يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التعبير عابرة من البروتينات عن طريق هيدرودينامي الجينات في الفئران التسليم

28.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51481

⸱

مايو 5, 2014

 , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College, CUNY

في هذه المقالة

ملخص

في ترنسفكأيشن المجراة من الحمض النووي عارية عن طريق التسليم الجين الهيدروديناميكية يدخل الجينات في الأنسجة حيوان مع الحد الأدنى من الاستجابة الالتهابية. تتولد كميات كافية من الجين المنتج بحيث ظيفة الجين والتنظيم فضلا عن بنية البروتين وظيفة يمكن تحليلها.

الملخص

التعبير كفاءة من الجينات المحورة في الجسم الحي هو من الأهمية بمكان في دراسة وظائف الجينات وتطوير علاجات للأمراض. على مدى السنوات الماضية، والتسليم الجين الهيدروديناميكية (HGD) برز بوصفه وسيلة بسيطة وسريعة وآمنة وفعالة لإيصال الجينات المحورة في القوارض. تعتمد هذه التقنية على القوة الناتجة عن حقن السريع لكمية كبيرة من محلول الفسيولوجية لزيادة نفاذية أغشية الخلايا من الأجهزة perfused وبالتالي تقديم الحمض النووي في الخلايا. واحدة من المزايا الرئيسية لHGD هو القدرة على إدخال الجينات المحورة في خلايا الثدييات باستخدام الحمض النووي البلازميد عاريا (PDNA). إدخال جين الخارجية باستخدام البلازميد هو شاقة الحد الأدنى، كفاءة عالية و، خلافا لناقلات الفيروسية وآمنة بشكل ملحوظ. واستخدمت في البداية لتقديم HGD الجينات في الفئران، ويتم استخدامه الآن لتقديم مجموعة واسعة من المواد، بما في ذلك [أليغنوكليوتيد، الكروموسومات الاصطناعية، RNA، البروتينات والجزيئات الصغيرة في الفئران والجرذانو، إلى درجة محدودة، والحيوانات الأخرى. يصف هذا البروتوكول HGD في الفئران، ويركز على ثلاثة جوانب رئيسية للطريقة التي تعتبر بالغة الأهمية لتنفيذ الإجراء بنجاح: الإدراج الصحيح للإبرة في الوريد، الحقن حجم وسرعة التسليم. يتم إعطاء أمثلة لإظهار تطبيق هذا الأسلوب إلى التعبير عابرة من اثنين من الجينات التي تكود يفرز والبروتينات الرئيسيات محددة، ئي LI (APOL-I) والبروتين المتصلة هابتوغلوبين (HPR).

المقدمة

ليو وآخرون. وتشانغ وآخرون، أصبح إيصال الجينات الهيدروديناميكية (HGD) منذ أول وصف من قبل أداة لا تقدر بثمن لدراسة وظائف الجينات في نظم نموذج القوارض 1، 2. والأسلوب الذي ينطوي على حقن السريع (5-7 ثانية) من حجم كبير (8-12٪ من وزن الجسم) من الحل في الوريد ذيل الفئران لتسهيل امتصاص الحمض النووي البلازميد بواسطة خلايا الأعضاء المستهدفة 1، 2. هذه الظروف تؤدي إلى التعبير الجيني قوية في الكبد وأقل التعبير الجيني في الكلى والطحال والرئة والقلب.

حقن 10 ميكروغرام pCMV-LacZ البلازميد يمكن بالنقل بقدر 40٪ من خلايا الكبد، مما يجعل HGD الأكثر كفاءة، غير الفيروسية، في الجسم الحي طريقة إيصال الجينات إلى تاريخ 1. على عكس شركات الطيران الفيروسية، PDNA هي سهلة التحضير، لا تثير استجابة مناعية في المضيف القوارض 3 و لا تشكل مخاطر على الصحة من خلال إعادة مزج مع نهايةogenous الفيروسات. بالإضافة إلى ذلك، منذ جزيئات الحمض النووي التي ألقاها HGD لا تحتاج التعبئة والتغليف، وهذا الأسلوب هو مناسبة لإيصال الكروموسومات البكتيرية المصطنعة (BAC) كبيرة مثل 150 كيلو بايت 4. أنواع أخرى من الجزيئات التي تم تسليمها من خلال طريقة الهيدروديناميكية تشمل الحمض النووي الريبي 5-10، morpholinos 11، والبروتينات 12 و 13 و الجزيئات الصغيرة الأخرى 12 و 14. وقد نوقشت مزايا ومساوئ HGD أكثر من غيرها من طرق التسليم في الاستعراضات ممتازة في الأدب 15-20 وقدمت عددا من الكتاب وصفا تفصيليا للإجراءات 21-23.

إدخال الجينات المحورة في الفئران عن طريق HGD هي آمنة وفعالة 1-3، 24، واستخدمت الأسلوب في الفئران مقارنة مع النجاح 25. مع بعض التعديلات، وقد أجريت إثبات صحة مفهوم التجارب في الدجاج 26، راببت 27 و 28 الخنازير، على الرغم من أن في الجسم الحي تطبيق هذه التقنية في الحيوانات الكبيرة لا تزال تشكل تحديا. عند استخدام هذا الأسلوب، الحد آخر شائع هو أن العديد من ناقلات التعبير الثدييات المتاحة تفتقر إلى المكونات لتحقيق الثابتة، ومستوى عال من التعبير الجيني. باستخدام pCMV لوك البلازميد، التعبير الجيني في الأجهزة المستهدفة هو واضح في وقت مبكر بعد عشر دقائق HGD، ومع ذلك، يسقط الأولية، وارتفاع مستوى التعبير بشكل حاد في الأسبوع الأول بعد الحقن 1. طويلة الأجل التعبير التحوير من الممكن اعتمادا على المروج وإنترون المستخدمة في تصميم البلازميد 3، 24 الحقن ومع ذلك، والحفاظ على التعبير الجيني على مستوى عال في كثير من الأحيان يتطلب المتكررة. لهذا السبب، HGD قد تكون أقل مناسبة لدراسة الأمراض المزمنة التي هي نتيجة التعرض الطويل الأمد للبروتينات ضارة أو منتجات البروتين. مع هذه القيود، HGD هو أداة قوية بشكل استثنائي لدراسة بودور tential من الجينات وتأثير ذلك المسوخ في الجسم الحي، فضلا عن الآثار العلاجية وتنظيم البروتينات وإنشاء نماذج حيوانية من المرض (للمراجعة، انظر 15). على سبيل المثال، HGD يمكن أن تستخدم لتعيين وظيفة إلى مجالات والأحماض الأمينية للبروتينات بشكل فردي عن طريق إدخال مختلف بنيات الجينات في الفئران التي طرقت الجينات المعنية بها. علاوة على ذلك، هذه التقنية يمكن استخدامها في أي سلالة الماوس.

يصف هذا البروتوكول HGD في الفئران مع التركيز على الجوانب الفنية اللازمة لتحقيق النجاح ترنسفكأيشن: غرز الإبرة الصحيح في الوريد، الحقن حجم وسرعة التسليم. ويتجلى في تطبيق هذا الأسلوب في نموذج الفأر من داء المثقبيات الأفريقي، وهو مرض قاتل للبشر والماشية 29، 30. بينما عدة أنواع من المثقبيات يسبب مرض في الماشية، ومعظم لا يمكن أن تسبب المرض لدى البشر بسبب المركبات المناعية الفطرية في بlood تسمى عوامل التحللي المثقبيات (TLFs) 29، 31، 32. تشكيل هذه المسام، والبروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDL) تحتوي على اثنين فريدة من نوعها، الرئيسيات محددة البروتينات: HPR، يجند، مما يسهل امتصاص TLFs في المثقبيات، وAPOL-I، المكون التحللي 31، 33-38 المثقبية البروسية الروديسية قادر على إصابة البشر بسبب التعبير عن المقاومة المرتبطة البروتين مصل (SRA) التي تربط لويحيد الإنسان APOL-I 34، 39. لم يتم تحييد البابون TLF بواسطة حساب الاحتياطي الخاص نظرا لاختلاف APOL-I البروتين 40. كما ذكرت سابقا، وذلك باستخدام ناقلات التعبير الثدييات (pRG977)، والتعبير المعدلة وراثيا من البابون مكونات TLF في الفئران تمنح حماية ضد المثقبيات للعدوى الإنسان 40. إظهار بيانات تمثيلية المقدمة هنا كيف يمكن تطبيق إيصال الجينات الهيدروديناميكية لدراسة الآثار العلاجية للبروتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب وصفها هنا من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام كلية هانتر، جامعة مدينة نيويورك.

1. إعداد الحمض النووي البلازميد خالية من الذيفان الداخلي

  1. اختيار مستعمرة واحدة من البكتيريا التي تحتوي على الجينات في المصالح في ناقلات التعبير الثدييات من لوحة انتقائية يشوبه طازجة.
  2. متابعة التوصيات وجدت في كتيب من المتاحة تجاريا خالية من الذيفان الداخلي عدة تنقية البلازميد لزراعة وحصاد البكتيريا.
  3. تنقية البلازميد الحمض النووي خالية من الذيفان الداخلي من الخلايا البكتيرية عن طريق اتباع بروتوكول المتاحة تجاريا خالية من الذيفان الداخلي عدة تنقية البلازميد.
  4. استخدام خالية من الذيفان الداخلي البلاستيك وير والتعامل مع الحمض النووي مع الحرص على ضمان عدم إعادة عرض أن الذيفان الداخلي في عينة من الحمض النووي بعد خطوة الإزالة.
  5. قياس تركيز الحمض النووي البلازميد خالية من الذيفان الداخلي من خلال تحديد الامتصاصية أعمالها في 260 نانومتر باستخدام ميكرس حجم طيفي للأشعة فوق البنفسجية كما هو موضح أدناه أو معيار، معمل القائم كفيت.
    1. تنظيف السطوح البصرية السفلي والعلوي من النظام الاحتفاظ عينة معمل الصغرى على النحو التالي. ماصة 1 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات نظيفة على النظام البصري أقل. إغلاق ذراع الرافعة واضغط عليها عدة مرات ليستحم النظام البصري العلوي، ثم ذراع مفتوحة ونظيفة يمسح بمنديل.
    2. افتح البرنامج من معمل الصغرى وحدد الوحدة النمطية الأحماض النووية.
    3. وضع 1 ميكرولتر ماء منزوع الأيونات نظيفة على النظام البصري أقل، وانخفاض ذراع الرافعة وحدد "تهيئة" من برنامج البرنامج. مرة واحدة هو تهيئة السطوح كاملة ونظيفة سواء البصرية بمنديل ..
    4. أداء القياس فارغة عن طريق تحميل 1 ميكرولتر من الذيفان الداخلي خالية من TE العازلة (10 ملي تريس، الكلورين، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA) واختيار "على بياض" من برنامج البرنامج. مرة واحدة ويتم قياس فارغة، السطوح النظيفة سواء البصرية معالأنسجة.
    5. أداء قياس عينة عن طريق تحميل 1 ميكرولتر من عينة الحمض النووي خالية من الذيفان الداخلي واختيار "تدبير" من برنامج البرنامج. تسجيل تركيز الحمض النووي. تقييم نقاء الحمض النووي من خلال تسجيل نسبة الامتصاصية 260/280 نانومتر التي تظهر على الشاشة. منذ استخدام الحمض النووي النقي (260/280 نسبة 1.8) لHGD مرغوب فيه للغاية، وتجنب استخدام عينة الحمض النووي مع نسبة 260/280 1.7 أدناه. مرة واحدة ويتم قياس، وتنظيف كل السطوح البصرية بمنديل.

2. وزن الفئران

  1. علامة الفئران في المناسبة بطريقة لسلالة. ملاحظة: بمناسبة الذيل لا ينصح لهذا الإجراء.
    1. أنواع الماوس علامة أن يكون الفراء الأبيض (مثل بستر السويسرية) على ظهورهم مع علامة سوداء. تطبيق علامات بمرور الوقت حسب الضرورة.
    2. الأنواع التي لها علامة الماوس الفراء الأسود (على سبيل المثال C57BL / 6) عن طريق الأذن اللكم عدة أيام مقدما.
  2. وزن الفئران individuaLLY عن طريق وضعها برفق في وزنها عموم الحيوان أو دلو وضعها على ميزان المختبرات الرقمية. تسجيل وزن كل فأر استخدمت في التجربة، في يوم من التجربة.

3. إعداد الحقن

  1. إعداد مزيج الحقن
    1. حساب كمية الحمض النووي التي يحتاجها افتراض 5-50 ميكروغرام خالية من الذيفان الداخلي الحمض النووي البلازميد لحقن كل فأر.
      1. تحديد المبلغ الأمثل من الحمض النووي البلازميد تجريبيا.
      2. عند تحديد كمية الحمض النووي المطلوبة، افترض حقن الماوس إضافية واحدة لكل مجموعة، والتحميل الصحيح للمحاقن وسوف تتطلب بعض مزيج حقن إضافية. للمساعدة في العمليات الحسابية، والنظر في المثال التالي: 4 حقن فئران التجارب و 4 السيطرة، تزن كل منها 25 غرام، مع 50 ميكروغرام البلازميد الحمض النووي في الماوس. لتحديد كمية الحمض النووي المطلوب في هذه الحالة، وحساب مع 5 الفئران في كل مجموعة: 5 × 50 = 250 ميكروغرام ميكروغرام DNA اللازمة لكل مجموعة.
    2. تحديد كمية من المياه المالحة (0.9٪ كلوريد الصوديوم) التي يحتاجها افتراض 10٪ من وزن الجسم لحقن كل فأر.
      1. وفقا للمثال أعلاه، وضخ كل 25 ز الفأر مع 50 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في 2.5 مل المالحة (2.5 غرام من المواد السائلة).
      2. عند تحديد كمية من المياه المالحة المطلوبة للحصول على مجموعة كاملة من الفئران، افترض حقن فأرة إضافية لكل مجموعة للسماح للتحميل السليم للمحاقن. دراسة التجربة معين، حساب كمية من المياه المالحة اللازمة ل5 الفئران في كل مجموعة: 5 × 2.5 = 12.5 مل مل المالحة لكل مجموعة (أو 25 مل المجموع). ملاحظة: إذا الفئران ضمن المجموعة ذاتها ليست هي نفس الوزن (الفرق أكثر من 10٪ في وزن الجسم)، وإعداد حقن يمزج بشكل منفصل.
    3. استخدام المواد الحافظة وخالية من الذيفان الداخلي، ملحي معقم التي تمت الموافقة للاستخدام البشري، في 10 مل، قوارير متعددة الاستخدامات.
    4. باستخدام إبرة عيار 20 (0.9 ملم × 25 ملم) تعلق على معلومات سرية بالتركيبة خصلة من حقنة 20 مل،سحب السائل من قوارير المياه المالحة وإفراغ الحقن في أنبوب مخروطي 50 مل. للمساعدة pipetting لدقيقة من المياه المالحة خلال إعداد يمزج حقن الحمض النووي المالحة، وجمع أكثر ملوحة مما يجب لحقن جميع الفئران في التجربة. للتجربة أعلاه، سحب المياه المالحة من 3، 10 مل قارورة (أي ما مجموعه حوالي 30 مل) حتى لو كان المبلغ المحسوب من المياه المالحة اللازمة للتجربة فقط 25 مل.
    5. ماصة المبلغ المحسوب من الحمض النووي في 50 مل أنبوب مخروطي مختلفة. والحرص على عدم لمس الجانب من الأنبوب مع الجسم ماصة لتجنب إدخال الذيفان الداخلي. وفقا لسبيل المثال، ماصة 250 ميكروغرام من السيطرة و 250 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد التجريبية في أنابيب مخروطية منفصلة.
    6. إضافة المبلغ المطلوب من المياه المالحة على الحمض النووي باستخدام ماصة المصلية. دراسة التجربة العينة، ماصة 12.5 مل المالحة إلى كل من يمزج الرئيسي (التجريبية والضابطة).
    7. السماح لجميع الحلول للوصول إلىدرجة حرارة الغرفة قبل الحقن.
  2. إعداد الحقن
    1. لكل الماوس، وملء العقيمة، 3 مل، بالتركيبة قفل حقنة مع مزيج الحمض النووي المالحة باستخدام العقيمة، إبرة عيار 20 (0.9 مم × 25 مم). الحرص على تجنب فقاعات الهواء. تجنب استخدام المحاقن حجم العالي ومعدل تدفق الحقن لا يمكن السيطرة عليها بشكل جيد للغاية، وأنه من الصعب التعامل مع المحاقن أكبر في يد واحدة. إخراج أي مزيج الحمض النووي المالحة الزائد مرة أخرى إلى أنبوب مخروطي لأن هذا قد يكون إعادة استخدامها.
    2. تبديل إبرة معقمة ل، 27 عيار إبرة. ملء الإبرة مع السائل تماما دون إدخال فقاعات الهواء. ضبط مستوى الصوت من مزيج الحمض النووي المالحة كما تحسب على أساس الوزن من الفأرة.
    3. لا تسمح الإبرة لم يسبق لهم اللعب للمس أي سطح غير معقمة. إذا لزم الأمر، والإبر يجوز إعادة توج باستخدام تقنية بيد واحدة: وضع غطاء على سطح مستو، أدخل الإبرة دون التمسك الغطاء مع جهة أخرى والضغط على إبرة توجضد كائن شركة لتأمين الغطاء على الإبرة. الحقن هي الآن جاهزة للحقن الوريد الذيل.

4. تسليم الحمض النووي هيدرودينامي

  1. ملاحظة أن الفئران قد يقلل من جدوى التخدير. تجنب إجراء HGD في غرفة باردة جدا، وهذا سوف يقلل أيضا من قدرتها على البقاء. إذا كانت الغرفة لديها درجة حرارة الغرفة من 20 درجة مئوية أو إذا كان استخدام التخدير، وضع الفئران على وسادة التدفئة وضعت في 37 ° C الإجراء آخر لتجنب فقدان أي الحيوانات. إذا باستخدام التخدير، والتأكد من أن الفم والخطم من الفأرة هي حين دون عائق على لوحة الحرارة ومراقبة الماوس حتى يتعافى تماما. لا تحجب الغذاء أو المياه من الفئران قبل HGD.
  2. تدفئة الفئران لتمدد الأوعية الدموية.
    1. وضع القفص الماوس (مع تضمين الفراش) على وسادة الحرارة لمدة 5 دقائق حتى يتسنى للحرارة الفراش ما يقرب من 38-39 درجة مئوية. يجب أن تكون درجة الحرارة منخفضة بما فيه الكفاية للحفاظ على الفئران على منصة الحرارة لفترة ممتدة.
    2. بدلا من ذلك، ضع الماوس إلى كابح الوصول الظهرية مع الحد الأدنى من ضبط النفس. تدفئة ذيل الماوس لمدة 1 دقيقة من خلال عقد برفق بقطعة من الشاش المبللة بالماء الدافئ. السماح الماوس لإعادة الموقف، إذا لزم الأمر. مسح الذيل بمنديل لتجف.
    3. بدلا من ذلك، عن طريق وضع الماوس دافئ قفص تحت مصباح الحرارة لمدة لا تزيد عن 2 دقيقة. إذا باستخدام مصباح الحرارة، وتوخي الحذر لتجنب ارتفاع درجة حرارة الماوس.
  3. كبيرة الحجم حقن الوريد الذيل
    1. شل على وصول كابح الظهرية على سطح مستو بواسطة شريط المختبر.
    2. عقد من ذيله، ضع الماوس برفق في كابح وتضاف المكونات. استخدام أقل قدر من ضبط النفس الضروري للحفاظ على الذيل يجمد. تأكد من أن الماوس يتنفس بحرية.
    3. إذا كان الفأر هو في محنة شديدة في أي لحظة أثناء الإجراء، وإزالة الماوس من كابح على الفور والسماح لها للراحة.
    4. ضع الماوس حتىواحد من الأوردة الذيلية الوحشي مرئيا. تحديد موقع الأوردة الذيلية الجانبية من خلال النظر لأسفل على التوالي في الجزء الخلفي من الماوس: الخط الأحمر على التوالي في منتصف الذيل هو الشريان، في حين أن خطوط زرقاء على جانبي الذيل هي عروق الذيلية الجانبية.
    5. مسح ذيل الماوس تماما مع مسحة الكحول.
    6. استخدام اليد غير الحقن، وعقد ذيل بإحكام بين السبابة والوسطى بحيث يمر ذيل تحت السبابة، على الوسط والأصابع الثالث وتحت الإصبع الصغير. تسمح الإبهام لتظل حرة للتحرك. (الشكل 1A)
    7. باستخدام ناحية أخرى، ومسح المنطقة المراد حقنها مرة أخرى مع مسحة الكحول. تسمح المنطقة لتجف.
    8. التقط حقنة محملة اليد الحقن والاحتفاظ بها من قبل برميل بين الإبهام وغيرها من أربعة أرقام. لا التمسك المكبس.
    9. وضع مواز حقنة لالذيل، حيث يشير الإبرة نحو الجسم من الفأرة وشطبة (مائلة حافة) من الإبرة مواجهة.
    10. ادخال الإبرة في الوريد الذيل. المضي قدما في حقن فقط إذا كان موجودا في الوريد بشكل صحيح، وهو ما يتضح من الإبرة في انزلاق مع عدم وجود المقاومة. علما بأن عمق غرز الإبرة هو مسألة تفضيل شخصي ومع ذلك، لا ينصح الإدراج الكامل بسبب زيادة خطر القص من الوريد. تجنب تحريك الإبرة.
    11. باستخدام الإبهام من اليد عقد الذيل، وتغلق على محور الإبرة ومركز الصحافة ضد الذيل لعقد إبرة في الموقف. لا تنطبق ضغط شديد وليس التمسك رمح الإبرة، وهذه سوف تعيق تدفق السائل في الوريد. عقد ذيل مع السبابة فضفاضة عند هذه النقطة حتى لا تعوق حقن (الشكل 1A).
    12. إعادة وضع اليد عقد حقنة بحيث السبابة والاصبع الوسطى والتمسك شفة والإبهام على نهاية المكبس (الارقام ..ه 1A).
    13. اضغط لأسفل على الغواص في واحد، حركة مستمرة وحقن حجم الكامل للسيولة في 6-8 ثانية.
    14. إزالة الإبرة من الوريد ووقف النزيف من خلال تطبيق ضغط لطيف على ذيل بمنديل.
    15. إزالة الماوس من كابح ومكان الماوس في قفص الانتعاش وضعت على رأس وسادة التدفئة (يجب أن يكون الفراش 37-38 درجة مئوية). إذا كانت الغرفة هي حقن الباردة، هذه الخطوة هو أمر حاسم لبقاء الماوس. التمسك ذيل الماوس حتى يتوقف النزيف تماما.
    16. مراقبة الماوس لمدة 1 ساعة بعد الولادة الحمض النووي الهيدروديناميكية. فترة أولية من يلهث والجمود أمر طبيعي نظرا لعدم انتظام ضربات القلب المؤقتة الناجمة عن HGD ولكن تأكد من أن الماوس يظهر علامات على الانتعاش في حوالي 5 دقائق. إذا كان التنفس من الفأرة يصبح ضحل جدا، والتدليك بلطف البطن من الفأرة لتسهيل التنفس. نلاحظ أن معدل التعافي قد تتأثر قليلا من سلالة الماوس المستخدمة.
    17. عودة الماوسإلى القفص الإسكان وضمان أن الفأر لديه وفرة من الغذاء والماء.
  4. كبيرة الحجم الذيل الوريد الحقن باستخدام وضع اليد البديلة
    1. ضع مؤشر الفأرة إلى كابح والاستعداد للحقن عن طريق اتباع الخطوات 4.3.1 4.3.5 من خلال، كما هو موضح سابقا.
    2. راحة اليد غير الحقن على سطح مستو مع أربعة أصابع عازمة في زاوية تسعين درجة. يجب الأصابع (كل ما عدا الإبهام) راحة على رأس كل منهما الآخر، وخلق منصة. عقد ذيل الماوس بين الإبهام وتوجيه أصابع الاتهام (الشكل 1B).
    3. باستخدام ناحية أخرى، ومسح المنطقة المراد حقنها مرة أخرى مع مسحة الكحول. تسمح المنطقة لتجف.
    4. الاستيلاء على حقنة مع اليد الحقن والاحتفاظ بها من قبل شفة ونهاية المكبس، وعلى استعداد للحقن.
    5. استكمال إجراءات باتباع هذا البروتوكول من خلال خطوة خطوة 4.3.9 4.3.17، كما هو موضح سابقا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الموضع الصحيح من الإبرة في الوريد ذيل الماوس (كما هو موضح في الشكل رقم 1) هو شرط أساسي لتقديم بنجاح التحوير من قبل ترنسفكأيشن مقرها الهيدروناميكا. في كثير من الأحيان الجزء الأكثر تحديا للتقنية، ومع ذلك، هو الإبقاء على إبرة داخل الوريد الذيل دون حركة بحيث يمكن أن يتم تسليم وحدة التخزين بالكامل من الحقن خلال مدة 6-8 ق. أخطاء طفيفة خلال عملية الحقن قد يؤدي إلى انخفاض كبير كفاءة ترنسفكأيشن والبروتين التعبير. وبالتالي، لا بد من رصد نجاح HGD لكل تجربة. إذا كان البروتين ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

عندما يقوم بشكل صحيح، HGD هو وسيلة آمنة وفعالة بشكل ملحوظ التسليم التحوير. الخطوات الحاسمة لنجاح HGD هي: 1) تسليم كمية مناسبة من الحمض النووي في كمية كبيرة من المركبات المالحة 2) في الوريد ذيل الفأر 3) في أقل من 8 ثوان.

على الرغم من أن عملية الحقن لا يمكن إنكاره في حد ذاته يتطلب بعض البراعة اليدوية، ونجاح هذا الإجراء ست الثانية في كثير من الأحيان يكمن في إعداد دقيق للتجربة. كمية PDNA اللازمة لتحقيق أقصى قدر من ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

نشكر ليو شيا (Regeneron صيدلة) ليعلمنا هذا الأسلوب في البداية HGD والدكتور راسيل طومسون (كلية ألبرت اينشتاين للطب) للتوجيه المستمر له في مختلف جوانب التكنولوجيا. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل كلية هانتر، جامعة مدينة نيويورك بدء الأموال والجائزة NSF الخبز IOS-1249166. نشكر NYULMC التشريح المرضي مركز كور NYUCI دعم غرانت، المعاهد الوطنية للصحة / NCI 5 P30CA16087-31 لالأنسجة في كبد الفأر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

كحول BD نقل المواد حقنة
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
التحضير للمسحWebcol6818
AST ، Amplite ColorimetricAAT Bioquest13801
أنبوب مخروطي ، 50 ملBD Falcon352070
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362
KimWipesKIMTECH34120
Mouse Tail IlluminatorBraintree ScientificMTI RSTأو ما يعادلها
إبرة ، 20 جيجا × 1 (0.9 مم × 25 مم)إبرة305175
، 27 جيجا × 1/2 (0.9 مم × 25 مم)BD305109
pRG977 (ناقل تعبير الثدييات) اتفاقيةالصيدلانيةRegeneron المطلوبة
كلوريد الصوديوم ، 0.9٪ INJ USP 10 مل ، Hospira & nbsp ؛فيشر NC9054335
، 3 مل ، Luer-Lok TipBD309657Luer Lock ضروري لتحمل الضغط من HGD

المراجع

  1. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  2. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).
  3. Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther. 3, 947-957 (2001).
  4. Magin-Lachmann, C., et al. In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods. J Gene Med. 6, 195-209 (2004).
  5. Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences. J Virol. 75, 3469-3473 (2001).
  6. Giladi, H., et al. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther. 8, 769-776 (2003).
  7. Kobayashi, N., et al. Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression. J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).
  8. Layzer, J. M., et al. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. Rna. 10, 766-771 (2004).
  9. McCaffrey, A. P., et al. RNA interference in adult mice. Nature. 418, 38-39 (2002).
  10. McCaffrey, A. P., et al. Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice. Mol Ther. 5, 676-684 (2002).
  11. McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice. Hepatology. 38, 503-508 (2003).
  12. Zhang, G., et al. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther. 11, 675-682 (2004).
  13. Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures. J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).
  14. Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery. J Gene Med. 6, 584-592 (2004).
  15. Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research. Pharm Res. 28, 694-701 (2011).
  16. Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. Aaps J. 11, 671-681 (2009).
  17. Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. Aaps J. 9, (2007).
  18. Herweijer, H., Wolff, J. A. Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery. Gene Ther. 14, 99-107 (2007).
  19. Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels. Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).
  20. Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D. Hydrodynamic delivery. Adv Genet. 54, 65-82 (2005).
  21. Bell, J. B., et al. Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection. Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).
  22. Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach. Cell Commun Signal. 11, (2013).
  23. Knapp, J. E., Liu, D. Hydrodynamic delivery of DNA. Methods Mol Biol. 245, 245-250 (2004).
  24. Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth. Hepatology. 33, 848-859 (2001).
  25. Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4, 333-341 (2002).
  26. Hen, G., et al. Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo. Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).
  27. Eastman, S. J., et al. Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA. Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).
  28. Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).
  29. Vanden Bossche, P. Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa. Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).
  30. Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control. Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).
  31. Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. Characterization of primate trypanosome lytic factors. Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).
  32. Pays, E., et al. The trypanolytic factor of human serum. Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).
  33. Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum. Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).
  34. Vanhamme, L., et al. Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum. Nature. 422, 83-87 (2003).
  35. Nielsen, M. J., et al. Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein. Blood. 108, 2846-2849 (2006).
  36. Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes. Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).
  37. Perez-Morga, D., et al. Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes. Science. 309, 469-472 (2005).
  38. Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model. J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).
  39. Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei. Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).
  40. Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).
  41. Genovese, G., et al. Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans. Science. 329, 841-845 (2010).
  42. Tzur, S., et al. Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene. Hum Genet. 128, 345-350 (2010).
  43. Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14, 129-137 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التعبير البروتيني العابرالحمض النووي البلازميدي العاريالحقن في الوريد الذيليتحليل لطخة ويسترنأخذ عينات دم الفئرانتحضير الحمض النووي البلازميديتقنية تعبئة المحقنةالحفاظ على وضعية الإبرةالكشف عن APOL-I HPR
التعبير عابرة من البروتينات عن طريق هيدرودينامي الجينات في الفئران التسليم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.