مقالة منهجية

على الإحاطة الفحص: بروتوكول لتقييم التفاعلات بين الخلايا العصبية والجهاز العصبي المركزي البالعات

DOI:

10.3791/51482

⸱

يونيو 8, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية مقيم في الجهاز العصبي المركزي (CNS) مع قدرة عالية على يبلعم أو تبتلع المواد في بيئتهم خارج الخلية. هنا، يوصف مقايسة المطبقة على نطاق واسع وموثوق بها، والكمية غاية لتصور وقياس بوساطة الخلايا الدبقية الصغيرة بابتلاعها من مكونات متشابك.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلعمة هي العملية التي خلية تبتلع المواد (الخلية بأكملها، وأجزاء من خلية، والحطام، وغيرها) في البيئة خارج الخلية المحيطة بها وبالتالي يساعد على هضم هذه المواد، عادة من خلال تدهور الليزوزومية. الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية مقيم في الجهاز العصبي المركزي (CNS) والتي تم وصفها في مجموعة واسعة من الشروط من مرض الاعصاب (على سبيل المثال، والتخليص بيتا اميلويد في مرض الزهايمر) لتطور الدماغ صحية (على سبيل المثال، متشابك وظيفة البلعمة التقليم) 1-6. بروتوكول التالية هي فحص الإحاطة وضعت لتصور وقياس بوساطة الخلايا الدبقية الصغيرة الإحاطة المدخلات قبل المشبكي في الماوس تطوير نظام retinogeniculate 7. في حين تم استخدام هذا الاختبار لتقييم وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة في هذا السياق على وجه الخصوص، يمكن استخدام نهج مماثل لتقييم البالعات الأخرى في جميع أنحاء الدماغ (مثل الخلايا النجمية) وباقي الجسم(على سبيل المثال، الضامة الطرفية)، وكذلك السياقات الأخرى التي يحدث فيها إعادة عرض متشابك (على سبيل المثال، إصابات الدماغ / مرض).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدوائر متشابك يعيد طوال حياة الحيوان. في الدماغ النامية، تشكل نقاط الاشتباك العصبي في الزائدة ويجب أن تخضع التقليم متشابك الذي ينطوي على إزالة انتقائية من مجموعة فرعية من نقاط الاشتباك العصبي وصيانة وتعزيز نقاط الاشتباك العصبي من تلك التي لا تزال 8-10. هذه العملية ضرورية لتحقيق سمة الربط الدقيق للنظام العصبي الكبار. في البالغين، ويمكن أيضا أن تكون نقاط الاشتباك العصبي البلاستيكية، ولا سيما في سياق التعلم والذاكرة. يعتقد أن يرتبط هذا اللدونة الهيكلية لتشمل إضافة و / أو القضاء على العمود الفقري شجيري وحبات قبل المشبكي 11-13. بالإضافة إلى هذه الأدوار في سلامة الجهاز العصبي، وتشارك أيضا في إعادة عرض متشابك العصبي مرض 12،14،15 نظام / إصابة. على سبيل المثال، بعد إصابة الحبل الشوكي، يجب إعادة تشكيلها في وقت لاحق قطعت محاور وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي وظيفية جديدة لتحقيق الانتعاش 16-19.

الإقليم الشمالي "> الناشئة كجانب هام من اللدونة متشابك هو عملية البلعمة أو الابتلاع من نقاط الاشتباك العصبي متجهة لإزالة 3،5،20. أظهرنا مؤخرا هذه الظاهرة في سياق التقليم متشابك في صحية، وبعد الولادة مخ الفأر 7. على وجه التحديد ، الخلايا الدبقية الصغيرة، وخلايا الجهاز العصبي المركزي وجهاز المناعة البالعات المقيمين عرضت، لتبتلع المدخلات قبل المشبكي خلال فترة الذروة وفي منطقة التقليم متشابك التنموية، والظهرية الجانبية بعد الولادة الركبي النواة (dLGN) من المهاد. الحصار الوراثية أو الدوائية من هذا الغمر أسفرت عن العجز المستمر في اتصال متشابك.

في هذا البروتوكول، ونحن تصف مقايسة موثوقة والكمي للغاية لقياس بوساطة بلعمية الإحاطة المدخلات قبل المشبكي. لأغراض هذه المادة، وسيقدم هذا الاختبار في سياق منظومة تطوير retinogeniculate، والذي يتضمن خلايا الشبكية العقدة (RGCs) المقيمين في شبكية العين التيمشروع المدخلات قبل المشبكي إلى dLGN (الشكل 1A). لتبدأ، وسوف يمكن وصفها استراتيجية وضع العلامات تقدمي مقاومة للتدهور الليزوزومية، والذي يستخدم لتصور المدخلات قبل المشبكي RGC محددة في dLGN (الشكل 1) 7،21. بعد هذا الوصف، منهجية مفصلة للتصوير وقياس كميا الغمر باستخدام المجهر متحد البؤر جنبا إلى جنب مع 3 الأبعاد (3D) حجم سطح التقديم سوف تعطى. ويستند هذا المنهج على إعداد الأنسجة ثابتة ولكن يمكن أيضا أن تتكيف لاستخدامها في دراسات التصوير الحي. الأهم من ذلك، في حين تم التحقق من صحة الفحص في سياق صحي، ونظام retinogeniculate ما بعد الولادة، يمكن للمرء أن يطبق نفس الأساليب الأخرى لتقييم التفاعلات بلعمية الخلايا العصبية في جميع أنحاء الدماغ وأثناء المرض، فضلا عن وظيفة بلعمية في أجهزة الجسم الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تقدمي وصفها من قبل المشبكي RGC المدخلات

ملاحظة: تم استعراض جميع التجارب التي تنطوي على استخدام الحيوانات وتشرف عليها لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية (IACUC) وفقا لجميع المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة.

  1. تعقيم الميدان والصكوك.
  2. تخدير الفأر مع 4٪ isoflurane والمجلد في غرفة تحريض زجاجي (هذا المجلد٪ isoflurane ويعمل لالفئران حديثي الولادة والكبار). مراقبة الفئران عن كثب لتجنب الإفراط في التخدير. تنبيه: تجنب استنشاق الغاز مع إجلاء النفايات فراغ.
  3. بعد 1-3 دقائق، (سوف الفئران الأكبر سنا تتطلب وقتا أقل) ضمان تحقيق المستوى المناسب من التخدير بواسطة معسر الذيل (ينبغي مراعاة أي رد فعل) ومراقبة معدل التنفس (يجب أن يكون معدل بطيئة وثابتة).
  4. وضع الماوس تحت المجهر ستيريو على جانب ومكان مخروط الأنف لتسليم 3-4 المجلد٪ isoflurane وعلى خطم (حديثي الولادة <يوم ما بعد الولادة 10 (P10) ~ 4 مج٪؛> P10 ~ 3 المجلد٪).
  5. فضح الصلبة. للحقن من حديثي الولادة قبل فتح العين، واستخدام زوج من مقص الربيع صغيرة لفتح الجفن وسحب الجلد لفضح الصلبة. لالفئران الأكبر سنا، واستخدام الأصابع لسحب الجلد المحيطة بالعين لفضح الصلبة. تنبيه: في حديثي الولادة، وأحيانا أخرى قطع عمودي على زاوية العين أمر ضروري. اتخاذ الحيطة والحذر عند قطع زاوية الجفن كما أن هناك وعاء دموي أنه إذا قطع، وسوف تنزف بشكل مفرط.
  6. استخدام معقم 30.5 G إبرة لثقب ثقب صغير في جانب العين في السطر حيث يبدأ الصلبة. الحرص على تجنب إتلاف العدسة عن طريق إدخال إبرة فقط بعيدا بما فيه الكفاية أن شطبة يذهب الى العين.
  7. السماح للزجاجي في التدفق من حفرة واستخدام ذات الرؤوس القطن المعقم قضيب لامتصاص السائل.
  8. مرة واحدة توقف زجاجي المتدفقة من الحفرة، اضافة الى وجود إبرة حادة العضوية تعلق على حقنة هاميلتون مسبقة مع تقدمي تتبع صبغفي حفرة. تنبيه: أدخل الإبرة ببطء لتجنب ثقب الجانب الآخر من العين أو إتلاف العدسة.
  9. حقن ببطء صبغ في العين. عادة، يتم استخدام بكتيريا الكوليرا الوحيدات β مترافق لاليكسا 594، 647، 488 أو (CTB-594، CTB-647، أو CTB-488، 5-6 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى anterogradely المدخلات RGC التتبع. لحديثي الولادة (≤ P10) 1-2 ميكرولتر كافية وبالنسبة للفئران> P10 ~ 3 ميكرولتر كافية. ملاحظة: الأصباغ اليكسا هي خاصة مقاومة للتدهور الليزوزومية
  10. ترك الإبرة في ثقب لبضع ثوان ثم إزالة ببطء.
  11. استخدام القطن يميل قضيب لامتصاص السوائل الزائدة ومنع الصبغة من تسرب.
  12. تنطبق على كمية صغيرة من مرهم مضاد حيوي للعين. إذا تم فتح العين جراحيا، إعادة برفق الجفون معا.
  13. إذا حقن كلتا العينين، كرر الإجراء على العين الأخرى.
  14. بعد الحقن (ق)، وترك الماوس تحت مصباح الحرارة أو على وسادة الحرارة حتى يبدأ في التعافي من anesthESIA.
  15. العودة الماوس إلى قفص المنزل نظيفة ومراقبة للتأكد من أنها هي مستيقظا تماما قبل أن تعود إلى المستعمرة.

2. تحضير الأنسجة للتصوير

ويستخدم هذا البروتوكول إعداد الأنسجة لمراسل الفئران التي وصفت في البالعات مع علامات الفلورسنت (على سبيل المثال، CX3CR1-EGFP عن الخلايا الدبقية الصغيرة). إذا كان خط مراسل ليست متاحة، ويمكن للمحقق immunostain أقسام الأنسجة (انظر مناقشة).

  1. ~ 24 ساعة بعد الحقن، والتضحية الماوس وتشريح الدماغ.
  2. إسقاط إصلاح الدماغ في أنبوب فالكون مليئة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تنبيه: PFA سامة. تجنب استنشاق وتعرض الجلد باستخدام في غطاء الدخان أو على طاولة اسفل وارتداء معدات الوقاية الشخصية. ملاحظات: يمكن أن تكون أقصر التثبيت (≥ 4 ساعة). بالإضافة إلى ذلك، بدلا من تثبيت قطرة، 4٪ PFA نضح يمكن استخدامها تليها الإصلاح 2-24 قطرة ساعة. ومع ذلك، مقارنة يرويد لإسقاط العقول حديثي الولادة والكبار ثابتة كشف أي اختلاف في جودة الصورة أو الكمي.
  3. شطف 3X الدماغ في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
    1. صب الدماغ وPFA إلى وزن القارب فارغة.
    2. استخدام ملعقة لنقل المخ إلى أخرى تزن قارب مليئة برنامج تلفزيوني.
    3. غسل الدماغ مرتين أكثر في برنامج تلفزيوني (نقل الدماغ لاثنين من أكثر تزن زوارق مليئة PBS).
  4. نقل الدماغ إلى أنبوب فالكون مليئة حل السكروز 30٪. ترك الدماغ في السكروز في 4 درجات مئوية حتى يغرق الدماغ إلى أسفل الأنبوب (24-48 ساعة).
  5. مرة واحدة المصارف الدماغ، وإعداد الدماغ لباجتزاء. الخطوات التالية هي إعداد 40 ميكرومتر أقسام العائمة باستخدام مشراح انزلاق مع مرحلة تجميد (ناظم البرد يمكن أن تستخدم أيضا).
    1. استخدام شفرة حلاقة لإزالة أجزاء من الدماغ غير مطلوبة (للdLGN، وإزالة أجزاء منقاري والذيلية من الدماغ).
    2. تجميد الصدريةفي رقائق الألومنيوم على أكثر من الثلج الجاف. خلال هذا الوقت، وتجميد المرحلة مشراح وملء كل بئر من 24 لوحة جيدا مع 0.5 مل من 0.1 M العازلة الفوسفات (PB).
  6. جبل الدماغ المجمدة (يجب أن تظهر مبهمة) على المسرح التجمد.
    1. تنطبق على كمية صغيرة من درجة الحرارة المثلى القطع مجمع (أكتوبر) إلى خشبة المسرح.
    2. عندما يبدأ تشغيل OCT لتجميد، يكمن في الدماغ في أكتوبر نهاية الدماغ التي من شأنها أن تقطع ينبغي مواجهة (على سبيل المثال، لdLGN، تواجه الجانب الذيلية متابعة).
    3. تغطي الدماغ وأكتوبر مع جدا سحقت ناعما الثلج الجاف.
    4. ترك الثلج الجاف على الدماغ / أكتوبر ل~ 30 ثانية.
    5. استخدام فرشاة طلاء كبيرة لإزالة الثلج الجاف. ينبغي تجميد الدماغ وأكتوبر إلى المرحلة.
  7. تبدأ من خلال باجتزاء الأنسجة حتى يتم الوصول إلى المنطقة ذات الاهتمام (ROI).
  8. مرة واحدة يتم الوصول إلى العائد على الاستثمار، واستخدام فرشاة صغيرة لإزالة الطلاء مقاطع من النصل ونقلها إلى بلات 24 جيدالبريد تحتوي على 0.1 M PB (الخطوة 2.5.2). الحفاظ على فرشاة الطلاء الرطب عن طريق تبليل ذلك في 0.1 م PB قبل ازالة اجزاء من النصل. ملاحظة: أقسام يمكن أن تترك في 0.1 م PB بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  9. مرة واحدة وقد تم جمع أقسام، تصور وضع العلامات تقدمي تحت المجهر الفلورسنت تشريح واختيار المقاطع التي تحتوي على العائد على الاستثمار.
  10. جبل أقسام على شريحة بفرشاة الطلاء الصغيرة.
    1. تطبيق مجموعة صغيرة من 0.1 M PB إلى شريحة المجهر مشحونة.
    2. نقل قسم الأنسجة إلى تجمع من PB.
    3. استخدام PB وفرشاة الطلاء لتوجيه ونشر الأنسجة.
    4. استخدام Kimwipe إلى ذبالة قبالة PB الزائدة. الحرص على تجنب فتل قبالة الباب.
    5. السماح لهواء جاف تماما.
    6. تطبيق قطرة صغيرة من تصاعد المتوسطة إلى كل قسم وجبل ساترة على رأس (22 × 50 مم، رقم 1.5).
    7. ختم حواف الشريحة مع طلاء الأظافر وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى جلسة التصوير. ملاحظة: على الرغم من أن التصوير معفي الأسبوع من إعداد وينصح، والشرائح يمكن الحفاظ في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع قبل التصوير.

3. التصوير الأنسجة

يتم الحصول على جميع الصور على قرص الغزل المجهر متحد البؤر (UltraView فوكس الغزل القرص المجهر متحد البؤر مجهزة ليزر الصمام الثنائي (405 نانومتر، 445 نانومتر، 488 نانومتر، 514 نانومتر، 561 نانومتر، و 640 نانومتر)). ويمكن أيضا أن الصور يتم الحصول على أي المجهر مع القدرة على اكتساب عالية الدقة ض المداخن (على سبيل المثال، المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر، المجهر المجهر epifluorescent تليها deconvolution، الخ). حجم الإطار هو عادة 1،000 خ 1،000 بكسل.

  1. البحث عن العائد على الاستثمار في 10X التكبير والحصول على صورة. لتصوير الخلايا الدبقية الصغيرة في النظام retinogeniculate، والعائد على الاستثمار هو الأكثر أقسام dLGN وسطي.
  2. التحول إلى أعلى التكبير (60X هدف خطة آبو، NA = 1.4، ويستخدم عادة).
  3. الحصول على الحقل الأول نظر تحتوي على البالعات باستخدام 0.2 ميكرون ض خطوةق.
  4. الحصول على 15-19 الحقول التي تحتوي على أكثر البالعات لكل حيوان.

4. إعداد الصور للالكمي (يماغيج)

  1. مفتوحة ض المكدس في ImageJ.
  2. انتقل إلى القائمة صورة، حدد اللون والقنوات سبليت.
  3. طرح الخلفية من قناة (ق) التي تحتوي على مواد اجتاحت.
    1. حدد الإطار القناة التي تحتوي على مواد اجتاحت (على سبيل المثال، قبل المشبكي المدخلات).
    2. انتقل إلى القائمة وحدد خلفية عملية طرح. استخدام المتداول الكرة دائرة نصف قطرها 10 بكسل لتتبع تقدمي المدخلات قبل المشبكي في dLGN. ملاحظة: يتم تحديد نصف قطر الكرة المتداول تجريبيا. ومع ذلك، ينبغي أن يكون بصفة عامة كبيرة مثل نصف قطر أكبر كائن في الصورة التي ليست جزءا من الخلفية.
  4. سلس القناة التي تحتوي على بلعمية.
    1. حدد الإطار الذي يحتوي على قناة بلعمية (على سبيل المثال، الخلايا الدبقية الصغيرة).
    2. انتقل إلى القائمة عملية وقانون حالة الطوارئإلخ فلاتر، يعني. استخدام مرشح متوسط ​​1.5 (هذا ينعم على الصورة لجعل السطح في خطوات لاحقة).
  5. طرح الخلفية من القناة التي تحتوي على بلعمية.
    1. حدد الإطار الذي يحتوي على قناة بلعمية (على سبيل المثال، الخلايا الدبقية الصغيرة).
    2. انتقل إلى القائمة عملية، حدد خلفية طرح (إعدادات سوف تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا). استخدام المتداول من نصف قطر الكرة 50 بكسل لالخلايا الدبقية الصغيرة-EGFP إيجابية.
  6. دمج القنوات عن طريق الذهاب إلى قائمة صورة واختيار اللون، قنوات دمج.
  7. ROI المحاصيل التي تحتوي على بلعمية من ملف دمج (وهذا يجعل السطح تقديم أسرع، راجع الخطوة 5).
    1. رسم مربع حول العائد على الاستثمار باستخدام أداة مستطيلة التحديدات في شريط الأدوات.
    2. اذهب إلى قائمة صورة وحدد المحاصيل.
  8. تقسيم القنوات مرة أخرى (راجع الخطوة 4.2).
  9. حفظ كل قناة كملف TIFF تلقاء نفسها.

5. إعداد صورة للالكميفي Imaris

  1. مفتوحة Imaris وتأكد من أن يتم تحديد رمز حجم الصوت في القائمة اليسرى العليا (الشكل 2).
  2. فتح القناة الأولى من الصورة التي تم اقتصاصها (أي من القنوات يمكن فتح الأولى، فقط أن تكون متسقة).
  3. إضافة قناة أخرى (ق). انتقل إلى القائمة تحرير، حدد إضافة قنوات وحدد القناة التالية في الملف. (كرر هذه الخطوة أي قنوات المتبقية). ملاحظة: لتغيير لون، انتقل إلى عرض نافذة التعديل وانقر على اسم القناة (الشكل 3A). وهذا إحضار مربع الحوار لضبط اللون. إذا كانت نافذة العرض التعديل غير مرئية، انتقل إلى القائمة تحرير واختر عرض التعديل.
  4. ضبط القيم بكسل. انتقل إلى القائمة تحرير واختر خصائص الصورة. في هذا الإطار، وضبط خ، ذ، ض والقيم بكسل (هذه القيم تعتمد على المجهر، والهدف، وكاميرا، واكتساب ض خطوة ويمكن العثور عليها في البرمجيات المستخدمة لاكتساب صورة).
  5. سوف الخطوة 5.5 يؤدي إلى غايةالصورة الصغيرة. لتغيير حجم، انقر على أيقونة صالح في أسفل الزاوية اليمنى (الشكل 2).
  6. في نافذة العرض التكيف، وضبط السطوع والتباين لكل قناة باستخدام مثلثات اليسار والوسط.

6. 3 الأبعاد (3D) جعل سطح بلعمية

  1. في شريط الأدوات العلوي، تأكد من تحديد وضع فق (الشكل 3C).
  2. في نافذة العرض التعديل، قم بإلغاء جميع القنوات باستثناء قناة بلعمية. وهذا إخراجها من مجال الرؤية.
  3. انقر فوق رمز التقديم السطح (الشكل 2).
  4. سيتم عرض إطار خلق في أسفل اليسار (الشكل 4A)، تأكد من القطاع ROI لم يتم التحقق منه في هذا الإطار الأول. انقر على الزر الأزرق قدما في الأسفل.
  5. ضبط تجانس.
    1. في الإطار التالي، واختيار القناة بلعمية من القائمة المنسدلة (الشكل 4B). هذا يضبطكمية التفاصيل التي سيتم ظهرت وينبغي أن تحدد تجريبيا (وعادة ما تستخدم 0.1 ميكرون لتجانس الخلايا الدبقية الصغيرة).
    2. حدد مستوى العتبة المطلقة.
    3. انقر على الزر الأزرق قدما في الأسفل.
  6. عتبة الصورة.
    1. انقر على الرسم البياني واسحب حتى يتم ظهرت الصورة بشكل مناسب (الشكل 4C). يتم تحديد هذا تجريبيا عن طريق تناوب الصورة لضمان السطوح الرمادية مضافين على الصورة الفلورسنت هي تمثيل سطح دقيقة. ملاحظات: لتدوير، حدد تنقل في القائمة مؤشر على الجانب الأيمن العلوي من الشاشة (الشكل 3B)، انقر فوق وعقد لتدوير الصورة. للعودة إلى التوجه الصورة الأصلية، اختر المنشأ أسفل اليسار من القائمة عرض.
    2. انقر على الزر الأزرق قدما في الأسفل.
  7. في الإطار التالي، هناك خيار لتصفية أي السطوح حسب الحجم، الخ إلا صورة صاخبة جدا، لا تصفية وحذفمرشحات ذ التي تظهر تلقائيا. انقر على السهم الأخضر في أسفل لإنهاء السطح مما يجعل بلعمية. وهناك مجموعة جديدة من علامات التبويب تظهر (الشكل 5)
  8. إذا لزم الأمر، حذف أي الأسطح التي ليست جزءا من بلعمية من الفائدة.
    1. تأكد من أن يتم تحديد الخيار في اختيار القائمة مؤشر (الشكل 3B).
    2. انقر على أي سطح المراد حذفه بحيث يتحول إلى اللون الأصفر. لحذف أسطح متعددة، انقر على السطوح أثناء الضغط باستمرار على زر التحكم.
    3. انقر فوق حذف ضمن علامة التبويب قلم رصاص.
  9. اختيار ودمج جميع الأسطح من بلعمية في سطح واحد.
    1. انقر على القمع (أي علامة التبويب تصفية؛ الشكل 5C).
    2. انقر فوق إضافة.
    3. اختيار أي مرشح، اسحب الرسم البياني لأقصى اليسار (يجب أن تكون جميع الأسطح الصفراء).
    4. العودة إلى علامة التبويب قلم رصاص وانقر توحيد.
  10. انتقل إلى علامة التبويب الرسم البياني (الشكل 5A ) وانقر على التفاصيل وتحديد أية معلمات لعرضه. حدد حجم (الشكل 5D). لعرض معلمات متعددة، انتقل إلى رمز مفتاح في الجزء السفلي الأيسر (الشكل 2) وحدد المعلمات لتسجيل.
  11. تسجيل حجم بلعمية وحفظ الملف قبل المتابعة.

7. 3D التقديم سطح اجتاحت المواد

  1. إنشاء قناة جديدة للمواد التي تم اجتاحت من قبل بلعمية.
    1. بينما يتم تحديد السطح بلعمية، انقر فوق علامة التبويب قلم رصاص.
    2. انقر قناع جميع.
    3. في الحوار الذي يظهر، حدد القناة المقابلة لمادة اجتاحت (على سبيل المثال، تتبع تقدمي المدخلات قبل المشبكي؛ الشكل 5B).
    4. تحقق قناة مكررة قبل تطبيق قناع واضغط زر موافق.
    5. سوف تظهر قناة جديدة في نافذة العرض التعديل الذي يحتوي فقط على المواد التي تم اجتاحت وداخلبلعمية.
  2. سطح تجعل القناة التي تحتوي على مجموع المادة واجتاحت nonengulfed.
    1. قم بإلغاء جميع القنوات في نافذة العرض التعديل باستثناء القناة إلى أن ظهرت وإلغاء السطح إنشاؤها لبلعمية.
    2. انقر على أيقونة سطح تقديم مرة أخرى (راجع الخطوة 6.3) وإنشاء سطح للقناة باستخدام نفس الخطوات كما هو موضح في بلعمية (الخطوات 6،4 حتي 6،11). ملاحظات: تأكد من تحديد القناة الصحيحة قبل تجانس ومستوى العتبة (الخطوة 6.5؛ الشكل 4B). جعل علما قيمة العتبة (انظر الخطوة 6.6؛ الشكل 4C). كما يمكن الحصول على هذه القيمة بعد تقديم السطح كاملة (علامة التبويب العصا؛ الشكل 5A).
  3. تسجيل الصوت من مجموع المواد اجتاحت وغير اجتاحت وحفظ الملف قبل المتابعة.
  4. سطح تقديم المواد اجتاحت (المواد داخل بلعمية).
    1. تصور مضان فقطقناة جديدة من المواد اجتاحت (راجع الخطوة 7.2.1).
    2. اتبع نفس الخطوات المذكورة أعلاه (الخطوات 7،2-7،3). ملاحظات: تأكد من تحديد القناة الصحيحة من القائمة المنسدلة قبل تجانس (اختيار القناة الجديدة التي تم إنشاؤها في الخطوة 7.1). في إطار عتبة، يدويا إدخال قيمة العتبة التي تم تعيينها لتقديم مجموع المواد اجتاحت وغير اجتاحت (راجع الخطوة 7.2.2).
  5. تسجيل حجم المواد اجتاحت وحفظ الملف قبل المتابعة.

8. احسب الحجم الكلي للمجال الرؤية

  1. إنشاء سطح جديد لأية قناة.
  2. في إطار مستوى العتبة (الخطوة 6.6)، حرك الرسم البياني على طول الطريق إلى اليسار بحيث يتم ظهرت الحقل بأكمله.
  3. الانتهاء من السطح الحقل بأكمله وتسجيل حجم (الخطوات 6،7 حتي 6،11).
  4. حفظ الملف.

9. حساب كمية المواد المبتلعة

  1. حساب كثافةمجموع اجتاحت وغير اجتاحت القنوات المواد باستخدام الخوارزمية التالية:
    حجم إجمالي اجتاحت وغير اجتاحت المواد (الخطوة 7.3) / حجم الحقل (الخطوة 8).
  2. حساب الإحاطة٪ لكل خلية باستخدام الخوارزمية التالية:
    (حجم اجتاحت المواد (الخطوة 7.5) / الحجم الإجمالي للبلعمية (الخطوة 6.11)) × 100
    ملاحظات: لمراعاة الاختلافات في حجم الخلية، ويتم تطبيع البيانات إلى إجمالي حجم بلعمية. إذا الأرقام من الخطوة 9.1 تختلف اختلافا كبيرا عبر الحقول، قد يكون من الضروري لتطبيع البيانات من الخطوة 9.2 إلى 9.1 في الحساب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الآونة الأخيرة، استخدمنا هذه الإحاطة مقايسة لتصور وقياس بوساطة الخلايا الدبقية الصغيرة بابتلاعها قبل المشبكي المدخلات في النظام retinogeniculate النامية (الشكل 1) 7. RGCs من CX3CR1-EGFP الفئران متخالف تم ارجاعه anterogradely مع CTB-594-647 وCTB في عيون اليسار واليمين، على التوالي. تتبع هذا التتبع، تم تصوير الخلايا الدبقية الصغيرة EGFP إيجابية داخل dLGN. هذه الصور تم في وقت لاحق السطحية المقدمة للقياسات الحجم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل قياس بدقة البلعمة، ويجب أن يكون المسمى المواد غارقة في مثل هذه الطريقة التي يمكن للباحث تصور مرة واحدة حدث تدهور الليزوزومية. بالإضافة إلى ذلك، مطلوب عالية الدقة والتصوير، تليها استخدام البرمجيات التي تمكن الباحث لتصور حجم الخلية بأكملها وتحديد محتوياته. في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة موثوق بها للغاية وكمي لقياس بوساطة بلعمية الغمر باستخدام CTB مترافق إلى الأصباغ اليكسا لتسمية المواد اجتاحت جنبا إلى جنب مع ارتفاع القرار متحد البؤر المجهري وإعادة الإعمار 3D. وقد استخدمت ه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد العمل من المنح المقدمة من مؤسسة سميث الأسرة (BS)، ومؤسسة دانا (BS)، جون برنامج علماء ميرك (BS)، NINDS (RO1-NS-07100801؛ BS)، NRSA (F32-NS-066698؛ DPS)، نانسي لوري ماركس مؤسسة (DPS)، المعاهد الوطنية للصحة (P30-HD-18655؛ MRDDRC التصوير الأساسية).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وسادة حراريةVet Equip، Inc.965500 
مصدر الماء الدافئ للوسادة الحراريةكينت ScientificTP-700
مجهر ستيريوDSC بصريZeiss Opmi -6 مجهر
انزلاق ميكروتوم مع مرحلة التجميدLeicaSM2010 R
شفرة MicrotomeLeica14021607100
مجهر تشريح الفلورسنتنيكونSMZ800 مع مرفق
مجهر قرص متحد البؤرPerkin ElmerUltraView Vox قرص دوارة متحد البؤر
10 & ل محاقن هاملتون الغاز الضيقةهاميلتون80030استخدام حقنة مختلفة لكل صبغة ملونة / تتبع
إبر هاميلتونهاميلتون7803-05 ، المواصفات: حادة ، 1.5 "
توكسين الكوليرا المترافق مع Alexa & بيتا ؛ وحدة فرعية (CTB)Invitrogen488: C22841إعادة التكوين في محلول ملحي معقم ، 80 ومايكرو ؛ ل (488) ، 100 وميكرو ؛ ل (594) ، 20 & مايكرو ؛ ل (647)
594: C22842
647: C34778
محلول ملحي مخزن بالفوسفات ( PBS)SigmaP4417-50TAB
كبريتات نيومايسين وبوليميكسين ب وكبريتات الزنك الزنك مرهم العين USP (مرهم مضاد حيوي)Bausch & amp Lomb24208-780-55
30.5 G إبرةBecton Dickinson305106
مقص زنبركيRobozRS-5630
قضيب قطني ذو رؤوسفيشر23-400-125
Paraformaldeyde (PFA)علوم المجهر الإلكتروني15710تمييع 16٪ إلى 4٪ في PBS. Paraformaldehye سام ، يستخدم في غطاء الدخان وارتداء معدات الحماية الشخصية.
أدوات التشريح – مقص ، ملقط ، ملعقةمقص صغير: أدوات العلوم الدقيقةمقص صغير: 14370-22
مقص كبير: Robozمقص كبير: RS-6820
# 55 ملقط: أدوات العلوم الدقيقة# 55 ملقط: 11255-20
ملعقة: Ted Pella، Inc.ملعقة: 13504
السكروزسيجماS8501-5KGاصنع 30٪ سكروز في PBS (الوزن / المجلد)
OCT CompoundVWR25608-930
وزن قاربالولايات المتحدة الأمريكية Scientific2347-1426
ألواح 24 بئراBD Biosciences353047
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةSigmaS6566-500Gاصنع 0.2 مليون فوسفات صوديوم أحادي القاعدة (PB-A) في ddH2< / sub>O و 0.2 M ثنائي القاعدة من فوسفات الصوديوم (PB-B) في ddH2< / sub>O. لعمل 0.1 M PB ، امزج 19 مل PB-A و 81 مل PB-B ، واملأ إلى 200 مل مع ddH2< / sub>O
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة   ؛أغطية SigmaS5136-500G
، 22 × 50 مم ، رقم 1.5VWR48393 194
شريحة مجهر مشحونةVWR48311-703
مختبرات ناقلاتVectasheildH-1200
جراحيEpi-filanescence

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  2. Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
  3. Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
  4. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  5. Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
  6. Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).
  7. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  8. Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).
  9. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
  10. Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).
  11. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
  12. Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).
  13. Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).
  14. Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).
  15. Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
  16. Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).
  17. Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
  18. Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).
  19. Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
  20. Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61 (1), 24-36 (2013).
  21. Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).
  22. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
  23. Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease. Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).
  24. Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
  25. Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).
  26. Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease. Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).
  27. Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. , (2012).
  28. Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).
  29. Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة