Transection الحبل الشوكي في اليرقات الزرد

ملخص

بعد transection الشوكي، الزرد الكبار يكون الانتعاش وظيفية لمدة ستة أسابيع بعد الإصابة. للاستفادة من الشفافية اليرقات والانتعاش بشكل أسرع، ونحن نقدم وسيلة لtransecting الحبل الشوكي اليرقات. بعد transection، نلاحظ الانتعاش الحسية ابتداء من الساعة 2 أيام بعد الإصابة، وحركة C-منحنى قبل 3 أيام بعد الإصابة.

الملخص

تفشل الثدييات في الانتعاش الحسية والحركية التالية إصابة النخاع الشوكي بسبب نقص إعادة نمو محور عصبي دون مستوى الإصابة وكذلك عدم القدرة على معاودة تكوين الخلايا العصبية في العمود الفقري. ومع ذلك، فإن بعض anamniotes بما في ذلك الزرد دانيو rerio المعرض على حد سواء الحسية والانتعاش وظيفية حتى بعد transection كاملة من الحبل الشوكي. الزرد الكبار هو نموذج حي أنشئت لدراسة التجديد التالية اصابات الحبل الشوكي، مع الانتعاش الحسية والحركية من خلال 6 أسابيع بعد الإصابة. للاستفادة من الجسم الحي في تحليل عملية التجدد المتاحة في الزرد اليرقات شفافة وكذلك الأدوات الجينية لا يمكن الوصول إليها في الكبار، ونحن نستخدم اليرقات الزرد لدراسة تجديد بعد transection الحبل الشوكي. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة لبتكاثر ويمكن التحقق منه transecting الحبل الشوكي اليرقات. بعد transection، بياناتنا تظهر الانتعاش الحسية بداية في 2 يوما بعد الإصابة (نقطة في البوصة)، وخفة دمح حركة-C منحنى كشفها بواسطة 3 نقطة في البوصة واستئناف السباحة الحرة بنسبة 5 نقطة في البوصة. وبالتالي نقترح الزرد اليرقات كأداة مصاحب لالزرد الكبار لدراسة الانتعاش بعد إصابة الحبل الشوكي.

المقدمة

الصدمة الكبرى إلى الحبل الشوكي الإنسان غالبا ما يؤدي إلى الشلل الدائم وفقدان الإحساس دون مستوى الإصابة، وذلك بسبب عدم القدرة على محاور عصبية أو تجديد أعماله تنمو الخلايا العصبية ^1،2. وعلى النقيض من الثدييات، ومع ذلك، بما في ذلك anamniotes السلمندر والزرد (دانيو rerio) تظهر انتعاشا قويا حتى بعد transection الحبل الشوكي كاملة ^3،4.

الزرد الكبار هو نموذج راسخة لدراسة عملية الانتعاش في أعقاب إصابة الحبل الشوكي ^5-7. التالية transection كاملة في النخاع الشوكي، لوحظ إعادة وظيفة الحسية وقاطرة في الزرد الكبار بنسبة 6 أسابيع بعد الإصابة ^8. من أجل دراسة عملية التجدد في الجسم الحي، لجأنا إلى الزرد اليرقات شفافة ^9.

ونحن هنا نقدم وسيلة لالقطع في الحبل الشوكي من 5 أيام بعد الإخصاب (DPF) اليرقات الزرد باليودنانوغرام ماصة حقن مكروي مشطوف كما مشرط أو تعديلها من بهات، وآخرون. يدعم ¹⁰ هذا الأسلوب إنتاجية عالية ومعدلات وفيات منخفضة، والتكاثر. مع الممارسة، 300 يرقة / ساعة يمكن مقطوع، وأكثر من 6 أشهر من transections، بما في ذلك أكثر من 3،600 الحيوانات، 98.75٪ ± 0.72٪ نجا حتى 7 أيام بعد الإصابة (نقطة في البوصة). وتظهر بيانات لدينا انتعاش سريع للتنقل الحسية وكذلك: في 1 نقطة في البوصة، هو الدافع وراء كل حركة من الأسماك أصيب الصدرية تحرك الزعانف فقط. ومع ذلك، تبدأ اليرقات للرد على إبرة التنغستن مسة الذيلية لtransection بنسبة 2 نقطة في البوصة، إعادة تأسيس الحركة C-منحنى بنسبة 3 نقطة في البوصة، وعرض السباحة المفترسة بنسبة 5 نقطة في البوصة ^11. باستخدام الأجسام المضادة ضد تلطيخ تويولين الأسيتيل، ونحن قد أكدت أن محاور هي غائبة عن موقع الإصابة في 1 نقطة في البوصة، ولكن عبروا موقع الإصابة بنسبة 5 نقطة في البوصة. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول توفير تقنية قيمة لدراسة إعادة نمو محور عصبي وتكوين الخلايا العصبية في النخاع الشوكي بعد الاصابة.

