يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

Nanomanipulation من واحدة RNA الجزيئات بواسطة الملقط البصرية

14.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51542

⸱

أغسطس 20, 2014

 ,  ,  , 
1Nanoscale Engineering Graduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 2Nanoscale Science Undergraduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 3Nanobioscience Constellation, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 4The RNA Institute, University at Albany, State University of New York, 5Department of Biological Sciences, University at Albany, State University of New York

في هذه المقالة

ملخص

< p class = 'jove_content'> تم استخدام ملاقط بصرية لدراسة طي الحمض النووي الريبي عن طريق شد الجزيئات الفردية من نهاياتها 5 و 3. يتم هنا وصف الإجراءات الشائعة لتصنيع جزيئات الحمض النووي الريبي للتواء ومعايرة الأداة وطرق معالجة الجزيئات المفردة.

الملخص

هو كتب جزء كبير من الجينوم البشري ولكن لم تترجم. في هذا العصر الجينومي آخر، وقد تبين أن المهام التنظيمية من الحمض النووي الريبي لتكون ذات أهمية متزايدة. وظيفة RNA غالبا ما يعتمد على قدرته على اعتماد هياكل بديلة، فمن الصعب التنبؤ RNA الهياكل ثلاثية الأبعاد مباشرة من التسلسل. يقترب احد جزيء تظهر إمكانات لحل مشكلة RNA تعدد الأشكال الهيكلي من خلال مراقبة الهياكل الجزيئية جزيء واحد في كل مرة. يقدم هذا العمل وسيلة للتلاعب على وجه التحديد للطي وبنية جزيئات الحمض النووي الريبي واحدة باستخدام ملاقط بصرية. أولا، طرق لتجميع وصفها جزيئات مناسبة للجزيء واحد العمل الميكانيكي. وتناقش المقبلة، مختلف الإجراءات المعايرة لضمان عمليات السليم للملاقط بصرية. المقبل، وأوضح تجارب مختلفة. للتدليل على فائدة هذه التقنية، نتائج تتكشف ميكانيكيا دبابيس الشعر RNA و RNA واحد كيسينوتستخدم ز مجمع كدليل. في هذه الأمثلة، تم استخدام تقنية nanomanipulation لدراسة لطي من كل مجال الهيكلي، بما في ذلك الثانوية والثالثية، بشكل مستقل. وأخيرا، وتناقش القيود والتطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة.

المقدمة

منذ فترة طويلة رافقت تطور تقنية ملاقط بصرية مع تطبيقه في الأبحاث البيولوجية. عندما اكتشفت لأول مرة تأثير محاصرة البصرية، لاحظ آرثر Ashkin أن البكتيريا في المياه الملوثة يمكن محاصرين في التركيز الليزر 1. منذ ذلك الحين، أصبحت محاصرة البكتيريا وغير مقصود، تجربة ممتعة لأجيال من طلاب الفيزياء الحيوية وكذلك أداة بحثية جادة لدراسة علم وظائف الأعضاء الميكروبية 2،3. تستخدم تقنية محاصرة البصرية شعاع الليزر مركزة لشل حركة كائن مجهري 1. عمليا، فخ الليزر وظائف باعتباره الربيع البصري، الذي يقيس أيضا القوة (F) على الكائن المحاصرين من النزوح لها من مركز فخ (ΔX). ضمن نطاق قصير، F = κ س ΔX، في κ هو ثابت ربيع الفخ. فخ البصرية يمكن أن تستخدم لممارسة القوة في picoNewton (PN) الدقة إلى صغار جداالكائن copic وقياس موقفها مع نانومتر الدقة. في العقدين الماضيين، أصبحت ملاقط بصرية واحدة من التقنيات جزيء واحد الأكثر استخداما في الفيزياء الحيوية. واستخدمت هذه التقنية لدراسة لطي واليات 4-6 DNA، RNA 7-9، والبروتينات 10،11. كما تم استخدام ملاقط بصرية لمراقبة تكرار الحمض النووي 12، RNA النسخ 13، وتخليق البروتين 14،15، فضلا عن العديد من الأحداث الجزيئية البيولوجية الأخرى 16-18.

ويعمل نهج واحد جزيء RNA في البحوث الهيكلي أساسا لاستكشاف المناظر الطبيعية الوعرة الطاقة للطي من الحمض النووي الريبي. تسلسل RNA يمكن طيها عادة في هياكل متعددة مستقرة ويستبعد بعضها بعضا، وذلك بسبب قواعد التركيب الكيميائي والتقشير قاعدة بسيطة من الحمض النووي الريبي. منذ فترة طويلة كان من المعروف أن RNA تعدد الأشكال الهيكلية، مثل أن يحدث في riboswitches 19،20، يلعب دورا هاما في تنظيم الجينات. وrecenوقد كشف مسح ر الجينوم على نطاق أن تغيرات درجة الحرارة صغيرة مثل بضع درجات تؤثر بشكل كبير هيكل والبروتين من جزء كبير من Transcriptome على الخلوي 21. تلميحات هذا المثال أن الدور البيولوجي للRNA البديل للطي هو ربما أكثر أهمية وانتشارا مما كان يفترض سابقا. تعدد الأشكال الهيكلي، ومع ذلك، يشكل تحديا للنهج البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية التقليدية، التي تدرس متوسط ​​خصائص العديد من الجزيئات. على سبيل المثال، "على" والتشكل "OFF" لriboswitch حصرية بشكل متبادل. هيكل المتوسط ​​المستمدة من الهياكل غير متجانسة من غير المحتمل أن تشبه أي من المتشاكلات ذات الصلة من الناحية البيولوجية. وعلاوة على ذلك، RNA الأهرام ومرنا عادة ما تشكل الهياكل. تفاعلها مع البروتينات والرنا التنظيمية يتطلب عادة تتكشف من الهيكل الحالي كجزء من التفاعل. لذلك، ودراسة RNA تتكشف / refolding يصبح وثيقة الصلةقضية البيولوجيا RNA. لمواجهة مثل هذا التحدي، فقد تم توظيف نهج واحد جزيء RNA لكشف تعدد الأشكال الهيكلي من خلال دراسة جزيء في وقت واحد 22-27.

بالمقارنة مع شعبية واحدة جزيء طريقة مضان، ملاقط استنادا الميكانيكية تتكشف تقدم ميزة أن التشكل من الجزيئات الفردية يمكن التلاعب بالقوة التطبيقية وقياسها بدقة نانومتر. ويمكن استخدام هذه القدرة nanomanipulation لمراقبة تتكشف / للطي من المجالات البنيوية الفردية بحيث للطي الهرمي من RNA كبير يمكن تشريح 28. بدلا من ذلك، ضفيرة واحدة يمكن أن توجه إلى أضعاف في واحدة من عدة المتشاكلات. أو هيكل قائم يمكن أن يتسبب ميكانيكيا لrefold إلى التشكل مختلفة 29. تحت الظروف البيولوجية، بنية RNA يمكن تغييرها بناء على التغير في درجة الحرارة أو يجند ملزمة. القدرة على التلاعب مباشرة ق الجزيئيةtructure يفتح مكان جديد من الحمض النووي الريبي دراسة الهيكلية. من حيث المبدأ، والتقنيات الميكانيكية الأخرى، مثل مجهر القوة الذرية وملاقط المغناطيسية، يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة لطي من جزيئات الحمض النووي الريبي واحدة. ومع ذلك، هذه الطلبات تقتصر إلى حد كبير نظرا لدقة المكاني منخفض نسبيا 30.

توظيف ملاقط بصرية يسمح الهياكل RNA أن تكشفت بالقوة الميكانيكية.

ميزة الميكانيكية التي تتكشف هي عدة أضعاف. ويمكن استخدام القوة لتتكشف الهياكل كلا الثانوية والثالثية، في حين ايونات المعادن ويجند الناجم لطي تقتصر أساسا إلى هياكل التعليم العالي. درجة الحرارة وممسخ يمكن أن تؤثر تأثيرا كبيرا على أنشطة المياه والمواد المذابة. في المقابل، يتم تطبيق قوة محليا إلى التشويش على الهياكل الجزيئية. تأثير القوة على البيئة المحيطة لا يكاد يذكر. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام أفضل ذوبان الحراري لدراسة ديناميكا الحرارية للطي الهياكل RNA الصغيرة،في حين تم استخدام ملاقط بصرية لدراسة الهياكل RNA مع أحجام مختلفة، تتراوح بين سبعة tetraloop دبوس قاعدة الزوج 28 إلى ribozyme 400 النوكليوتيدات 31. وعلاوة على ذلك، والهياكل RNA يمكن تكشفت ميكانيكيا في درجات حرارة متوسطة الحرارة. في المقابل، تتكشف الرنا في تجربة ذوبان الحرارية، ودرجة الحرارة وعادة ما المثارة أعلاه جيدا درجات الحرارة الفسيولوجية، مما يزيد بشكل كبير RNA المائي، خاصة في وجود أيونات المغنيسيوم 2+.

من المهم أن نلاحظ أن التأثير الميكانيكي للقوة يعتمد على كيفية تطبيقه على هيكل. قوة التطبيقية يميل المشهد الطاقة للطي. على سبيل المثال، عندما يتم تطبيق قوة إلى منعطف حاد، يتم تقسيم أزواج قاعدة بالتتابع، في وقت واحد (الشكل 1A). شوكة تمزيق تقدم على طول محور حلزونية، وهو عمودي على القوة المستخدمة. في المقابل، عندما مجمع التقبيل الحد الأدنى هو تحت التوتر، وهما التقبيلأزواج قاعدة، هي موازية للقوة التطبيقية، تبادل الحمل القوة (الشكل 1B). هندستها مختلفة من دبوس الشعر والتقبيل قريب معقدة إلى نتيجة القوة المطبقة في استجابتها الميكانيكية المختلفة، والتي يمكن استخدامها للتمييز بين الثانوي والعالي للطي 28،32. تم استعراض الجانب النظري من الميكانيكية التي تتكشف في وقت سابق 8،9،30. ويعرض هذا العمل النهج الأساسية لإعداد وتنفيذ واحد جزيء الميكانيكية فحص تتكشف.

الإعداد التجريبية. في تجربة سحب الميكانيكية لدينا، وتتكون عينة الحمض النووي الريبي لنتف الريش من الحمض النووي الريبي التي تهم يحيط بها اثنان مقابض DNA / RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الشكل 2) 7. يمكن المربوطة الجزيء بأكمله لاثنين من الخرز ميكرون حجم المغلفة سطح (Spherotech) عبر streptavidin البيوتين وتفاعلات الأجسام المضادة digoxigenin-مكافحة digoxigenin، على التوالي. يقام حبة واحدة من قبل آر البصرية قياس القوةا ف ب، في حين أن الآخر هو عقد على غيض من micropipette. المسافة النسبية بين حبات يمكن تغيير إما عن طريق توجيه فخ أو نقل micropipette. باستخدام هذا النهج، جزيء RNA وحيد يربطون حبات يمكن أن تمتد والاسترخاء.

إعداد العينات. تجميع عينات الحمض النووي الريبي لنتف الريش يتضمن خطوات قليلة (الشكل 3). أولا، يتم استنساخ تسلسل الحمض النووي RNA المقابلة لمن الفائدة لأول مرة في ناقلات البلازميد. بعد ذلك، يتم تنفيذ ثلاثة تفاعلات PCR لتوليد اثنين من مقابض وقالب لالنسخ. القالب النسخ يشمل المناطق المقبض وتسلسل المدرجة. يتم تصنيعه طول RNA كاملا في المختبر النسخ. أخيرا، ويلدن الحمض النووي الريبي ومقابض معدلة كيميائيا معا لتوليد جزيئات لنتف الريش.

معايرة وتشغيل الملقط. التصميم الأساسي لاستخدام Minitweezersد في هذا العمل يتبع ذلك من ملاقط بصرية مزدوجة شعاع 33. مع العديد من التحسينات، عرض Minitweezers الاستقرار الاستثنائي بالمقارنة مع ملاقط بصرية الجيل الأول. وهناك عدد من المجموعات البحثية في العديد من البلدان استخدام Minitweezers في مجال البحوث جزيء واحد من 14،15،34-37. تفاصيل البناء، والمعايرة، وتشغيل الجهاز، بما في ذلك أشرطة الفيديو التعليمية، وتتوفر في "الملقط لاب" على الانترنت (http://tweezerslab.unipr.it). هنا، يتم وصف التحسينات وإجراءات المعايرة التي تحتاج إلى أن يقوم على أسس اليومية بالتفصيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد RNA الجزيئات لجزيء واحدة نتف الريش

  1. استنساخ تسلسل الفائدة. استنساخ تسلسل الحمض النووي المقابلة لبنية الحمض النووي الريبي في ناقلات.
  2. التوليف وتنقية من القالب النسخ. تجميع قالب النسخ بواسطة PCR. [المائدة 1 مكان هنا] التالي، وتنقية المنتجات PCR باستخدام طقم تنقية PCR، وتركيز العينة ل> 200 نانوغرام / ميكرولتر. لأنه يتم استخدام الحمض النووي لتنقية النسخ، ريبونوكلياز المياه مجانا وينبغي أن تستخدم في شطف وتركيز الخطوات.
  3. في النسخ المختبر. توليف الحمض النووي الريبي في المختبر النسخ عند 37 درجة مئوية خلال الليل لتعظيم العائد الحمض النووي الريبي. [المائدة 2 مكان هنا] بعد النسخ، إضافة 1 ميكرولتر الدناز أنا لهضم قالب الحمض النووي لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تنقية RNA باستخدام عمود السيليكا زيادة ونقصان.
  4. تركيب المقبض المعقدة البيروكسيديز A. الأولى، ينتج مقبض معدلة A عن طريق PCR باستخدام بادئات آف وعار واضربentrate تضخيم الحمض النووي ل> 200 نانوغرام / ميكرولتر. المقبل، تتضمن التعديلات البيوتين في المنتج باستخدام PCR رد فعل تمديد التمهيدي. [المكان الجدول 3 هنا] ملاحظة: المؤشر المعقدة البيروكسيديز ألف (البيوتين-HA) يمكن استخدامها مباشرة في الصلب دون تنقية. كما البيوتين-HA هو أن صلب مع RNA، من المهم جدا لاستخدام ريبونوكلياز المياه مجانا في كل الخطوات.
  5. تركيب المقبض المعدلة digoxigenin B. توليف digoxigenin تعديل مقبض B (DIG-HB) بواسطة PCR باستخدام التمهيدي فرنك بلجيكي وتعديل digoxigenin بنسبة ضئيلة حفر-BR (الشكل 3). المقبل، تنقية المنتج PCR وتركيز العينة ل> 200 نانوغرام / ميكرولتر.
  6. الصلب RNA إلى مقابض. يصلب RNA مع مقابض. [مكان الجداول 4 و 5 هنا]
  7. تنقية عينة صلب. إضافة 3 مجلدات من الإيثانول من العينة صلب وتخلط جيدا. تخزين الخليط في -70 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل. تدور باستمرار على 15،800 XG وتجاهل طاف. تجفيف بيليه باستخدام مجفاد. حل بيليه في100 ميكرولتر ريبونوكلياز المياه مجانا. ملاحظة: عينة جاهزة لاستخدامها ويمكن تخزينها في -20 درجة مئوية.

2. معايرة وتشغيل ملاقط بصرية

  1. معايرة بكسل حجم شاشة فيديو
    1. استخدام فخ البصرية إلى اعتراض حبة مع قطر معروف (حجم قياسي).
    2. التقاط صور لحبة المحاصرين باستخدام برامج التصوير (الشكل 4).
    3. تحديد قطر حبة باستخدام برامج التصوير على أساس طريقة النقطه الوسطى.
    4. كرر هذا الإجراء لتحديد أقطار حبات من حجم مختلف.
    5. تناسب أقطار قياس ويعرف من الخرز من قبل الانحدار الخطي للحصول على الحجم الفعلي بكسل.
  2. تحقق من معايرة القطر
    1. استخدام فخ البصرية إلى اعتراض حبة.
    2. تحديد موقف بكسل النقطه الوسطى من خلال البرنامج التقاط الصور وتسجيل موقفها باستخدام Minitweezers.
    3. توجيه حبة لزراعية مختلفة استئجار المواقف وتكرار تحديد الموقف.
    4. تحويل مواقف X و Y من حبة من بكسل إلى m الوحدة باستخدام حجم بكسل معايرة.
    5. مقارنة X و Y بين المواقف تقاس الفيديو والتي Minitweezers. يجب مجموعتين من القيم نوافق على ذلك. ودقة وضوح الصورة هو> 0.1 ميكرون، حرك حبة أكثر من 1 ميكرون بين القياسات لضمان الدقة. إذا معايرة المسافة ليست مماثلة لتلك المخزنة في Minitweezers، إعادة ضبط الصك.
  3. فخ تصلب المعايرة
    1. التقاط حبة باستخدام فخ البصرية والاحتفاظ بها حتى الآن.
    2. تسجيل قوة في فخ باستخدام الحصول على البيانات بسرعة الالتفافية بمعدل> 5 كيلو هرتز لمدة 3 ثانية.
    3. توليد الطاقة من الطيف تسجيل حركة حبة باستخدام البرمجيات. تناسب الطيف السلطة إلى Lorentzian (الشكل 5) 38:
      542 / 51542eq1.jpg "العرض =" 200 "/> (المعادلة 1)
      حيث S (و) هي قوة في تواتر و، ج و هي تردد الزاوية، وS 0 هي قوة مقارب. تردد الزاوية، و ج، هو التردد حيث انخفضت قوة الحركة الحرارية لنصف قيمة مقارب. كما و ج يختلف مع قوة الليزر وحجم حبة، حبة المحاصرين معايرة كل على حدة.
    4. حساب ثابت الربيع من فخ، κ، من و ج:
      figure-protocol-1 (المعادلة 2)
      التي γ هو معامل السحب من حبة (المعادلة 3). استخدام ثابت الربيع لتحديد التغييرات امتداد لRNA من التغيير بالقوة.
  4. اختبار قانون ستوكس
    1. التقاط حبة باستخدام فخ البصرية. نقل حبة ذهابا والقوة بسرعة مختلفة.
    2. تسجيل حركة حبة وإجبار باستخدام Minitweezers.
    3. حساب نصف قطر حبة.
      ملاحظة: قوة الاحتكاك، F د، الناتجة عن حركة الجسيمات كروية في السوائل يمكن وصف بموجب القانون ستوكس:
      figure-protocol-2 (المعادلة 3)
      حيث r هي نصف قطر الكرة، والخامس هو السرعة، و h هو اللزوجة الديناميكية للسوائل، والتي يمكن العثور عليها في الجداول المرجعية. باستخدام القوة تقاس على أنها F د، نصف قطر حبة يمكن حسابها باستخدام المعادلة. 3 (الشكل 6)، وينبغي أن يتفق مع يحددها البرنامج الحصول على الصور. وستوكس اختبار اختبارات القانون بشكل فعال المعايرة الشاملة والأداء الصك.

3. Nanomanipulation من واحدة RNA الجزيئات

  1. جعل fluidics.
    1. حفر ستة ثقوب (2 مم لكل منهما) على الغطاء الزجاجي رقم 2 (الشكل 7A) وقطع ثلاثة الشقوق (2 ملم العرض) في الوجهين الشريط بوليميد (الشكل 7B) باستخدام الليزر.
    2. جعل غرفة التدفق بواسطة يقحم اثنين من الزجاج غطاء مع طبقتين من الوجهين الشريط KAPTON. إدراج micropipette واثنين من الأنابيب الالتفافية بين الشريط (الشكل 7C).
    3. جبل غرفة التدفق على إطار معدني عن طريق مطابقة الثقوب الموائعية (الشكل 7D).
    4. ربط قنوات الموائعية من الغرفة إلى 10 مل المحاقن مليئة عازلة الاختيار عن طريق شبكة أنابيب من البولي ايثيلين (الشكل 7E).
    5. جبل الغرفة بأكملها على ملاقط بصرية بين الهدفين. تأكد من أن الجانب الأمامي للغرفة مع قنوات الموائعية يواجه نحو اليمين. التراجع عن الهدف الحق والمكونات دبابيس نحاسية من الإطار (الشكل 7E) إلى تصاعد ثقوب على رانه الملقط. تشديد الخناق لتحديد موقف الغرفة.
  2. خلط العينة والخرز صلب. مزيج العينة صلب مع حبات المغلفة مكافحة digoxigenin (حفر الخرز)، والسماح للخليط للبقاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقيقة. عادة، يتم خلط 1 ميكرولتر من العينة صلب مع 5 ميكرولتر حفر حبات في 1 مل من العازلة. ملاحظة: كمية من الخرز ليتم تحميلها في غرفة تدفق ينبغي اختيار لضمان وجود كمية معقولة من الخرز ليتم تسليمها من الأنبوب تجاوز. نسبة من العينة صلب إلى الخرز لا يمكن قياسها كميا بسهولة. في الحالة المثالية، ومعظم حبات ليس لها RNA هذا أنه ليس هناك سوى جزء صغير من الخرز قد يكون جزيء RNA واحد فقط لكل حبة. كما العينات صلب وتعليق حبة يصعب قياسها كميا، وأفضل وسيلة فقط حاليا هو أن تختلف نسبة الخلط واختبار الخليط على ملاقط.
  3. تقديم حبات لموقع رد الفعل في غرفة التدفق (أي بضعة ميكرومتر على رأس ميلغيض cropipette، الشكل 7C).
    1. تحميل تعليق الخرز streptavidin المغلفة (بكتيريا الخرز) في حقنة 1 مل.
    2. ربط المحقنة إلى الأنبوب فلويديك المؤدية إلى قناة السفلى من غرفة التدفق (الشكل 7A).
    3. دفع الحقنة في التدفق على بكتيريا الخرز في الغرفة.
    4. نقل غرفة بأكملها باستخدام برامج التحكم في المحركات لوضع فخ الضوئية قرب افتتاح أنبوب التفافي السفلي (الشكل 7B). ثم تعمل في فخ البصرية من قبل كرة لالتقاط بكتيريا حبة.
    5. نقل حبة قريبة من غيض من micropipette باستخدام برنامج التحكم في المحركات.
    6. سحب حقنة متصلة micropipette لامتصاص حبة على micropipette.
    7. تطبيق تدفق برفق عن طريق الضغط على حقنة إلى القناة الوسطى لطرد إضافية بكتيريا الخرز.
    8. وبالمثل، تقديم مزيج من العينة والخرز حفر (راجع الخطوة 3.2) إلى القناة العليا من الغرفة.
    9. القبض على حفر حبة وجعله على مقربة من بكتيريا حبة باستخدام فخ البصرية.
    10. تنظيف القناة الوسطى من خلال تطبيق التدفق. ملاحظة: strep- وحفر الخرز يتم اختيار أن تكون أحجام مختلفة بحيث يمكن تمييزها بصريا تحت نظر المجهري (الشكل 4).
  4. الصيد "على جزيء واحد يربطون بين زوج من الخرز.
    1. وضع حفر حبة عموديا على أعلى من بكتيريا حبة (الشكل 4).
    2. نقل حفر حبة أسفل نحو بكتيريا حبة من توجيه الفخ. فتح نافذة مؤامرة القوة لمسافات على جهاز الكمبيوتر لتصور التغييرات القوة.
    3. بناء على اتصال من الخرز اثنين، حرك حفر حبة عموديا بعيدا عن بكتيريا حبة.
    4. إذا تم إجراء أي اتصال معين، تبقى قوة الصفر تقريبا. إذا كنت متصلا حبات اثنين من الجزيئات، ويزيد من قوة بشكل ملحوظ عندما فصل حبات اثنين. هذا الإجراء، ويشار إليها باسم "الصيد"، وغالبا ما يكون الأداء الإقتصادي الأداءormed عدة مرات على كل زوج من الخرز للعثور على حبل فعال واحدة جزيء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

محدودة من الفضاء، ويتجلى nanomanipulation من جزيئات الحمض النووي الريبي واحدة من خلال عرض أمثلة الميكانيكية الوحيدة التي تتكشف من دبابيس الشعر وRNA RNA مع هيكل العالي.

التلاعب الجزيئات واحدة دبوس الشعر

مرة واحدة يتم تأسيس حبل بين الخرز، وتمديد وقوة على حبل يمكن التلاعب بها باستخدام بروتوكول المعرفة من قبل المستخدم. وتستخدم أربعة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعديل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في إعداد العينات نتف الريش

اختيار الاستنساخ المتجهات. على الرغم من أن المخطط العام الموصوفة هنا (الشكل 3) لا يتطلب ناقلات الاستنساخ خاص، ويفضل متجه ليس لديهم T7 جوهري أو T3 المروج لسهولة النسخ بحيث المروج يمكن إدخالها عبر PCR في المواقف المطلوبة.

تسلسل والأطوال ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بمنحة NSF (MCB-1054449) وجائزة برنامج البحث التجريبي التعاوني متعدد التخصصات من معهد الحمض النووي الريبي في جامعة ألباني إلى PTXL.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Minitweezersستيفن ب. سميث الهندسةhttp://tweezerslab.unipr.it< / a>
بطاقة الحصول على البياناتالوطنية الأدواتUSB-6351
بطاقة الفيديوالوطنية للأدواتPCI-1407
برنامج برمجة Labviewالأدوات
NI Vision BuilderNational Instruments
آلة النقش بالليزرأنظمة الليزرZing-16
PCR طقم تنقيةQiagen28104
MEGAscript T7 kitLife TechnologiesAM1334
MEGAclearLife TechnologiesAM1908
Biotin-11-UTPThermo FisherFERR0081
T4 DNA polymeraseNew England LabsM0203
Streptavidin المغلفة المجهريةSpherotechSVP-20-5
المجهر المطلي بمضادات الديجوكسيجينينSpherotechDIGP-20-2
حجم المجهرية القياسيةSpherotechPPS-6K
شريط كابتونKaptontape.comKPPTDE-1
رقم 2 غطاء زجاجيThermo Fisher12-543D
الوطنية مجموعة

المراجع

  1. Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4853-4860 (1997).
  2. Maier, B. Using laser tweezers to measure twitching motility in Neisseria. Current opinion in microbiology. 8, 344-349 (2005).
  3. Wang, S., Arellano-Santoyo, H., Combs, P. A., Shaevitz, J. W. Measuring the bending stiffness of bacterial cells using an optical trap. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
  4. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. 271, Science. New York, N.Y. 795-799 (1996).
  5. Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. 271, Science. New York, N.Y. 1835-1837 (1996).
  6. Bryant, Z., et al. Structural transitions and elasticity from torque measurements on DNA. Nature. 424, 338-341 (2003).
  7. Liphardt, J., Onoa, B., Smith, S. B., Tinoco, I., J,, Bustamante, C. Reversible unfolding of single RNA molecules by mechanical force. 292, Science. New York, N.Y. 733-737 (2001).
  8. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA unfolds and refolds. Annu Rev Biochem. 77 (27), 21-24 (2008).
  9. Woodside, M. T., Garcia-Garcia, C., Block, S. M. Folding and unfolding single RNA molecules under tension. Current opinion in chemical biology. 12, 640-646 (2008).
  10. Cecconi, C., Shank, E. A., Bustamante, C., Marqusee, S. Direct observation of the three-state folding of a single protein molecule. 309, Science. New York, N.Y. 2057-2060 (2005).
  11. Shank, E. A., Cecconi, C., Dill, J. W., Marqusee, S., Bustamante, C. The folding cooperativity of a protein is controlled by its chain topology. Nature. 465, 637-640 (2010).
  12. Morin, J. A., et al. Active DNA unwinding dynamics during processive DNA replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 8115-8120 (2012).
  13. Larson, M. H., Landick, R., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase one singular sensation every little step it takes. Molecular cell. 41, 249-262 (2011).
  14. Wen, J. D., et al. Following translation by single ribosomes one codon at a time. Nature. 452, 598-603 (2008).
  15. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
  16. Pease, P. J., et al. Sequence-directed DNA translocation by purified FtsK. 307, Science. New York, N.Y. 586-590 (2005).
  17. Dumont, S., et al. RNA translocation and unwinding mechanism of HCV NS3 helicase and its coordination by ATP. Nature. 439, 105-108 (2006).
  18. Greenleaf, W. J., Woodside, M. T., Block, S. M. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 36, 171-190 (2007).
  19. Serganov, A., Nudler, E. A decade of riboswitches. Cell. 152, 17-24 (2013).
  20. Breaker, R. R. Prospects for riboswitch discovery and analysis. Molecular cell. 43, 867-879 (2011).
  21. Wan, Y., et al. Genome-wide measurement of RNA folding energies. Molecular cell. 48, 169-181 (1016).
  22. Dalgarno, P. A., et al. Single-molecule chemical denaturation of riboswitches. Nucleic acids research. 41, 4253-4265 (2013).
  23. Wood, S., Ferre-D'Amare, A. R., Rueda, D. Allosteric tertiary interactions preorganize the c-di-GMP riboswitch and accelerate ligand binding. ACS chemical biology. 7, 920-927 (2012).
  24. Brenner, M. D., Scanlan, M. S., Nahas, M. K., Ha, T., Silverman, S. K. Multivector fluorescence analysis of the xpt guanine riboswitch aptamer domain and the conformational role of guanine. Biochemistry. 49, 1596-1605 (2010).
  25. Greenleaf, W. J., Frieda, K. L., Foster, D. A., Woodside, M. T., Block, S. M. Direct observation of hierarchical folding in single riboswitch aptamers. 319, Science. New York, N.Y. 630-633 (2008).
  26. Frieda, K. L., Block, S. M. Direct observation of cotranscriptional folding in an adenine riboswitch. 338, Science. New York, N.Y. 397-400 (2012).
  27. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39, 7677-7687 (2011).
  28. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Unusual Mechanical Stability of A Minimal RNA Kissing Complex. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15847-15852 (2006).
  29. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Real-time control of the energy landscape by force directs the folding of RNA molecules. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 7039-7044 (2007).
  30. Tinoco Jr, I., Li, P. T. X., Bustamante, C. Determination of ther modynamics and kinetics of RNA reactions by force. Q Rev Biophys. 39, 325-360 (2006).
  31. Onoa, B., et al. Identifying kinetic barriers to mechanical unfolding of the T thermophila ribozyme. 299, Science. New York, NY. 1892-1895 (2003).
  32. Li, P. T., Tinoco Jr, I. Mechanical unfolding of two DIS RNA kissing complexes from HIV-1. J Mol Biol. 386, 1343-1356 (2009).
  33. Smith, S., Cui, Y., Bustamante, C. Optical-trap force transducer that operates by direct measurement of light momentum. Methods Enzymol. 361, 134-162 (2003).
  34. Stephenson, W., et al. The essential role of stacking adenines in a two-base-pair RNA kissing complex. J Am Chem Soc. 135, 5602-5611 (2013).
  35. Kaiser, C. M., Goldman, D. H., Chodera, J. D., Tinoco Jr, I., Bustamante, C. The ribosome modulates nascent protein folding. 334, Science. New York, NY. 1723-1727 (2011).
  36. Bizarro, C. V., Alemany, A., Ritort, F. Non-specific binding of Na+ and Mg2+ to RNA determined by force spectroscopy methods. Nucleic acids research. 40, 6922-6935 (2012).
  37. Bosaeus, N., et al. Tension induces a base-paired overstretched DNA conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15179-15184 (2012).
  38. Berg-Sørensen, K., Power Flyvbjerg, H. spectrum analysis for optical tweezers. Rev Sci Instrum. 75, 594-612 (2004).
  39. Stephenson, W., et al. Combining temperature and force to study folding of an RNA hairpin. Phys Chem Chem Phys. 16, 906-917 (2014).
  40. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys J. 72, 1541-1555 (1997).
  41. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic rates and activation free energies from single-molecule pulling experiments. Phys Rev Lett. 96, 108101(2006).
  42. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proc. Natl Acad Sci USA. 105, 15755-15760 (2008).
  43. Li, P. T. X., Collin, D., Smith, S. B., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Probing the Mechanical Folding Kinetics of TAR RNA by Hopping, Force-Jump and Force-Ramp Methods. Biophys J. 90, 250-260 (2006).
  44. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical journal. 103, 1490-1499 (2012).
  45. Li, P. T. X. Analysis of Diffuse K+ and Mg2+ Ion Binding to a Two-Base-Pair Kissing Complex by Single-Molecule Mechanical Unfolding. Biochemistry. 52, 4991-5001 (2013).
  46. Wen, J. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophys J. 92, 2996-3009 (2007).
  47. Manosas, M., et al. Force Unfolding Kinetics of RNA using Optical Tweezers II. Modeling Experiments Biophys J. 92, 3010-3021 (2007).
  48. Vilfan, I. D., et al. An RNA toolbox for single-molecule force spectroscopy studies. Nucleic acids research. 35, 6625-6639 (2007).
  49. Li, P. T. X. Formation of a metastable intramolecular RNA kissing complex by nanomanipulation. Soft Matter. 9, 3246-3254 (2013).
  50. Chen, G., Chang, K. Y., Chou, M. Y., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Triplex structures in an RNA pseudoknot enhance mechanical stability and increase efficiency of -1 ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 12706-12711 (2009).
  51. Chen, G., Wen, J. D., Tinoco Jr, I. Single-molecule mechanical unfolding and folding of a pseudoknot in human telomerase RNA. 13, RNA. New York, N.Y. 2175-2188 (2007).
  52. Tinoco, I., Chen, G., Qu, X. RNA reactions one molecule at a time. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2, a003624(2010).
  53. Dudko, O. K., Graham, T. G., Best, R. B. Locating the barrier for folding of single molecules under an external force. Physical review letters. , 107-208301 (2011).
  54. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, 101-108 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

طي الحمض النووي الريبوزيجزيء واحدتمديد القوةدبوس شعر الحمض النووي الريبوزيربط الخرزاتغرفة التدفقالطي الميكانيكيالبنية الثالثية
Nanomanipulation من واحدة RNA الجزيئات بواسطة الملقط البصرية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.