يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التحليل الآلي من ديناميك كا

16.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51560

⸱

يونيو 16, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Department of Physiology, University of South Alabama

في هذه المقالة

ملخص

هنا يتجلى منطقة جديدة من بروتوكول تحليل الفائدة على أساس الفرز الحذف أفضل تناسب المخصصة لمناطق إشارة إيجابية خلال فترة زمنية ثنائي الأبعاد تسلسلات الصور الفاصل. هذه الخوارزمية قد تمكن المحققون على تحليل شامل الفسيولوجية كا 2 + إشارات مع الحد الأدنى من إدخال المستخدم والتحيز.

الملخص

يتم دراسة الخلايا كا 2 + إشارات عادة مع الأصباغ الفلورية كا 2 + المؤشر وتقنيات الفحص المجهري. ومع ذلك، والتحليل الكمي من كا 2 + بيانات التصوير هو مضيعة للوقت وتخضع للانحياز. وقد تم تنفيذ الآلية خوارزميات تحليل الإشارات يعتمد على المنطقة ذات الاهتمام (ROI) الكشف عن قياسات سطر واحد الابعاد المسح الضوئي، ولكن ليس هناك خوارزمية الحالي الذي يجمع بين تحديد الأمثل وتحليل رويس في تسلسلات الصور ثنائية الأبعاد. هنا يتم وصف خوارزمية لسرعة اقتناء وتحليل رويس في تسلسلات الصور. فإنه يستخدم الحذف يصلح لإشارات الضجيج تصفيتها من أجل تحديد العائد على الاستثمار الأمثل التنسيب، ويحسب كا 2 + المعلمات إشارة من السعة والمدة وانتشار المكاني. تم تنفيذ هذه الخوارزمية باعتباره المساعد متاحة بحرية لليماغيج (NIH) والبرمجيات. جنبا إلى جنب مع البرامج النصية تحليل مكتوب لمفتوحة المصدر برامج معالجة الإحصائية R،ويوفر هذا النهج خط أنابيب ذات قدرة عالية لأداء التحليل الإحصائي السريع للناتج التجريبية. كما يقترح الباحثون أن استخدام هذا البروتوكول التحليل سوف يؤدي إلى توصيف أكثر اكتمالا وغير منحازة من الفسيولوجية كا 2 + إشارات.

المقدمة

كا 2 + هو رسول الثاني في كل مكان مما يشير جزيء وعصاري خلوي كا 2 + وينظم مستويات عالية. الكالسيوم داخل الخلايا 2 + إشارات معقدة وتشمل العابرين معزولة، التذبذبات، ونشر موجات 1-4. ويعتقد أن السيطرة المكانية والزمانية من كا 2 + لخصوصية تكمن وراء الفسيولوجية إشارة، وبالتالي فإن تحليل كا 2 + أنماط إشارة هو من مصلحة كبيرة للمحققين في حقول متعددة 5.

الأصباغ كا 2 + المؤشر مثل فلوو-4-2 FURA وتستخدم عادة لقياس الكالسيوم داخل الخلايا 2 + إشارات مع مضان المجهري 5-12. عادة، يتم تقييم الزمانية كا 2 + إشارات عن التغيرات التي تعتمد على الوقت في متوسط ​​مضان داخل منطقة المعرفة من قبل المستخدم، أو المنطقة ذات الاهتمام (ROI) 5،6،13 - 16. حاليا، وتحليل العائد على الاستثمار دليل على حد سواء مضيعة للوقت والعمل فيتوتري لأنه يتطلب من المستخدمين لتحديد العديد من رويس وأداء العمليات الحسابية المتكررة 17-19. قد تكون هذه التقنيات أيضا عرضة للخطأ المستخدم كبيرة، بما في ذلك إدخال وسائط إشارة مصطنعة والاستبعاد من انخفاض السعة أو إشارات منتشر 18،20.

وقد سبق أن نفذت خوارزميات الكشف الآلي العائد على الاستثمار باستخدام مجموعة متنوعة من النهج الإحصائية لتحديد العائد على الاستثمار الأمثل التنسيب، لكنها عموما اقتصرت على تحليل مسح سطر أو الزائفة خط مسح الصور، مما يحد من التحليل إلى البعد المكاني واحدة في الوقت المناسب 17، 19-22. بالإضافة إلى ذلك، العديد من الخوارزميات الموجودة ليست كافية لتشمل تنوع كا 2 + الأحداث الإفراج التي تتراوح من الدوري، العابرين المترجمة إلى نشر موجات 23،24. وغالبا ما تتعقد تقييم شامل للالفسيولوجية كا 2 + إشارات إضافية من خلال وجود صورة كبيرة artifالتصرف الذي يفند إشارة إلى التمييز الضوضاء في كثير من النظم التجريبية.

سابقا، للكشف عن العائد على الاستثمار خوارزمية الحل الآلي لكا 2 + إشارة الكشف عابرة، كما تنفذ البرنامج المساعد لبرنامج NIH يماغيج (المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا، MD)، تم تطويره والتحقق من صحتها 25،26. وقد تم تصميم هذه الخوارزمية، ودعا LC_Pro، لتحديد وتحليل رويس يشمل كا 2 + العابرين في إشارة ثنائية الأبعاد الوقت الفاصل بين متواليات الصورة. هنا يتم توفير بروتوكول التجريبية العملية ومظاهرة ممثل تطبيق الخوارزمية في الخنازير الشريان التاجي البطانة، مع تحليل نتائج إضافية باستخدام مفتوحة المصدر برامج معالجة الإحصائية R لتوليد الناتج رسومية قابلة للاستخدام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تشريح السفن والتصوير

  1. الحصاد الأنسجة من الخنازير الأحداث المحلية كما هو موضح في مارتنز وآخرون 27. وضع تحصد البطينين الأيمن الخنازير في polydimethylsiloxane (PDMS) طبق تشريح الجزء السفلي تحتوي على HEPES مخزنة محلول ملحي الفسيولوجية (PSS).
    1. مع المعونة من stereomicroscope، تشريح وإزالة جزء من الأمامي الأيسر النازل الشريان التاجي (~ 8 مم طول، و 0.5 مم) من الأنسجة المحيطة باستخدام ملقط ومقص الربيع عن طريق إزالة جزء من السفينة المحيطة طبقات أنسجة القلب. ملاحظة: الحرص على عدم ثقب جدار الوعاء الدموي.
    2. وضع كتلة PDMS (1 × 0.5 × 0.5 سم) في طبق تشريح، واستخدام إبرة ليعلقون عليه إلى أسفل. قطع قطرها سلك التنغستن حوالي 40 ميكرون الى اثني عشر قطاعات ~ 0.3 سم طول، وتشكيل micropins، ووضع هذه في الطبق. باستخدام ملقط، وتأمين واحدة من نهاية الجزء السفينة إلى كتلة مع micropiن.
    3. إدراج بعناية مقص الربيع صغير في تجويف السفينة، وقطع طولي أسفل جانب واحد من السفينة لفتحه تماما. توجيه جزء السفينة فتحت مع البطانة المباراة.
    4. استخدام micropins المتبقية لتأمين حدود قطاع سفينة فتح لمنع مثل هذه أن السفينة تشكل مستطيل مسطح. ملاحظة: يجب أن تكون عازمة قمم Micropin إلى 90 درجة وإدراجها حتى الاحمرار مع سطح الكتلة. ينبغي توخي الحذر لتمتد إعداد السفينة دون إرهاق؛ عرض النهائي ينبغي ~ 1.5X عرض المتمدد البدء.
    5. إعداد وحدة تخزين صغيرة (~ 1 مل) من فلوو-4 الحل AM التحميل عن طريق خلط فلوو-4 AM (10 ميكرومتر) الذائبة في DMSO مع بلورونيك (0.03٪) في HEPES مخزنة PSS (تحتوي في ملي: 134 كلوريد الصوديوم، 6 بوكل ، 1 MgCl، 10 HEPES، 10 الجلوكوز)، وإدراج كتلة بأكملها في حل التحميل لحوالي 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    6. بعد التحميل، وغسل كتلة في HEPES مخزنةPSS لمدة 5-10 دقيقة.
    7. جبل كتلة 50-100 ميكرون على الفواصل سميكة في غرفة أسفل ساترة تحتوي على HEPES مخزنة PSS. ملاحظة: دبابيس معدنية يمكن أن تستخدم الفواصل وضمان تواجه قطاع السفينة إلى أسفل وعدم لمس الفواصل.
    8. وضع الغرفة على مرحلة مجهر مقلوب مجهزة للتصوير متحد البؤر، والتركيز على طبقة الخلايا البطانية.
    9. تسلسل التقاط صورة مرور الوقت مضان النسبي القاعدية ل~ 3 دقائق في 20X التكبير ومعدل الإطار ل~ 8 إطارات في الثانية باستخدام صورة متحد البؤر البرمجيات aquisition التسلسل.
    10. بعد ~ 3 دقائق من تسجيل مضان القاعدية، استبدال HEPES مخزنة حل PSS مع نفس الحجم (~ 1 مل) من مادة P (100 م) المذاب في HEPES مخزنة جهاز الأمن الوقائي، وسجل لالإضافيون 3 دقائق.

2. التحليل الآلي

  1. تقديم تسلسل الصور (ق) من النشاط الكالسيوم الفلورسنت من برنامج الحصول متحد البؤر إلى 8 بت، زrayscale '. TIF' شكل ملفات مع عدم وجود المعلومات على نطاق و.
  2. يماغيج مفتوحة، انقر فوق 'فتح' في القائمة ملف، وحدد تسلسل الصور المناسبة في نافذة المستكشف لعرض تسلسل الصور (ق) في ImageJ.
  3. تحديد العائد على الاستثمار يبلغ قطرها المناسب باستخدام أداة مستطيلة العائد على الاستثمار لتقدير حدود العلوي والسفلي من انتشار المكاني للنشاط ضمن تسلسل الصور (ق). ملاحظة: قطر مستطيل متوسط ​​هو اختيار مناسب لقطر العائد على الاستثمار.
  4. إنشاء مجلد جديد على القرص الصلب لجهاز الكمبيوتر، وإضافة تسلسل الصور (ق) إلى الدليل المجلد.
  5. في ImageJ، انقر فوق نافذة 'الإضافات'، ثم انقر 'LC_Pro' لبدء التحليل.
  6. أدخل القيمة قطر العائد على الاستثمار وتحديد قيمة العتبة تصفية (إما 0.05 أو 0.01).
  7. انقر على 'العلاج من تعاطي المخدرات' مربع الاختيار وأدخل القيم نقطة زمنية على الفور قبل وبعد وأضيف المخدرات (بالثواني).
  8. انقر 'موافق'، وأدخل الدليل تسلسل الصور في إطار ملف اكسبلورر.

3. إخراج الرسومية

  1. تحميل النسخة 3.0.2 من R http://www.r-project.org/ .
  2. فتح إصدار 32 بت من ر.
  3. انقر على زر "ملف"، ثم "النصي فتح 'وحدد' traceplot.R 'R النصي لتوليد التقارير الرسومية التجريبية.
  4. تثبيت معايرة، وgplots الحزم عن طريق تحديد "حزم"، "تثبيت حزم"، واختيار حزم appropirate.
  5. انقر 'ملف'، ثم 'تغيير الدليل' الأوامر، واستخدام نافذة المستكشف لتحديد الدليل الذي يتوافق مع الإخراج تحليل LC_Pro.
  6. انقر على إطار البرنامج النصي ثم 'تشغيل جميع' الأوامر لتشغيل البرنامج النصي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

خوارزمية مخصصة، LC_Pro، تم وضعها وتنفيذها من أجل إجراء تحليل الآلي للكا 2 + ديناميات على تسلسلات الصور متحد البؤر. كما هو مبين في الشكل 1، ويستخدم خوارزمية وحدات معالجة متتابعة أن A) كشف وتعقب المواقع الديناميكية كا 2 + تغيير أعلاه إحصائية (ع <0.01) الضوضاء، B) تحديد المناطق ذات الاهتمام (ROI) تلقائيا في مراكز موقع نشط، و C) حساب متوسط ​​كثافة مضان في رويس لتحديد المعلمات حدث معين. يتم عرض لمحة رسومية من الخوارزمية باستخدام الكمبيوتر ولدت ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

سوف فك معقدة كا 2 + إشارات على المستوى الخلوي وتتطلب نهجا متعددة الخلايا التجريبية والتحليلية الصارمة. هنا، يوصف هذا النهج في الوقت الذي تتعرض حل تسلسلات الصور متحد البؤر كا 2 + مضان تعتمد على تحليل الآلية التي تحدد والكمي كا 2 + إشارات ذات الصلة إحصائيا في مجالات الخلوية سليمة وفي حالة محددة قدمت، وكان الجزء الشريان معزولة من قلب خنزير، يشبك فتح لفضح البطانة، محملة كا 2 + المؤشر فلوو-4 صباحا، تعرض للمتحد البؤر التصوير، وتقييمها مع خوارز...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح HL-085887، HL-092992، S10RR027535، وMOP-93676.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق تشريحFisher Sci# 08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS) FisherSci#NC9644388مجموعة المطاط الصناعي ، يجب أن تكون مصبوبة في أطباق
PSSSigma#H3375-250Gحمض HEPES
مجهر مجسمنيكون Inst.#MNA42000
ملقطأدوات العلومالدقيقة # 11223-20
مقص الربيعأدوات العلومالدقيقة 15003-08
سلك التنغستنScientific Inst Svcs# 406
Fluo-4 AMLife Tech.#F-14201
بلورونيك F-127Life Tech.#P3000MP
دبابيس معدنيةأدوات العلومالدقيقة # 26002-10
زجاجي غرفةخصيصا
مجهر ثنائي البؤر قرص الغزلPerkin ElmerRS-3
ImageJ التنزيل على: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html< / أ>
LC_Pro البرنامج المساعد ل imageJ<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html">تنزيل على: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R softwareتنزيل على: http://www.r-project.org/
R traceplot scriptتنزيل على: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing
غطاء سفلية مصممة برنامج

المراجع

  1. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
  2. Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  3. Delisle, S. The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes. Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).
  4. Dupont, G., et al. Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level. Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).
  5. Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).
  6. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, (2009).
  7. Hong, J. H., et al. Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes. PloS One. 5 (3), (2010).
  8. Kuga, N., et al. Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo. J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).
  9. Mumtaz, S., et al. The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries. Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).
  10. Paredes, R. M., et al. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  11. Silei, V., et al. Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green. Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).
  12. Simpson, A. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations. Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).
  13. Gaspers, L. D., Thomas, A. P. Calcium signaling in liver. Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).
  14. Hellman, B., et al. Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells. Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).
  15. Kansui, Y., et al. Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries. Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).
  16. Tatsumi, H., et al. Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2. Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).
  17. Lorenz, J. J., et al. Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images. J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).
  18. Mukamel, E. A., et al. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
  19. Reidl, J., et al. Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains. Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).
  20. Wegner, F., et al. Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform. Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).
  21. Cheng, H., et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method. Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).
  22. Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).
  23. Abramoff, M. D., et al. Image processing with ImageJ. Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).
  24. Francis, M., et al. Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).
  25. Qian, X., et al. Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).
  26. Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).
  27. Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ImageJ R P
التحليل الآلي من ديناميك كا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.