البروتوكول

وأثيرت الزرد وتربيتها وفقا للاجراءات المتبعة؛ تمت الموافقة على التجارب من قبل الجامعة لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية ولاية يوتا.

1. إعداد لوحات جراحة

1. جعل لوحات الجراحة باستخدام 60 مم أطباق بتري وSylgard 184 السيليكون المرنة كيت، بعد تعليمات الشركة الصانعة. ملء أطباق لا يزيد عن نصف كامل والسماح لبلمرة. متجر تغطيتها على درجة حرارة الغرفة.

2. إعداد بال micropipettes

1. افتعال بال micropipettes عن طريق تسخين وسحب رقيقة الجدار البورسليكات الشعرية أنابيب في مجتذب micropipette باستخدام نفس إعدادات لصنع إبر حقن مكروي.
2. تحت المجهر تشريح، والمفاجئة قبالة غيض من micropipette إلى ما يقرب من 200 ميكرون في القطر بالملقط.
3. شطبة الحافة المكسورة مع microgrinder في البداية إلى 35 درجة، تليها الميلا الثاني عند 25 درجة. ضمان طرف حاد وSMOالغير. متجر الانتهاء micropipette مشطوف في طبق بتري على كمية صغيرة من الطين.

3. إعداد الزرد اليرقات

1. 7 أيام قبل الجراحة، وإنشاء خزانات التزاوج من الزرد الذكور والإناث.
2. جمع الأجنة في صباح اليوم التالي، 3 ساعة بعد تتسلط الأضواء على لضمان أقصى قدر من العائد. في حالة استخدام خط مراسل المعدلة وراثيا مثل تيراغرام (elevl3: EGFP) ^knu3 والأجنة المخصبة نوع 100/100 مم لوحة في 25 مل من E3 في 28.5 درجة مئوية. إذا باستخدام wildtype، المخصبة نوع الأجنة 25/100 مم لوحة في 25 مل من E3 في 28.5 درجة مئوية.
3. في حالة استخدام خط مراسل، وشاشة الأجنة للتعبير الفلورسنت في 48 HPF. تسمح الأجنة التي تم تحديدها لتنضج في كثافة 25/100 مم لوحة في 25 مل من E3 في 28.5 درجة مئوية.
4. عندما اليرقات هي 5 DPF، وإعداد لوحة لعملية جراحية من خلال تغطية Sylgard مع E2 + 10 ملغم / لتر جنتاميسين سلفات (GS) + تريكين.
   1. إعداد طبق الانتعاش بإضافة 25 مل E2 + GS إلى 100 ملم ديس بيتريح.
   2. إعداد مشرط عن طريق تسجيل ثلاث مسحات معا. وهذه تشكل أداة الثلاثي مع ثلاثة أخاديد.
   3. شن micropipette أعدت على مسحات عن طريق تسجيل ذلك في واحدة من الأخاديد.
5. إذا إعادة استخدام بال micropipettes، دافق حتى واضح مع E2 + GS باستخدام حقنة 1ML و27 G إبرة قبل المتزايدة على مسحات.

4. جراحة

1. تخدير 1 لوحة من اليرقات في كل مرة (25 الأسماك) مع تريكين. يتم تخدير الأسماك بما فيه الكفاية عندما لم يعد يحمل استجابة اللمس. من المهم أن الأسماك هي تخدير تماما قبل الجراحة، وإلا فإنها سوف نشل عندما مشرط مسها. يتم إجراء الجراحة تحت المجهر تشريح.
2. نقل اليرقات لوحة الجراحة.
   1. تحت الأقصى التكبير، وتناوب يرقة واحدة في وقت واحد بحيث انها تقع على جانبها مع عودتها الأقرب إلى يد تمسك مشرط.
   2. موقف ملقط بحيث ترتكز على Sylgard،الزاوية أكثر من عرض من اليرقة.
   3. تستعد مشرط الزجاج ضد واحدة من الأسلحة من ملقط، وقطع في الوجه الظهري الجانبي لليرقة على مستوى المسام الشرج، ويجري التأكد من عدم قطع ما وراء حافة بطني من الحبل الظهري. تحريف مشرط لقطع الحبل الشوكي.
   4. كرر مع اليرقات المتبقية.
      ملاحظة: إذا ينزف يرقة، فإنه لن يتعافى من عملية جراحية. على الفور إزالة اليرقة من لوحة الجراحة والموت ببطء ذلك عبر تريكين جرعة زائدة.
3. مرة واحدة لعملية جراحية على دفعة من اليرقات كاملة، ونقل الجرحى الحيوانات لوحة الانتعاش. هذا هو لدعم تبادل المعلومات من التخدير.
   1. تحذير: عند جمع اليرقات لنقل المصابين، تأكد من أنها جمعت الرأس أو الذيل الأول: لا تشدد على موقع الإصابة عن طريق الانحناء اليرقات.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدامها جميع الأجهزة المستخدمة لإجراء عملية جراحية، بما في ذلك بال micropipettes.

5. استعادة

1. آرأصيب ansfer اليرقات من لوحة الاسترداد إلى 100 ملم لوحات مليئة 25 مل E2 + GS في كثافة 25/plate. السماح لاسترداد في حاضنة 28.5 درجة مئوية.
2. تحقق لوحات اليومية، وإزالة الحيوانات المريضة والنافقة. لا تتغير وسائل الإعلام حتى Coleps (البروتوزوا المياه العذبة) واضحة في وسائل الإعلام. عند تغيير وسائل الإعلام، لا نقل الأسماك إلى لوحة جديدة؛ بدلا من ذلك، إزالة وسائل الإعلام قدر الإمكان والفيضانات نفس اللوحة مع وسائل الإعلام الجديدة. كرر حسب الضرورة للحد من السكان Coleps.
3. تغذية يومية مع كمية صغيرة من مسحوق يرقات الغذاء.
   ملاحظة: الغذاء لايف (على سبيل المثال، أو باراميسيا الروتيفر) لا يمكن تغذية اليرقات على المصاب إلا بعد أن تعافى الحركة. خلاف ذلك، فإن الأغذية الحية استعمار موقع الإصابة وتقتل اليرقات.

النتائج

للحد من شدة تلف الأنسجة المحيطة بموقع الإصابة، الميلا السليم من micropipette أمر بالغ الأهمية. ويبين الشكل 1A تلميح مشطوف بشكل صحيح. باستخدام تلميح بأن واسعة جدا (1B الشكل) يميل إلى نتيجة في عدد القتلى أعلى نظرا لاحتمال زيادة الخدش الأبهر الظهري، في حين أن الطرف الذي هو ضيق جدا (الشكل 1C) يميل إلى وهلة قبالة الجلد بدلا من قطع الأنسجة.

لممارسة هذه التقنية، فإنه من...

المناقشة

عندما تعلم هذه التقنية في البداية، ونحن نوصي محاولة لا أكثر من 50-100 transections في جلسة واحدة. بعد اتقان هذه التقنية، ونحن قادرون على القطع يصل إلى 300 الأجنة في ساعة؛ ومع ذلك، فإن هذا المستوى من الإنتاجية يتطلب بضعة أشهر من الممارسة الأسبوعية. نوصي أيضا ممارسة مع خط مراسل والتحقق من transection كاملة حتى يتم تقليل حدوث ناقصة transection الحبل الشوكي إلى أقل من 1٪.

transection الحبل الشوكي في الزرد الكبار هي ت...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
طبق بتري 60 مم	VWR	82050-544
100 مم طبق بتري	VWR	89038-968
PDMS ، Sylgard 184 مجموعة مطاط سيليكون	فيشر Scientific	NC9644388
أنابيب شعرية البورسليكات: OD 1.00 مم ، معرف 0.78 مم	شركة Warner Instruments Inc.	64-0778
ملقط	الأدوات العلمية الدقيقة ، Inc.	11252-30
مجهر	تشريح نيكون	SMZ6454
مطحنة دقيقة	Narishige	EG-44
جنتاميسين كبريتات	أمريسكو	0304-5 جم	يذوب في الماء 10 مجم / مل ، ويخزن في -20 درجة ؛ C
Tricaine	Acros Organics	118000100
قضيب قطني ذو رأس ، خشب ، 6 بوصة	فيشر سيانتيفيك	23-400-101
1 مل حقنة	BD	309625
27 جم إبرة	BD	305109
Fry food	Argent	Labs F-ARGE-PTL-CN	store عند -20 درجة ؛ C
مجتذب الماصات	الدقيقة Sutter Instrument Co.	نموذج P-97	صندوق خيوط FB330B
<قوي>20x E2 (1 لتر) ؛ متجر < / قوي > في RT
17.5 جم كلوريد الصوديوم	فيشر Scientific	S671-500
0.75 جم KCl	Fisher Scientific	P217-500
2.90 جم CaCl 2< / sub>· ؛ 2H2O	Sigma	C7902-500G
4.90 g MgSO4& middot; 7H2O	Merck	MX0070-1
0.41 g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12 g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10 مل); < / قوي > جعل طازجة ، وتخلص من
0.35 جم إضافي من NaCO3< / sub>	Sigma	S5761
<قوي>1x E2 (1 لتر) ؛ < / قوي > يحفظ في RT
50 مل 20x E2
2 مل طازج 500x NaCO3< / sub>