مقالة منهجية

-سهلت صوتنة المناعي تلطيخ المرحلة الجنينية في وقت متأخر من اليرقات و ذبابة الفاكهة الأنسجة في الموقع

DOI:

10.3791/51528

⸱

أغسطس 14, 2014

 ,  , 
1Department of Biology, College of William & Mary

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunostaining هي تقنية فعالة لتصور أنواع معينة من الخلايا والبروتينات داخل الأنسجة. من خلال استخدام الصوتنة ، يخفف البروتوكول الموصوف هنا من الحاجة إلى تشريح أنسجة ذبابة الفاكهة السوداء من الأجنة واليرقات في المرحلة المتأخرة قبل تلطيخ المناعة. نحن نقدم منهجية فعالة للتلوين المناعي لليرقات الكاملة المثبتة بالفورمالديهايد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدراسات التي أجريت في الدروسوفيلاميلانوجاستر الأجنة واليرقات توفر البصيرة الحاسمة في العمليات التنموية مثل مواصفات مصير الخلايا وتوالد الأعضاء. المناعية يسمح التصور تطوير الأنسجة والأعضاء. ومع ذلك، بشرة الواقية التي تشكل في نهاية مرحلة التطور الجنيني يمنع تخلل الأجسام المضادة في أواخر مرحلة الأجنة واليرقات. بينما تشريح قبل المناعية يستخدم بانتظام لتحليل أنسجة اليرقات ذبابة الفاكهة، فإنه يثبت عدم كفاءة بعض التحليلات لأن الأنسجة الصغيرة قد يكون من الصعب تحديد وعزل. يوفر صوتنة بديلا للتشريح اليرقات في بروتوكولات المناعية ذبابة الفاكهة. أنه يسمح للسريع، وتجهيز وقت واحد من عدد كبير من الأجنة في مرحلة متأخرة واليرقات ويحافظ على التشكل في الموقعي. بعد التثبيت في الفورمالديهايد، وsonicated عينة. ثم يتم إخضاع العينة لالمناعية مع مستضد معين نملة الأساسيibodies والأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى لتصور أنواع الخلايا المستهدفة وبروتينات معينة عبر مضان المجهري. خلال عملية صوتنة، تحديد المكان المناسب لتحقيق sonicating فوق العينة، فضلا عن مدة وشدة صوتنة، أمر بالغ الأهمية. قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات طفيفة الاضافيه المناعية بروتوكولات قياسية للبقع عالية الجودة. عن الأجسام المضادة مع إشارة إلى انخفاض نسبة الضوضاء، مرات حضانة أطول ضرورية عادة. كدليل على مفهوم لهذا البروتوكول، سهلت صوتنة، وتبين لنا immunostains من ثلاثة أنواع الأنسجة (الخصيتين والمبيض، والأنسجة العصبية) في مجموعة من المراحل التنموية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ذبابة الفاكهة الأجنة واليرقات توفر نموذجا ممتازا لدراسة العمليات التنموية في كثير من الأعضاء والأنسجة. التصوير من الخلايا الفردية غالبا ما يكون ضروريا في هذه الدراسات من أجل التأكد من البيئات المعقدة التي تتطور الخلايا. التصور من الخلايا في الأنسجة ويمكن تحقيق ذلك من خلال المناعية. موصوفة وصفا جيدا المناعية وجود بروتوكولات لذبابة الفاكهة الأنسجة الجنينية <17 ساعة بعد وضع البيض (أيل ليماسول) 1-3. ومع ذلك، فإن أشكال بشرة وقائية في نهاية مرحلة التطور الجنيني، ومنع تخلل فعالية الأجسام المضادة. وبالتالي، هذه البروتوكولات المناعية غير فعالة في تحليل أنسجة الأجنة في المراحل المتأخرة وفي مراحل لاحقة من نمو اليرقات (1 ش الطور (L1)، 2 الطور الثاني (L2)، و 3 الطور الثالث (L3)). هذا عدم الكفاءة تفرض عائقا أمام فهمنا للعمليات الحيوية التي تحدث خلال هذه الفترة التنموية طويلة 4. TISSرق تشريح هي تقنية تستخدم على نطاق واسع للتحايل على هذا الحاجز 5-7. ومع ذلك، يمكن تشريح يثبت غير فعالة. يمكن استخراج المرهونة من قبل صعوبة في تحديد أو عزل الجنينية والأنسجة اليرقات. وعلاوة على ذلك، وإزالة المادية من الأنسجة المستهدفة قد يسبب الضرر الناجم عن تمزق لهم أو بعدم استخراجها في مجملها.

صوتنة هو الطريقة التي توظف الموجات الصوتية لزعزعة التفاعلات بين الجزيئات. وقد تم استخدامه لتعطيل سلامة بشرة اليرقات ذبابة الفاكهة من أجل immunostain تطوير أنواع الخلايا العصبية 6. وقد تم تكييف هذا البروتوكول لimmunostain أواخر المرحلة الجنينية والغدد التناسلية اليرقات، التي يمكن أن تكون صغيرة مثل 50μm في قطر 8-10. من خلال هذه الدراسات، وقد اتسمت عملية الخلايا الجذعية الجرثومية (GSC) تشكيل مكانة الذكور في مرحلة متأخرة أجنة ذبابة الفاكهة 8-10 وآليات تنظيم وتطوير الخلايا الجذعية المتنوعةتم توضيح ferentiation في مرحلة متأخرة الغدد التناسلية الجنينية واليرقات 9-12. وبالتالي، يوفر صوتنة بديل فعال لتشريح الأنسجة التي قد تكون صعبة بسبب حجم الأنسجة. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن المناعية الأنسجة ذبابة الفاكهة في الموقع، وترك الخلايا داخل سياق كائن كامل والحفاظ على التشكل في الموقعي. هنا، نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة لالمناعية مضان من أواخر المرحلة الجنينية في وقت مبكر من خلال / الأنسجة منتصف L3 في الموقع. ويظهر تحليل ذبابة الفاكهة الغدد التناسلية والعصبية في الأنسجة ممثل النتائج لإثبات فعالية هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييفها هذا البروتوكول المناعية لتحليل الأنسجة ذبابة الفاكهة الأخرى وكذلك في أنسجة الكائنات الحية الأخرى ذات بشرة الخارجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد قفص مجموعة

  1. تخدير الشباب، والذباب خصبة مع CO 2. نقل الذباب تخدير إلى القفص. للحصول على العائد الأمثل، استخدم 100-120 الذباب الكبار تتراوح بين 2-7 أيام من العمر في 4: 1 نسبة الإناث إلى الذكور. السماح الذباب فترة التأقلم المناسبة، ~ 24 ساعة قبل الحصول على عينة لتثبيت. إذا تم تعيين قفص مع الإناث البكر لتزاوج الذكور، استخدام 36 - فترة التأقلم 48 ساعة.
  2. في نهاية مفتوحة من القفص، وضع معدة سلفا عصير التفاح لوحة أجار مع انخفاض سنتات الحجم من معجون الخميرة في وسط خلال افتتاح القفص. ثم، مع تأمين الشريط. اغلاق تقاطع بين لوحة أجار عصير التفاح والقفص مع parafilm.
  3. وضع القفص في وعاء مع عصير التفاح الثانوية وحة أجار كقاعدة والسماح للذباب إعادة عند درجة حرارة محددة لفترة زمنية مناسبة على النحو الذي يحدده التجربة.
    ملاحظة: مرات جمع العينات وايسوف تختلف. على سبيل المثال، عندما جمع أواخر مرحلة الأجنة / L1 اليرقات المبكرة (17 - 24 ساعة)، والسماح الذباب لتضع بيضها على لوحات أجار عصير التفاح لمدة 7 ساعة عند 25 درجة مئوية قبل الشيخوخة من العينة لمدة 17 ساعة عند 25 درجة مئوية. وبالمثل، لمجموعة من منتصف أواخر أول يرقات العمر (36 - 48 ساعة) تسمح الذباب لتضع بيضها لمدة 12 ساعة عند 25 درجة مئوية قبل الشيخوخة من العينة لمدة 36 ساعة عند 25 درجة مئوية.
  4. مرة واحدة في فترة زمنية كاملة، اضغط على قفص على طاولة بحيث تنخفض الذباب بعيدا عن لوحة أجار عصير التفاح بدون تخدير. بسرعة استبدال لوحة استخدامها مع واحد الطازجة التي تحتوي على قطرة من معجون الخميرة. تأمين لوحة جديدة مع الشريط وparafilm وتخزين قفص مع عصير التفاح لوحة أجار كقاعدة.
  5. إزالة بعناية قطرة من لوحة الخميرة المستخدمة مع ملعقة معدنية. مكان غطاء على استخدام عصير التفاح لوحة وضعت الأجنة تسمح للسن إذا لزم الأمر تجريبيا.
    ملاحظة: على الرغم من الشيخوخة العينات، قد يتم تخزين لوحات عند 25 درجة مئوية ما لم ارتفاع درجات الحرارة هي experimentaLLY المطلوبة. أمثلة على كيفية العمر الأجنة لجمع والمذكورة أعلاه (انظر الملاحظة للخطوة 1.3). تتم إزالة عجينة الخميرة قبل عينة الشيخوخة لمنع اليرقات من الزحف إلى الخميرة وكسر آغار تحتها. ما تبقى من أجار عصير التفاح ومعجون الخميرة بقايا توفر المغذيات اللازمة للنمو اليرقات. بينما فقدت الأجنة وضعت مباشرة في عجينة الخميرة من خلال إزالة عجينة الخميرة، وهذه الخسارة هي أفضل من الخميرة وبقايا أجار في العينة التي يمكن أن تقلل كفاءة تلطيخ. ينبغي للمرء أن يختار عدم إزالة عجينة الخميرة، قد يكون المسال الخميرة مع الفوسفات العازلة تريتون X-100 (PBTx)، ويخلط مع فرشاة الطلاء، ومن ثم إزالتها من العينة مع مصفاة الخلية قبل التثبيت.

2. التثبيت

  1. مرة واحدة الأجنة وضعت على طبق عصير التفاح أجار والذين تتراوح أعمارهم بين لنقطة الوقت المطلوب، واستخدام الفرشاة المبللة صغيرة مع الفوسفات العازلة تريتون X-100 (PBTx) حل لإزالة بعناية عينة من اللوحة الإلكترونية.
    ملاحظة: أقدم يرقات متحركة، ويمكن الزحف على الجهة الداخلية من الغطاء. يمكن جمع هذه العينة مماثل مع إزالة الفرشاة.
  2. مسح عينة الفرشاة المحملة ضد التلال التي تواجه المناطق الداخلية من مصفاة الخلية. ثم، وشطف جدران مصفاة والفرشاة مع زجاجة بخ تحتوي على حل PBTx. وضع غطاء طبق بتري تحت مصفاة لالتقاط حل PBTx.
  3. بعد أن تم نقل كل عينة إلى مصفاة، صب بما فيه الكفاية PBTx في مصفاة لرفع عينة من شبكة. ثم، رفع مصفاة وتصب محتويات طبق بتري في حاوية النفايات السائلة.
  4. كرر الخطوة 2.3 ثلاث مرات لإزالة الخميرة وذبابة النفايات التي قد تم نقلها جنبا إلى جنب مع العينة.
  5. صب يكفي 50٪ التبييض (NaOCl) / الماء ([ده 2 O) حل في مصفاة لجمع اليرقات من على شبكة. تسمح اليرقات على الجلوس في حل لمدة 5 دقائق. ثم، رفع مصفاة واسكب رانه محتويات طبق بتري في حاوية النفايات السائلة.
    مطلوب التبييض فقط في عينات الجنينية الذين تتراوح أعمارهم بين 0-22 ساعة من أجل إزالة الغشاء المشيمي: مذكرة. يمكن حذف تطبيق التبييض لعينات القديمة، ولكن إدراجه ليس ضارا. إذا كان المطلوب إغفال أو استبدال التبييض في هذه الخطوة مع PBTx. ينبغي استخدام التبييض المخفف خلال 24 ساعة من إعداد الحل.
  6. غسل العينة في مصفاة مع PBTx بسكب ما يكفي PBTx في مصفاة لرفع عينة من شبكة. تسمح عينة للجلوس في محلول لمدة 3 دقائق. ثم، رفع مصفاة وتصب محتويات طبق بتري في حاوية النفايات السائلة.
  7. كرر الخطوة 2.6 خمس مرات.
  8. ربت أسفل مصفاة الخلية الجافة، ثم نقل العينة إلى قارورة التلألؤ تحتوي على 1.75 مل من محلول PEMS باستخدام الفرشاة.
  9. العمل في غطاء الدخان التهوية، إضافة 250 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 37٪ و 8 مل من هيبتان الصف كاشف للقارورة التلألؤ.
    ملاحظة: الفورمالديهايد وهيبتان والخطرة. لأغراض السلامة، ومواصلة العمل في غطاء الدخان التهوية وارتداء القفازات المناسبة لخطوات 2،9-3،3.
  10. تسمح القارورة إلى هزة في 200 دورة في الدقيقة أو بسرعة معتدلة مماثلة لمدة 20 دقيقة.
  11. إضافة 10 مل من الميثانول إلى قارورة التلألؤ دون إزالة المرحلة المائية السابقة والسماح القارورة إلى هزة بقوة في 500 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: الميثانول هو الخطرة. مواصلة العمل في غطاء الدخان التهوية وارتداء القفازات المناسبة.
  12. إزالة قارورة من شاكر وعلى الفور صب محتويات في مصفاة الخلية أكثر من حاوية النفايات السائلة في غطاء محرك السيارة. إضافة الميثانول اضافية لالقارورة وتعمل من خلال مصفاة الخلية اللازمة لضمان تمت إزالة كل عينة.
    ملاحظة: مصافى الخلية قد تستنزف ببطء. لتصحيح هذا، لمس الأنسجة المختبر إلى أسفل مصفاة الخلية من أجل استخلاص الحل من خلال مصفاة بسرعة أكبر. والميثانول، وينبغي أن يكون الفورمالديهايد، وهيبتانتخزينها في حاويات النفايات المناسبة حتى التخلص السليم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
  13. أسفل الجافة من مصفاة الخلية باستخدام مختبر الأنسجة، ثم استخدام الفرشاة لنقل عينة المأسورة في مصفاة لأنبوب 1.5 مل microcentrifuge تحتوي 0.5 مل من الميثانول.
    ملاحظة: إذا قارورة التلألؤ متعددة قيد الاستخدام، أكمل الخطوات 2.12 و 2.13 قارورة واحدة في وقت واحد لمنع عينة من الجفاف على مصافى الخلية.
  14. مرة واحدة تم إضافة العينة إلى أنبوب microcentrifuge، إزالة الميثانول مع ماصة. استقر ضمان العينة إلى أسفل الأنبوب.
  15. شطف العينة في أنبوب microcentrifuge بإضافة حوالي 0.5 مل من الميثانول إلى الأنبوب. الانتظار لعينة لتسوية ثم إزالة الميثانول مع ماصة.
  16. كرر الخطوة 15 ثلاث مرات.
  17. إضافة 0.5 مل من الميثانول إلى أنبوب، ومن ثم تخزينها في الثلاجة -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

3. الإماهة وإعداد نموذج للالمناعية

  1. إزالة الميثانول من أنبوب microcentrifuge مع ماصة، وترك العينة في أنبوب. الميثانول مخزن النفايات إلى حاوية النفايات المناسبة حتى وقت التخلص السليم.
    ملاحظة: لتعزيز كفاءة صوتنة، استخدم ما لا يزيد عن 3 ملم من عينة استقرت في أسفل أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. يجوز نقل عينة الزائدة إلى أنبوب منفصل مع ماصة قبل البدء في خطوة الإماهة أعلاه. قطع غيض ماصة مع شفرة حلاقة نظيفة يمكن استخدامها لمنع انسداد طرف ماصة.
  2. إضافة 1.0 مل من 50٪ الميثانول / الفوسفات العازلة توين (PBTw) حل للأنبوب والصخور لمدة 3 دقائق.
  3. إزالة حل الميثانول إلى حاوية النفايات المناسبة وشطف مع 1.0 ميكرولتر من PBTw مرتين. بعد كل شطف، والسماح للعينة ليستقر قبل الرسم قبالة PBTw مع ماصة.
  4. إضافة 1.0 مل من مصل بقري الزلال / الفوسفات مخزنة توين (BBTw) مزيج إلى القارورة والصخور. بعد 3 دقائق على الكرسي الهزاز، والسماح للعصيدةلو لتسوية وإزالة BBTw مع ماصة.
  5. كرر الخطوة 3.4 مرتين مع الحرص على إزالة BBTw قدر الإمكان دون أن تفقد العينة بعد غسل الماضي.
  6. إضافة 0.5 مل من BBTw إلى الأنبوب ووضع أنبوب على الجليد.

4. صوتنة من عينة

  1. تعيين sonicator إلى 10٪ كحد أقصى السعة وتعيين وقت التشغيل من 2 ثانية صوتنة المستمر.
    ملاحظة: هذه الإعدادات خاصة إلى sonicator مبين في الجدول المواد والمعدات وربما تتطلب الأمثل لsonicators مختلف.
  2. قبل صوتنة من العينة، وتنظيف التحقيق sonicator عن طريق وضع تلميح التحقيق في أنبوب مخروطي 50 مل مليئة منزوع الأيونات الماء وتشغيل sonicator لتنظيف التحقيق. التحقيق sonicator الجاف مع مختبر الأنسجة بعد التشغيل.
  3. غمر التحقيق في أنبوب microcentrifuge تحتوي العينة بحيث يتم وضعه ما يقرب من 3 إلى 4 مم فوق العينة وبدء صوتنة.
  4. إزالة مأنبوب icrocentrifuge ووضعه على الجليد لمدة 30 ثانية على الأقل لتبديد الحرارة من صوتنة والسماح عينة ليستقر على مستوى الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge.
  5. كرر الخطوات من 4.3 و 4.4 حسب الحاجة على أساس العمر من العينة التي يجري تجهيزها.
    ملاحظة: بالنسبة لحجم العينة الأمثل صوتنة والأجنة الذين تقل أعمارهم عن 17 ساعة لا تتطلب صوتنة، ولكن الذين تتراوح أعمارهم بين 17 و 24 ساعة (مرحلة 17 / أوائل-L1) تتطلب اثنين sonications. اليرقات بين 24 - 36 (أوائل / أواسط-L1)، 36 - 48 (منتصف / أواخر-L1)، 48-60 (أوائل / أواسط L2)، 60-72 (منتصف / أواخر-L2)، 72-84 ( في وقت مبكر-L3)، 84-96 (أوائل / أواسط L3)، 96-108 (منتصف / أواخر-L3) ساعة تتطلب 5، 9، 11، 13، 15، 18، و 22 sonications على التوالي. انظر المناقشة لمزيد من التفصيل في الأوقات صوتنة.
  6. شطف مع 1.0 مل BBTw مرتين. بعد كل شطف سماح العينة ليستقر قبل الرسم قبالة BBTw مع ماصة.
  7. إضافة 1.0 مل من BBTw إلى القارورة والصخور. بعد 3 دقائق على الروك، والسماح للعينة لتسوية وإزالة BBTw مع ماصة.
  8. كرر الخطوة 4.7 مرتين.

5. المناعية

  1. منع العينة بإضافة المصل العادي 5٪ المخفف في BBTw إلى أنبوب microcentrifuge. إزالة كتلة بعد هزاز لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: استخدام مصل طبيعي من الأنواع التي يتم إنشاء الأجسام المضادة الثانوية.
  2. تمييع الأجسام المضادة الأولية المناسبة لتركيز العمل في 5٪ المصل العادي / BBTw الحل.
  3. عينة الصخور في الابتدائي يا حل الأجسام المضادة / N عند 4 درجات مئوية أو على الأقل لمدة 3 ساعة على RT (حوالي 22 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد تتغير مدة حضانة الأجسام المضادة ودرجات الحرارة. O / N الحضانة عند 4 درجات مئوية أو 3 ساعة على RT يكفي عادة. ومع ذلك، فإن فترة حضانة المرض لمدة يومين قد يؤدي إلى تعزيز جودة تلطيخ، وخاصة مع عينات القديمة أو عند استخدام الأجسام المضادة الأولية منخفضة تقارب. وعادة ما يتم تنفيذ حضانات أطول في 4 درجات مئوية. يجب أن يتم اعتبارات مماثلة عند استخدام الأجسام المضادة الثانوية (انظر 5.10).
  4. السماح عينة لتستقر فيأسفل microfuge أنبوب. رسم من الأجسام المضادة الأولية مع ماصة. حفظ الأجسام المضادة لإعادة استخدامها إذا لزم الأمر.
  5. شطف مع 1.0 مل من BBTw مرتين. بعد كل شطف تسمح عينة ليستقر قبل الرسم قبالة BBTw مع ماصة.
  6. إضافة 1.0 مل من BBTw إلى القارورة والصخور. بعد 3 دقائق على الروك، تسمح عينة لتسوية وإزالة BBTw مع ماصة.
  7. كرر الخطوة 5.6 خمس مرات.
  8. عينة كتلة بإضافة 5٪ المصل العادي / BBTw حل للأنبوب microcentrifuge. إزالة كتلة بعد هزاز لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
    ملاحظة: لا يشترط هذه الخطوة حجب إضافية، لكن قد يحسن نوعية تلطيخ عن الأجسام المضادة المحددة.
  9. تمييع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لتركيز العمل في 5٪ المصل العادي / BBTw الحل.
  10. التفاف أنبوب microcentrifuge في رقائق الألومنيوم لتقليل يتلاشى بسبب التعرض للضوء. عينة الصخور في حل الضد الثانوية لمدة 12 إلى 48 ساعة في 4 درجات مئوية أو على الأقل لمدة 3 ساعة على RT (حوالي 22 درجة مئوية.
  11. السماح عينة لتستقر في قاع microfuge أنبوب. رسم من الأجسام المضادة الثانوية مع ماصة.
  12. شطف مع 1.0 مل من PBTw مرتين. بعد كل شطف تسمح عينة ليستقر قبل الرسم قبالة PBTw مع ماصة.
  13. إضافة 1.0 مل من PBTw إلى القارورة والصخور. بعد 5 دقائق على الروك، والسماح للعينة لتسوية وإزالة PBTw مع ماصة.
  14. كرر الخطوة 5.13 ثلاث مرات.
  15. اختياري: إضافة دابي مخففة 1: 1،000 في PBTw. عينة الصخور ملفوفة في رقائق الألومنيوم لمدة 3 دقائق. ثم إزالة حل دابي مع ماصة. شطف خمس مرات مع 1.0 مل من PBTw، مما يسمح للعينة ليستقر قبل إزالة PBTw مع ماصة.
  16. إضافة 80-100 ميكرولتر من 1،4-diazabicyclo [2.2.2] اوكتان (DABCO) حل لأنبوب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد تكون بديلا وكيل مكافحة تتلاشى آخر قائم على الجلسرين ل.

تحليل 6.

  1. قبل تركيب العينة على الشرائح، إضافة اضافي 5-10 ميكرولتر من DABCO / ف كايسيylenediamine (PPD) antifade حل لأنبوب microcentrifuge.
    ملاحظة: يمكن إضافة عينة على الشرائح دون تشريح. حجم العينة تضاف إلى شريحة يختلف مع حجم غطاء زلة. عندما pipetting لالعينة على الشريحة، يمكن خفض غيض ماصة قبالة باستخدام شفرة حلاقة لمنع عينة القص. غالبا ما يكون من المفيد أن يبطن عينة تصل في الصفوف لتحليل سهلا. إضافة PPD وكيلا antifade إضافية قد لا تكون مطلوبة، ولكن يمكن منع photobleaching من إذا يتم تخزين العينات على المدى الطويل.
  2. ضع بلطف الغطاء الزجاجي الانزلاق على العينة. ثم، آمن انزلاق الغطاء في مكانه تستخدم طلاء الأظافر.
  3. عرض شنت العينة باستخدام المجهر مضان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للتدليل على فعالية المناعية القائم على صوتنة في تحليل المراحل المتأخرة الجنينية والأنسجة اليرقات في الموقع، تم تجهيز البرية من نوع الأجنة واليرقات لالمناعية من الخصية والمبيض، والأنسجة العصبية. تم تصوير عينات عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر وتظهر نتائج ممثلة (الشكل 1 والشكل 2). وتكشف النتائج أن البروتوكول وصف فعالة لتصور معالم شكلية وكذلك الخلايا الفردية في الموقع أثناء المراحل المتأخرة الجنينية خلال وقت مبكر / منتصف L3 التنمية ذبابة الفاكهة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول طريقة لذبابة الفاكهة بنجاح immunostain استهداف الجنينية والأنسجة اليرقات في الموقع، وبالتالي القضاء على الحاجة للتشريح. وفقا لبروتوكولات مسبقة لتلطيخ الأجنة المبكرة 1،2،3، تتم إزالة الغشاء المشيمي باستخدام 50٪ التبييض (NaOCl). يتم إصلاحها في عينات الفورمالديهايد والميثانول. لأن بشرة اليرقات تسبب عينة القديمة لتطفو، ثم يتم تمرير عينة كاملة من خلال خلية مصفاة لضمان الاحتفاظ اليرقات. يتم تخزين العينة، إذا رغبت، في الصف الكيميائية الميث...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن ممتنون ليمان روث وDorthea GODT الذين زودوا يرجى فاسا وازدحام المرور الأجسام المضادة. نود أن نعترف مركز بلومينغتون المالية في جامعة إنديانا للحفاظ على مخزون المقدمة والدراسات ورم هجين البنك التنموية وضعت برعاية معاهد الصحة القومية والتي تحتفظ بها جامعة ولاية ايوا. نشكر جميع أعضاء المختبر Wawersik للحصول على المشورة والدعم. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل علماء مونرو برنامج منح (لAF وLB) وجبهة الخلاص الوطني منح IOS0823151 (لMW).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الجدول 1: الكواشف والمخازن
المؤقتة للفوسفات Triton X-100 (PBTx)ل 5 لتر: 500 مل PBS 10X ، 4.45 لتر ddH 2< / sub >O ، 50 مل تريتون 10٪. تخزين في RT.
ملحي عازل للفوسفات 10X (PBS 10X)ل 1 لتر في dH 2 < / sub >O: 80 جم كلوريد الصوديوم ، 2 جم كلوريد كلوريد ، 14.4 جم Na 2< / sub>HPO4< / sub> ، 2.4 g KH2< / sub>PO4< / sub>. أضف المكونات واملأها إلى الحجم المناسب. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
تريتون 10٪ل 50 مل: 5 مل من تريتون ، 5 مل من PBS 10X ، 45 مل من ddH2< / sub>O. صخرة للخلط. تخزين في RT.
PEMS0.1 M (درجة الحموضة 6.9) ، 2.0 ملي مولار MgSO4< / sub> ، 1.0 ملي مولار EGTA. تخزين في RT.
الأنابيبللحصول على 400 مل من محلول 0.25 متر (الرقم الهيدروجيني 6.9): 30.24 جم الأنابيب dH2< / sub>0 هيدروكسيد الصوديوم. قم بإذابة الأنابيب في 300 مل dH2< / sub>O ثم اضبطها على درجة الحموضة 6.9 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. ارفع الحجم الإجمالي إلى 400 مل باستخدام dH2O والأوتوكلاف. تخزين في RT.
الفورمالديهايد37٪ الفورمالديهايد بالوزن في الميثانول. يخزن في RT. قم بتخزين خليط نفايات الفورمالديهايد والهيبتان والميثانول في وعاء محكم الغلق في غطاء الدخان قبل التخلص منه وفقا للإرشادات المؤسسية.
هيبتانCAS 142-82-5ن-هيبتان. يخزن في RT. قم بتخزين خليط نفايات الفورمالديهايد والهيبتان والميثانول في وعاء محكم الغلق في غطاء الدخان قبل التخلص منه وفقا للإرشادات المؤسسية.
الميثانولCAS 67-56-1في RT. قم بتخزين خليط نفايات الفورمالديهايد والهيبتان والميثانول في وعاء مغلق بإحكام في غطاء الدخان قبل التخلص منه وفقا للإرشادات المؤسسية.
عازلة الفوسفات توين (PBTw)لعمل 1 لتر: 100 مل PBS 10X ، 890 مل ddH 2< / sub>O ، 10 مل توين 10٪. تصفية التعقيم بعد إضافة جميع المكونات. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
توين 10٪ل 50 مل: 5 مل توين ، 5 مل من PBS 10X ، 40 مل من ddH2< / sub>O. صخرة للخلط. تخزين في RT.
ألبومين البقر / عازلة الفوسفات توين (BBTw)لصنع 1 لتر: 100 مل PBS 10X ، 890 مل DDH 2< / sub>O ، 10 مل توين 10٪ ، 1 جم ألبومين مصل البقر (BSA). أضف BSA ثم تعقيم باستخدام 0.2 & mu ؛ م وحدة تصفية فراغ. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
مصل الماعز العادي (NGS)مختبرات أكسون للأبحاث المناعية005-000-121لصنع 10 مل: مصل الماعز العادي 10 مل ddH 2< / sub>O. أضف ddH2< / sub>O إلى قارورة NGS وتعقيمها باستخدام 0.2 & mu ؛ مرشح M Syrninge. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية.
1،4-ديازابيسيكلو [2.2.2] أوكتان (دابكو)CAS: 281-57-9لصنع 100 مل: 25 مل ddH 2< / sub>O ، 1 مل تريس حمض الهيدروكلوريك (1 م ، درجة الحموضة 7.5) ، 2.5 جم من DABCO الصلب ، 3.5 مل 6N HCl ، 250 & mu ؛ ل 10N هيدروكسيد الصوديوم ، 70 مل جلسرين. في دورق سعة 250 مل مع شريط التحريك ، أضف ddH2< / sub>O و Tris HCl و DABCO. يقلب ثم يضاف 6N HCl و 10 N هيدروكسيد الصوديوم والجلسرين. ثم أضف 10N هيدروكسيد الصوديوم بالتنقيط حتى يصل المحلول إلى الرقم الهيدروجيني 7.5. Aliquot. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية.
p-phenylenediamine (PPD)1.765 مل NaHCO3 ، 0.353 Na2< / sub>CO3< / sub> ، 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). قم بإذابة PPD في محلول NaHCO3 و NaCO3. أضف 60 مو ؛ ل من محلول PPD إلى 500 مو ؛ ل من DABCO. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية.
أطباقلصنع ~ 200 طبق: 45 جرام أجار (CAS # 9002-18-0) ، 45 جرام سكر حبيبي (تم شراؤه من المتجر) ، 500 مل عصير تفاح (تم شراؤه من المتجر) ، 15 مل Tegosept 10٪ ، 1.5 مل ddH 2< / sub>O. أضف أجار إلى ddH2< / sub>O في قارورة 4 لتر ثم الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة. يضاف خليط عصير التفاح تدريجيا إلى أجار معقمات. اخلطيها على طبق التحريك الساخن ثم اخلطي كميات 10 مل في أطباق بتري مقاس 35 مم واتركيها عند RT لتتجمد. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
Tegosept 10٪لصنع 100 مل: 10 جم تيجوسيبت ، 100 مل إيثانول. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية.
معجون~ 50 جم خميرة نشطة جافة. أضف تدريجيا ddH2< / sub>O إلى دورق يحتوي على خميرة مع التقليب حتى يصل إلى قوام يشبه العجينة. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
الجدول 2: مواد تلطيخ
DAPIInvitrogenD35711: 1000 ، مخزون بسعر 5 مجم / مل.
أرنب مضاد لفاسا1: 250 ، هدية من روث ليمان.
الفأر المضاد للفاشيكلين IIIالدراسات التنموية بنك الورم الهجين (DSHB)7G101:10
الفأر المضاد ل 1B1الدراسات التنموية بنك الورم الهجين (DSHB)1B11: 4
Guniea pig anti-TrafficCrowd 1: 2500 ، هدية من Dorthea Godt (Li et al ، 2003).
الفأر المضاد لبروسبيروللدراسات التنموية بنك الورم الهجين (DSHB)بروسبيرو MR1A1:10
الفئران المضادةللدراسات التنموية بنك الورم الهجين (DSHB)7EBA101:30
الفأر المضاد للريبوالدراسات التنموية بنك الورم الهجين (DSHB)8D121:10
الماعز المضاد للأرانب Alexa546InvitrogenA110101:500
الماعز المضاد للفأر Alexa488InvitrogenA110291:500
خنزير الماعز المضاد للguniea Alexa633InvitrogenA211051:500
الماعز المضاد للفئران Alexa488InvitrogenA110061:500
الجدول 3: المواد والمعدات
أقفاص الذبابالمصنوعة يدويا. شركة جينيسي العلميةغير قابلة للتطبيق. زجاجات: 32-130 ؛ قفص مسبقة الصنع: 59-101مصنوع عن طريق قطع أنابيب الأكريليك المصبوبة الشفافة (قطرها 1 3/4 بوصة) إلى شرائح بطول 4 بوصات بمنشار ميتري مركب عند 400 دورة في الدقيقة. غربلة متناهية الصغر من الفولاذ المقاوم للصدأ (تم توصيلها بأحد طرفي الحوض بغراء أكريليك كومبوند. يمكن العثور على طريقة بديلة باستخدام زجاجة طعام ذبابة فارغة في ذبابة الفاكهة بروتوكولات ISBN 0-87969-584-4. يمكن أيضا شراء الأقفاص من شركة Genesee العلمية.
سونيكاتور: برانسون 250 سونيفايير رقميبرانسوننموذج: برانسون سونيفاير رقمي 250
مسبار سونيكاتوربرانسوننموذج #: 102C (CE)EDP: 101-135-066 ؛ S / N: OBU06064658
مرشح حقنةNalgene190-25-200.2 & m السليلوز ، مرشح غشاء الأسيتات
نظام التصوير: مجهر متحد البؤر للقرص الدوار مع مصدر ضوء متعدد الألوان ، وكاميرا CCD رقمية ، وبرنامج تصويرمجهر: أوليمبوس ، مصدر الضوء: Lumen Dynamics ، الكاميرا: Q-Imaging ، برنامج التصوير: Intelligent Imaging Inc.المجهر: BX51 مزود بقرص دوارة DSU ، مصدر الضوء: X-Cite 120Q ، الكاميرا: RETIGA-SRV ، برنامج التصوير: Slidebook 5.0
وحدة تصفية الفراغNalgene450-00200.2 & mu ؛ مرشح غشاء نترات السليلوز M
محلول أنابيب مخزن مصل DABCO + محلول عصير التفاح الخميرة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
  2. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
  3. Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
  4. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
  5. Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
  6. Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
  7. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. , (2011).
  8. Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
  9. Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
  10. Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
  11. DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
  12. Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
  13. Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
  14. Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  15. Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
  16. Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
  17. Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
  18. Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45(2011).
  19. Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
  20. Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
  21. Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202(2011).
  22. Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
  23. Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
  24. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  25. Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
  26. Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
  27. Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
  28. Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
  29. Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
  30. Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة