-سهلت صوتنة المناعي تلطيخ المرحلة الجنينية في وقت متأخر من اليرقات و<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة<em&gt; في الموقع</em

ملخص

Immunostaining هي تقنية فعالة لتصور أنواع معينة من الخلايا والبروتينات داخل الأنسجة. من خلال استخدام الصوتنة ، يخفف البروتوكول الموصوف هنا من الحاجة إلى تشريح أنسجة ذبابة الفاكهة السوداء من الأجنة واليرقات في المرحلة المتأخرة قبل تلطيخ المناعة. نحن نقدم منهجية فعالة للتلوين المناعي لليرقات الكاملة المثبتة بالفورمالديهايد.

الملخص

الدراسات التي أجريت في الدروسوفيلاميلانوجاستر الأجنة واليرقات توفر البصيرة الحاسمة في العمليات التنموية مثل مواصفات مصير الخلايا وتوالد الأعضاء. المناعية يسمح التصور تطوير الأنسجة والأعضاء. ومع ذلك، بشرة الواقية التي تشكل في نهاية مرحلة التطور الجنيني يمنع تخلل الأجسام المضادة في أواخر مرحلة الأجنة واليرقات. بينما تشريح قبل المناعية يستخدم بانتظام لتحليل أنسجة اليرقات ذبابة الفاكهة، فإنه يثبت عدم كفاءة بعض التحليلات لأن الأنسجة الصغيرة قد يكون من الصعب تحديد وعزل. يوفر صوتنة بديلا للتشريح اليرقات في بروتوكولات المناعية ذبابة الفاكهة. أنه يسمح للسريع، وتجهيز وقت واحد من عدد كبير من الأجنة في مرحلة متأخرة واليرقات ويحافظ على التشكل في الموقعي. بعد التثبيت في الفورمالديهايد، وsonicated عينة. ثم يتم إخضاع العينة لالمناعية مع مستضد معين نملة الأساسيibodies والأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى لتصور أنواع الخلايا المستهدفة وبروتينات معينة عبر مضان المجهري. خلال عملية صوتنة، تحديد المكان المناسب لتحقيق sonicating فوق العينة، فضلا عن مدة وشدة صوتنة، أمر بالغ الأهمية. قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات طفيفة الاضافيه المناعية بروتوكولات قياسية للبقع عالية الجودة. عن الأجسام المضادة مع إشارة إلى انخفاض نسبة الضوضاء، مرات حضانة أطول ضرورية عادة. كدليل على مفهوم لهذا البروتوكول، سهلت صوتنة، وتبين لنا immunostains من ثلاثة أنواع الأنسجة (الخصيتين والمبيض، والأنسجة العصبية) في مجموعة من المراحل التنموية.

المقدمة

ذبابة الفاكهة الأجنة واليرقات توفر نموذجا ممتازا لدراسة العمليات التنموية في كثير من الأعضاء والأنسجة. التصوير من الخلايا الفردية غالبا ما يكون ضروريا في هذه الدراسات من أجل التأكد من البيئات المعقدة التي تتطور الخلايا. التصور من الخلايا في الأنسجة ويمكن تحقيق ذلك من خلال المناعية. موصوفة وصفا جيدا المناعية وجود بروتوكولات لذبابة الفاكهة الأنسجة الجنينية <17 ساعة بعد وضع البيض (أيل ليماسول) ^1-3. ومع ذلك، فإن أشكال بشرة وقائية في نهاية مرحلة التطور الجنيني، ومنع تخلل فعالية الأجسام المضادة. وبالتالي، هذه البروتوكولات المناعية غير فعالة في تحليل أنسجة الأجنة في المراحل المتأخرة وفي مراحل لاحقة من نمو ....

البروتوكول

1. إعداد قفص مجموعة

1. تخدير الشباب، والذباب خصبة مع CO _2. نقل الذباب تخدير إلى القفص. للحصول على العائد الأمثل، استخدم 100-120 الذباب الكبار تتراوح بين 2-7 أيام من العمر في 4: 1 نسبة الإناث إلى الذكور. السماح الذباب فترة التأقلم المناسبة، ~ 24 ساعة قبل الحصول على عينة لتثبيت. إذا تم تعيين قفص مع الإناث البكر لتزاوج الذكور، استخدام 36 - فترة التأقلم 48 ساعة.
2. في نهاية مفتوحة من القفص، وضع معدة سلفا عصير التفاح لوحة أجار مع انخفاض سنتات الحجم من معجون الخميرة في وسط خلال افتتاح القفص....

النتائج

للتدليل على فعالية المناعية القائم على صوتنة في تحليل المراحل المتأخرة الجنينية والأنسجة اليرقات في الموقع، تم تجهيز البرية من نوع الأجنة واليرقات لالمناعية من الخصية والمبيض، والأنسجة العصبية. تم تصوير عينات عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر وتظهر نتائج ممثلة (الشكل 1 والشكل 2). وتكشف النتائج أن البروتوكول وصف فعالة لتصور معالم شكلية وكذلك الخلايا الفردية في الموقع أثناء المراحل المتأخرة الجنينية خلال وقت مبكر / منتصف L3 التنمية ذبابة الفاكهة.......

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول طريقة لذبابة الفاكهة بنجاح immunostain استهداف الجنينية والأنسجة اليرقات في الموقع، وبالتالي القضاء على الحاجة للتشريح. وفقا لبروتوكولات مسبقة لتلطيخ الأجنة المبكرة ^1،2،3، تتم إزالة الغشاء المشيمي باستخدام 50٪ التبييض (NaOCl). يتم إصلاحها في عينات الفورمالديهايد والميثانول. لأن بشرة اليرقات تسبب عينة القديمة لتطفو، ثم يتم تمرير عينة كاملة من خلال خلية مصفاة لضمان الاحتفاظ اليرقات. يتم تخزين العينة، إذا رغبت، في الصف الكيميائية الميث.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الجدول 1: الكواشف والمخازن
المؤقتة للفوسفات Triton X-100 (PBTx)			ل 5 لتر: 500 مل PBS 10X ، 4.45 لتر ddH 2< / sub >O ، 50 مل تريتون 10٪. تخزين في RT.
ملحي عازل للفوسفات 10X (PBS 10X)			ل 1 لتر في dH 2 < / sub >O: 80 جم كلوريد الصوديوم ، 2 جم كلوريد كلوريد ، 14.4 جم Na 2< / sub>HPO4< / sub> ، 2.4 g KH2< / sub>PO4< / sub>. أضف المكونات واملأها إلى الحجم المناسب. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
تريتون 10٪			ل 50 مل: 5 مل من تريتون ، 5 مل من PBS 10X ، 45 مل من ddH2< / sub>O. صخرة للخلط. تخزين في RT.
PEMS			0.1 M (درجة الحموضة 6.9) ، 2.0 ملي مولار MgSO4< / sub> ، 1.0 ملي مولار EGTA. تخزين في RT.
الأنابيب			للحصول على 400 مل من محلول 0.25 متر (الرقم الهيدروجيني 6.9): 30.24 جم الأنابيب dH2< / sub>0 هيدروكسيد الصوديوم. قم بإذابة الأنابيب في 300 مل dH2< / sub>O ثم اضبطها على درجة الحموضة 6.9 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. ارفع الحجم الإجمالي إلى 400 مل باستخدام dH2O والأوتوكلاف. تخزين في RT.
الفورمالديهايد			37٪ الفورمالديهايد بالوزن في الميثانول. يخزن في RT. قم بتخزين خليط نفايات الفورمالديهايد والهيبتان والميثانول في وعاء محكم الغلق في غطاء الدخان قبل التخلص منه وفقا للإرشادات المؤسسية.
هيبتان		CAS 142-82-5	ن-هيبتان. يخزن في RT. قم بتخزين خليط نفايات الفورمالديهايد والهيبتان والميثانول في وعاء محكم الغلق في غطاء الدخان قبل التخلص منه وفقا للإرشادات المؤسسية.
الميثانول		CAS 67-56-1	في RT. قم بتخزين خليط نفايات الفورمالديهايد والهيبتان والميثانول في وعاء مغلق بإحكام في غطاء الدخان قبل التخلص منه وفقا للإرشادات المؤسسية.
عازلة الفوسفات توين (PBTw)			لعمل 1 لتر: 100 مل PBS 10X ، 890 مل ddH 2< / sub>O ، 10 مل توين 10٪. تصفية التعقيم بعد إضافة جميع المكونات. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
توين 10٪			ل 50 مل: 5 مل توين ، 5 مل من PBS 10X ، 40 مل من ddH2< / sub>O. صخرة للخلط. تخزين في RT.
ألبومين البقر / عازلة الفوسفات توين (BBTw)			لصنع 1 لتر: 100 مل PBS 10X ، 890 مل DDH 2< / sub>O ، 10 مل توين 10٪ ، 1 جم ألبومين مصل البقر (BSA). أضف BSA ثم تعقيم باستخدام 0.2 & mu ؛ م وحدة تصفية فراغ. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
مصل الماعز العادي (NGS)	مختبرات أكسون للأبحاث المناعية	005-000-121	لصنع 10 مل: مصل الماعز العادي 10 مل ddH 2< / sub>O. أضف ddH2< / sub>O إلى قارورة NGS وتعقيمها باستخدام 0.2 & mu ؛ مرشح M Syrninge. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية.
1،4-ديازابيسيكلو [2.2.2] أوكتان (دابكو)		CAS: 281-57-9	لصنع 100 مل: 25 مل ddH 2< / sub>O ، 1 مل تريس حمض الهيدروكلوريك (1 م ، درجة الحموضة 7.5) ، 2.5 جم من DABCO الصلب ، 3.5 مل 6N HCl ، 250 & mu ؛ ل 10N هيدروكسيد الصوديوم ، 70 مل جلسرين. في دورق سعة 250 مل مع شريط التحريك ، أضف ddH2< / sub>O و Tris HCl و DABCO. يقلب ثم يضاف 6N HCl و 10 N هيدروكسيد الصوديوم والجلسرين. ثم أضف 10N هيدروكسيد الصوديوم بالتنقيط حتى يصل المحلول إلى الرقم الهيدروجيني 7.5. Aliquot. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية.
		p-phenylenediamine (PPD)	1.765 مل NaHCO3 ، 0.353 Na2< / sub>CO3< / sub> ، 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). قم بإذابة PPD في محلول NaHCO3 و NaCO3. أضف 60 مو ؛ ل من محلول PPD إلى 500 مو ؛ ل من DABCO. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية.
أطباق			لصنع ~ 200 طبق: 45 جرام أجار (CAS # 9002-18-0) ، 45 جرام سكر حبيبي (تم شراؤه من المتجر) ، 500 مل عصير تفاح (تم شراؤه من المتجر) ، 15 مل Tegosept 10٪ ، 1.5 مل ddH 2< / sub>O. أضف أجار إلى ddH2< / sub>O في قارورة 4 لتر ثم الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة. يضاف خليط عصير التفاح تدريجيا إلى أجار معقمات. اخلطيها على طبق التحريك الساخن ثم اخلطي كميات 10 مل في أطباق بتري مقاس 35 مم واتركيها عند RT لتتجمد. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
Tegosept 10٪			لصنع 100 مل: 10 جم تيجوسيبت ، 100 مل إيثانول. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية.
معجون			~ 50 جم خميرة نشطة جافة. أضف تدريجيا ddH2< / sub>O إلى دورق يحتوي على خميرة مع التقليب حتى يصل إلى قوام يشبه العجينة. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
الجدول 2: مواد تلطيخ
DAPI	Invitrogen	D3571	1: 1000 ، مخزون بسعر 5 مجم / مل.
أرنب مضاد لفاسا			1: 250 ، هدية من روث ليمان.
الفأر المضاد للفاشيكلين III	الدراسات التنموية بنك الورم الهجين (DSHB)	7G10	1:10
الفأر المضاد ل 1B1	الدراسات التنموية بنك الورم الهجين (DSHB)	1B1	1: 4
Guniea pig anti-Traffic			Crowd 1: 2500 ، هدية من Dorthea Godt (Li et al ، 2003).
الفأر المضاد لبروسبيرو	للدراسات التنموية بنك الورم الهجين (DSHB)	بروسبيرو MR1A	1:10
الفئران المضادة	للدراسات التنموية بنك الورم الهجين (DSHB)	7EBA10	1:30
الفأر المضاد للريبو	الدراسات التنموية بنك الورم الهجين (DSHB)	8D12	1:10
الماعز المضاد للأرانب Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
الماعز المضاد للفأر Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
خنزير الماعز المضاد للguniea Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
الماعز المضاد للفئران Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
الجدول 3: المواد والمعدات
أقفاص الذباب	المصنوعة يدويا. شركة جينيسي العلمية	غير قابلة للتطبيق. زجاجات: 32-130 ؛ قفص مسبقة الصنع: 59-101	مصنوع عن طريق قطع أنابيب الأكريليك المصبوبة الشفافة (قطرها 1 3/4 بوصة) إلى شرائح بطول 4 بوصات بمنشار ميتري مركب عند 400 دورة في الدقيقة. غربلة متناهية الصغر من الفولاذ المقاوم للصدأ (تم توصيلها بأحد طرفي الحوض بغراء أكريليك كومبوند. يمكن العثور على طريقة بديلة باستخدام زجاجة طعام ذبابة فارغة في ذبابة الفاكهة بروتوكولات ISBN 0-87969-584-4. يمكن أيضا شراء الأقفاص من شركة Genesee العلمية.
سونيكاتور: برانسون 250 سونيفايير رقمي	برانسون	نموذج: برانسون سونيفاير رقمي 250
مسبار سونيكاتور	برانسون	نموذج #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066 ؛ S / N: OBU06064658
مرشح حقنة	Nalgene	190-25-20	0.2 & m السليلوز ، مرشح غشاء الأسيتات
نظام التصوير: مجهر متحد البؤر للقرص الدوار مع مصدر ضوء متعدد الألوان ، وكاميرا CCD رقمية ، وبرنامج تصوير	مجهر: أوليمبوس ، مصدر الضوء: Lumen Dynamics ، الكاميرا: Q-Imaging ، برنامج التصوير: Intelligent Imaging Inc.		المجهر: BX51 مزود بقرص دوارة DSU ، مصدر الضوء: X-Cite 120Q ، الكاميرا: RETIGA-SRV ، برنامج التصوير: Slidebook 5.0
وحدة تصفية الفراغ	Nalgene	450-0020	0.2 & mu ؛ مرشح غشاء نترات السليلوز M

محلول أنابيب مخزن مصل DABCO + محلول عصير التفاح الخميرة