشبعة بالفلور 6، والتي لها قدرة منخفضة على الذوبان في الدم واستقرار 3،4 فقاعة.

مؤخرا، تم تصميمها على أساس الدهون microbubbles الأكسجين (LOMs) لتقديم الجرعات العلاجية من الأكسجين، والذي حفظه نهاية الجهاز تسليم الأوكسجين والدورة الدموية منع عدم الاستقرار خلال فترات انسداد مجرى الهواء أو نقص الأكسجة 7. المستحلبات مصممة للتسليم الغاز في الوريد تتطلب ميزات تصميم تختلف عن تلك المستخدمة لعوامل التباين الموجات فوق الصوتية أو تسليم المخدرات المستهدفة. أولا، لأن الجسم يستهلك كميات كبيرة من غاز الأكسجين (~ 200 مل / دقيقة)، يجب أن تنتج LOMs وحقن على نطاق واسع. هذا يتطلب أن عملية التصنيع تكون فعالة. ثانيا، ينبغي أن تكون عملية التصنيع حلقة مغلقة من أجل تجنب التلوث النيتروجين من خلال التعرض لLOMs (التي ينبغي أن تملأ مع 100٪ من الأكسجين) إلى الهواء المحيط. الثالثة، وذلك لأن الغرض من LOMs هو تسليم الغاز في الوريد، يجب أن يكون الحد الأقصى جزء من الغاز LOMs، مع الاعتراف القيود التي تفرضها مستحلب اللزوجة 7. أخيرا، كما هو الحال مع أي حقن في الوريد، مراقبة دقيقة على توزيع حجم الجسيمات هو ضروري لتجنب انسداد الاوعية الدموية الدقيقة 8.

هناك العديد من الطرق التي أنشئت لتصنيع microbubble. صوتنة يستخدم كثافة عالية، وتطبيق الموجات فوق الصوتية ذات التردد المنخفض إلى واجهة الهواء السائل من مستحلب الذي يتضمن السطحي، مثل فوسفورية متقابلة الزمر، في وجود فراغ الرأس الغاز لإنتاج microbubbles 7،9. هذه العملية يمكن السيطرة عليها من خلال تغيير فائقةتردد الصوت والقوة ومدة النبضة، وتوزيع حجم الناتج يمكن أن تكون مصممة لإنتاج microbubbles لتوزيع حجم معين، على الرغم من صوتنة ونادرا ما يستخدم في صناعة microbubbles المستخدمة سريريا. الدمج هو التحريض الميكانيكية مكثفة من السطحي والغاز في نظام مغلق، والذي هو أيضا من الصعب زيادة لاستيعاب كميات كبيرة 2. استنادا على microfluidics الحبرية، يسمح بالتحكم الدقيق في توزيع حجم microbubble 10-13. وإن كان من الصعب تقليديا لزيادة، متعدد القنوات، وقد وصفت على microfluidics عالية السرعة التي تزيد microbubble كفاءة الإنتاج 13. Microbubbles تصنيعها باستخدام أي من هذه الأساليب قد تتطلب عمليات تصنيع للحد من حجم آخر، مثل تجزئة الطرد المركزي و14،15 16،17 microbubble التعويم.

آخر بالطريقة المحددة لتصنيع microbubbles درجة عالية من الاستقرار هو homogeniz القصأوجه 6، والذي يمكن أن يؤدي إلى وجود نمط فوسفورية سداسية استقرار على سطح microbubble 18. بناء على هذا المفهوم، ونحن تصف التأسيس من القص عالية الخالط في خط لخلق LOMs الذاتي تجميع 19. في هذه العملية، ويستخدم الخالط الدورية بسرعة ريش على مقربة من غرامة شاشات شبكة emulsor المزدوج، وخلق عالية القص الميكانيكية والهيدروليكية لإنشاء microbubbles. تركيز المسلسل من مستحلب الدهون من خلال هذا النظام ينتج عن جزء الغاز تتركز على نحو متزايد، والتي يمكن حتى تتركز المزيد بواسطة الطرد المركزي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. نظام مجموعة المتابعة

ويتكون النظام من عقد والتركيز خزان (HCT) مزودة خلاط واحد المرحلة، والقص عالية الخالط في الخط، ومضخة الأسطوانة لنقل السوائل بين كليات التقنية العليا والخالط، ومبادل للحرارة (الشكل 1).

  1. وضع تعقيمها، الفم واسعة 4 L سفينة جمع الزجاج مزودة 2 الموانئ قاعدة و 3 منافذ جانبية تحت خلاط مرحلة واحدة. خفض الرأس إلى الفم خلاط السفينة وضمان تركيب الغاز محكم باستخدام الأختام المطاطية أو شريط (من أجل منع الهواء المحيط من تلويث الفضاء الرأس).
  2. تناسب واحدة من الموانئ قاعدة (الشكل 1، الميناء رقم 1) من كليات التقنية العليا مع العقيمة 3/8 "(ID) أنابيب واضحة، ما يقرب من 10" لفترة طويلة، مزودة محبس 3 الطريقة في الطرف عن مجموعة من مستحلب المركزة .
  3. تناسب ميناء القاعدة الثانية (الشكل 1، الميناء رقم 2) مع العقيمة 3/8 "(ID) أنابيب، approximatelذ 36 "في الطول. تتغذى هذه الأنابيب من خلال مضخة الأسطوانة. تناسب مدخل القص الخالط عالية مع T-قطعة من بينهم اثنان من الموانئ وربط على النحو التالي: ربط الأنابيب من ميناء رقم 2، من خلال مضخة الأسطوانة والاتصال إلى جانب منفذ T-قطعة. إرفاق منفذ آخر لدبابة الأكسجين باستخدام مقياس الجريان غاز الأكسجين المنخفضة تدفق.
  4. ربط ميناء منفذ من القص الخالط عالية لمدخل الميناء لمبادل الحرارة في خط الحفاظ على 4 درجات مئوية. ربط ميناء مخرج المبادل الحراري إلى ميناء عودة كليات التقنية العليا (الشكل 1، الميناء # 3)، وخلق نظام حلقة مغلقة.
  5. إرفاق خزان الأكسجين (عن طريق مقياس الجريان) إلى كليات التقنية العليا (الشكل 1، ومنفذ رقم 4). نعلق شاشة تكوين الغاز التي هي مفتوحة في الغلاف الجوي إلى ميناء العلوي من كليات التقنية العليا (الشكل 1، الميناء # 5).
  6. إذا كان المطلوب العقم، تعقيم مكونات الزجاج والمعدن قبل كل استخدام بواسطة الأوتوكلاف. تعقيم مكونات أنابيب وشارك البلاستيكnnectors بواسطة أكسيد الإيثيلين قبل كل استعمال. هذا أمر مهم خاصة إذا كان المنتج هو لفحصها في الجسم الحي.

2. تصنيع LOM

  1. وضع 20 غرام من 1،2-GMP distearoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DSPC) و 10 غرام من الكولسترول في قاعدة كليات التقنية العليا. إضافة 1 لتر من البلازما LYTE ألف لكليات التقنية العليا واليد ضجة لمدة 1 دقيقة، ودمج أكبر قدر ممكن من المادة الدهنية في المرحلة المائية.
  2. خفض خلاط مرحلة واحدة في المرحلة المائية، وضمان أن رأسه خلاط كامل تغطيها المرحلة المائية. تأكد من أن الجزء العلوي من كليات التقنية العليا هو الغاز ضيق (انظر الخطوة 1.1 أعلاه) وأنه لا توجد منافذ جانبية مفتوحة. بدوره على مصدر الغاز تعلق على منفذ رقم 4 وانتظر حتى الكسر الأكسجين من فراغ الرأس HCT تصل> 95٪. في 10 لتر / دقيقة (LPM)، وهذا ينبغي أن تأخذ ~ 10 دقيقة.
  3. باستخدام خلاط مرحلة واحدة، ومزيج مستحلب السلائف لمدة 5 دقائق عند 5،000 دورة في الدقيقة. يجب أن تظهر الخليط الناتج أبيض شاحب ولا تحتوي على أية معهد العلوم الإندونيسي مرئيةد كتل. مرة واحدة مختلطة، ويمكن تخزين المياه غير المستخدمة خليط الدهون في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 30 يوما قبل استخدام مرة واحدة.
  4. رئيس كامل نظام حلقة مغلقة مع مستحلب السلائف عن طريق تشغيل المضخة الدوارة في 1.3 LPM. مرة واحدة وتستعد النظام، والحفاظ على المضخة عند 1.3 LPM.
  5. لبدء تصنيع LOMs، بدوره على القص عالية الخالط في خط ل7،500 دورة في الدقيقة. بعد ذلك مباشرة، بدوره على تدفق الأكسجين إلى جزء من مدخل الخالط عند 0.5 LPM. الحفاظ على خلاط مرحلة واحدة (في HCT) على 3،500 دورة في الدقيقة في. تتشكل LOMs في واجهة من ريش الدوار وشاشات emulsor ضمن الخالط في الخط (الشكل 2). في غضون دقائق، وينبغي أن تصبح أكثر لزوجة السائل بشكل واضح. نهج أكثر صرامة لتحديد اللزوجة بوصفها وظيفة من الوقت، والتي يمكن أن يتم عن طريق إزالة مأخوذة من ميناء 1 خلال تلفيق وتحليل مع جهاز قياس اللزوجة.
    ملاحظة: إذا فقاعات الهواء مرئية موجودة في أنابيب الخروج من خلاط، والأكسجينتتدفق إلى الخالط في خط مرتفع جدا. عاير أسفل تدفق الغاز السائل حتى مبهمة ولا تحتوي على فقاعات الغاز مرئية.
  6. تشغيل النظام لمدة 15 دقيقة، ثم إيقاف الخالط القص عالية ومدخل الأوكسجين إليها. الاستمرار في تشغيل الخلاط مرحلة واحدة في كليات التقنية العليا حتى تتم إزالة مستحلب؛ هذا يخفف مرحلة الانفصال وتحافظ على المنتج موحدة نسبيا في كليات التقنية العليا.
    ملاحظة: حجم مستحلب مليئة بالغاز يجب زيادة حوالي 2-3X خلال مرحلة تركيز المسلسل. إذا لم يحدث ذلك، تحقق للتأكد من أن الأكسجين يتدفق في القص الخالط عالية وأن تركيزات الدهون في مستحلب السلائف صحيحة. كفاءة الإنتاج يتناقص كما يقلل تركيز الدهون.

3. جمع وتركيز، وتقييم، وتخزين LOMs

  1. إرفاق العقيمة، وتعديل 140 مل بالتركيبة قفل محبس حقنة لتعلق على المنفذ الأساسي رقم 1 على متن السفينة المجموعة. وضع 100 مل من السوائل. الغطاء بإحكام حقنة وتكرار حتى تمت إزالة جميع السوائل.
    1. تعديل الحقن من خلال سحب 100 مل من الهواء في حقنة ثم بالنشر قبالة الغطاس الزائدة والمواد حقنة فوق علامة مل 140. ملء والحقن الفارغة باستخدام ملقط مسنن لوضع المكبس. هذا التعديل يسمح أسهل الطرد المركزي.
  2. المحاقن الطرد المركزي مع نهاية توج المنحى النزولي في المبرد (4 º C) دلو الطرد المركزي في 225 x ج لمدة 10 دقيقة.
  3. وثلاث طبقات من المواد تظهر بعد الطرد المركزي. طرد الطبقة السفلية من المرحلة المائية الزائدة غائم وتجاهل. الطبقة الثانية هي بيضاء مشرقة ويحتوي LOMs المركزة. نقل الرغوة المركزة إلى حقنة الغاز غير منفذة باستخدام محبس ثلاثي لمنع التلوث الغاز المحيطة. تجاهل الطبقة النهائية، والذي يحتوي على غاز الأكسجين خالية من LOMs تمزق.
  4. ويمكن تقييم نوعية الرغوة من خلال الوصول ≥ الغاز 90٪ من الرغوة المركزة. Calculأكلت تركيز الغاز على النحو التالي:
    حجم الغاز٪ = [(الوزن رغوة / رغوة حجم) - 1] × 100
    1. كما لمراقبة الجودة الثاني، microbubbles حجم التعمية بواسطة الضوء لتحديد ما إذا كان حجم الجسيمات هو ضمن النطاق المتوقع. تجدر الإشارة إلى أن أي تغيير في الوقت التجانس أو صياغة قد يغير حجم الفقاعة.
  5. الغطاء بإحكام الحقنة الزجاج مع تركيب-بالتركيبة القفل. يمكن أن تضعف LOMs مركزة مع البلازما LYTE A في وقت الاستخدام. ويمكن تخزين المحاقن في 22، 4، أو -20 درجة مئوية؛ قد توفر درجات حرارة أكثر برودة وتعزيز الاستقرار الجرف الحياة 7.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عالية التجانس القص تمكن كفاءة (أي في غضون احدة بعد الظهر) إنتاج LOMs كافية لدراسة أجريت على الحيوانات و لا يتطلب خبرة تقنية. مرة واحدة يتقن، لتصل إلى 2 لتر من LOMs المركزة يمكن تصنيعها في 90 دقيقة.

تم تقييم حجم Microbubble والتشكل بواسطة المجهر الضوئي والتعمية ضوء. عندما تصور عينة 10 ميكرولتر من LOMs، لوحظت LOMs كروية، فضلا عن ندرة النسبية الحطام الدهون (الشكل 3A). هل هذا صحيح خصوصا عندم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أهم الخطوات لخلق المركزة، LOMs الاوكسيجين للغاية وتشمل: 1) التأكد من أن فراغ الرأس داخل كليات التقنية العليا لا تزال الاوكسيجين تماما؛ 2) ضمان نقاء السواغات الدهون هو الأمثل (بما في ذلك ظروف التخزين واستخدام منتجات GMP)؛ 3) ضمان أن الدهون مسحوق مزيج تماما مع المرحلة المائية قبل فتيلة النظام؛ و4) إيلاء اهتمام وثيق لزيادة نسبة الغاز في كليات التقنية العليا للتأكد من أن جزء من حجم الغاز لا يتجاوز 70٪.

طريقة وصفنا هن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التمويل: الجيش الأمريكي البحوث الطبية وقيادة العتاد (USAMRMC) ويديره التطبيب عن بعد ومركز بحوث تكنولوجيا متقدمة. ساهم Shunxi جي التعديل من الحقن كما هو موضح هنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،2-distearoyl-sn< / em>-glycero-3-phosphocholine (DSPC)Avanti Polar Lipids770365منتج بديل: غير GMP من NOF America (Coatsome MC-8080)
الكوليسترولSigma AldrichC75209
Plasma-Lyte AVWR80089-818بدلا من ذلك يمكن استخدام
سفينة جمع NaCl GlassSpecialty Glass، Inc.جهة اتصال مخصصة: Pam Zurbrick - 281-595-2210
جهاز قياس الغاز (الأكسجين)الدقة الطبيةPM5900L
Sarns 8000 مضخة الأسطوانةCalicut Medical16407جزء من نظام التروية المعياري
مبادل حراري BIOtherm مختبرMedtronicECMOtherm-II
Verso خلاط في الخطSilverson Machines، IncTH-IL-102-VERSOاستخدم رؤوس العمل متعددة المراحل وتمديد الواجهة الأمامية مع قطعة T لمنفذ
مدخل Silverson Versoابتكارات العمليةاتصل العرف: Brian Leavitt - 508-423-2266
L5M-A خلاط مختبرSilverson Machines،Inc NC0136483استخدم شاشة مستحلب شبكية (ناعمة)
ملقط Rochester-Ochsner مسننفيشر Scientific13-812-18
حقنة 140 ملKendall Healthcare Monoject8881114030تأكد من وجود قفل لور.
IX71 مجهر ضوئي مقلوبأوليمبوسIX71
Retiga-2000R كاميرا مجهرQImagingRET-2000R-F-M-12
Accusizer 780A التخفيف التلقائيPSS-NICOMP أنظمة تحجيم الجسيماتخارج الإنتاج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5 (11), 2161-2170 (2009).
  2. Ren, J. L., et al. A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization. Academic Radiology. 16 (12), 1457-1465 (2009).
  3. Tinkov, S., et al. Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (6), 1935-1961 (2009).
  4. Hernot, S., Klibanov, A. L. Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (10), 1153-1166 (2008).
  5. Lanza, G. M., et al. A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation. 94 (12), 3334-3340 (1996).
  6. Cavalli, R., et al. Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery. International Journal of Pharmaceutics. 381 (2), 160-165 (2009).
  7. Kheir, J. N., et al. Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery. Science Translational Medicine. 4 (140), (2012).
  8. Lindner, J. R., et al. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (5), 396-403 (2002).
  9. Zhao, Y. Z., et al. Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (9), 1237-1243 (2005).
  10. Seo, M., et al. Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy. Langmuir. 26 (17), 13855-13860 (2010).
  11. Wan, J. D., Stone, H. A. Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles. Langmuir. 28 (1), 37-41 (2012).
  12. Duncanson, W. J., et al. Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions. Langmuir. 28 (17), 6742-6745 (2012).
  13. Kendall, M. R., et al. Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery. Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).
  14. Szijjarto, C., et al. Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization. Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).
  15. Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method. Langmuir. 26 (3), 1649-1655 (2010).
  16. Swanson, E. J., et al. Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery. Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).
  17. Kvåle, S., et al. Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation. Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).
  18. Dressaire, E., et al. Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles. Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).
  19. Kheir, J. N., et al. Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery. Advanced Healthcare Materials. , (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة