وأفادت التقارير التوليف وتصنيع الألياف electrospun طويلة تمتد منطقة الإيداع عبر أكبر جامع المصممة حديثا من بوليمر القابلة للتحلل الرواية المسماة بولي (الجلسرين-dodecanoate) (PGD). كانت قادرة على دعم نمو الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية المحفزة الماوس الألياف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Electrospun الليفية سقالات بولي (الجلسرين-dodecanedioate) للهندسة الأنسجة العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لتطبيقات هندسة الأنسجة، وإعداد السقالات القابلة للتحلل حيويا وهي المهمة الأكثر مرغوب فيه ولكنها صعبة. بين مختلف أساليب التصنيع، electrospinning هو الأكثر جاذبية واحد نظرا لبساطته والتنوع. بالإضافة إلى ذلك، ألياف النانو electrospun تحاكي حجم المصفوفة خارج الخلية الطبيعية وضمان المزيد من الدعم لبقاء الخلية والنمو. وأظهرت هذه الدراسة جدوى تصنيع ألياف طويلة تمتد منطقة إيداع أكبر للبوليمر القابلة للتحلل حيويا والرواية المسماة بولي (الجلسرين-dodecanoate) (PGD) 1 باستخدام جامع المصممة حديثا لelectrospinning. PGD يسلك خصائص المرونة فريدة من نوعها مع الخصائص الميكانيكية مماثلة لأنسجة العصب، وبالتالي فهي مناسبة لتطبيقات هندسة الأنسجة العصبية. وكان التوليف والتلفيق انشاء لصنع مواد ليفية سقالات بسيطة، تكرار للغاية، وغير مكلفة. في توافق مع الحياةالاختبار، ويمكن أن الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية التمسك وتنمو على الألياف PGD electrospun. باختصار، قدمت هذا البروتوكول أسلوب تلفيق تنوعا لصنع الألياف electrospun PGD لدعم نمو الماوس الخلايا الجذعية الجنينية المستمدة الخلايا العصبية النسب.
المقدمة
Electrospinning هي واحدة من طرق المعالجة الفعالة لإنتاج السقالات الألياف الدقيقة لحجم نانومتر. المبدأ الأساسي للelectrospinning ينطوي على مخروط تايلور من الحل الذي يقام في فتحة إبرة من خلال تطبيق الجهد العالي بين رأس الإبرة وجامع الارض. عندما التنافر الكهربائي في حل يتغلب على التوتر السطحي، يتم إخراج طائرة السائل مشحونة من طرف الإبرة، ينتقل عن طريق الهواء مع تبخر المذيبات، ويترسب في النهاية على جامع على الارض. يوفر ضخ حقنة تدفق مستمر من محلول الناشئة من مغزال ويمكن أن تكون ملفقة نسخ بالتالي متعددة من ألياف electrospun في غضون فترة قصيرة من الزمن. أثناء مغادرة مغزال للوصول إلى جامع، فإن طائرة اتهم الخضوع لتمتد والجلد وفقا لعدد من المعايير التي تشمل اللزوجة والتوتر السطحي من الحل البوليمرية، وelectrostatiج القوة في الحل، والتفاعل بين المجال الكهربائي الخارجي، الخ 2.
في عملية electrospinning، يقدم أحد هواة جمع باعتبارها الركيزة موصل حيث يمكن أن تودع الألياف الدقيقة لنانومتر. في هذه الدراسة، تم تصميم نوع جديد من الألياف جامع للحصول على حصائر الألياف مع الحجم المطلوب (الطول × العرض). تقليديا، يتم استخدام رقائق الألومنيوم وجامع ولكن من الصعب نقل الألياف من سطح مستو لالركيزة أخرى. كانت صعوبة حصاد الألياف حصيرة سليمة من أحد هواة جمع التقليدية ويرجع ذلك أساسا إلى حقيقة أن الألياف electrospun إرفاق بقوة على سطح جامع. ولذلك، فإننا تعديل جامع من قبل للطي قطعة من رقائق الألومنيوم في شريط مستطيل وإرفاقها عمودي على لوحة معدنية مسطحة. وامتدت الألياف electrospun عبر المنطقة الواقعة بين غيض من الشريط وصفيحة معدنية، والتي يمكن نقلها بسهولة إلى substrat أخرىه.
الفائدة في البوليمرات المرنة crosslinked حراريا ينمو بسرعة بسبب العمل الرائد لمجموعة روبرت لانغر، الذي قدم بولي (الجلسرين sebacate) (PGS)، والبوليستر والتي هي مماثلة لمطاط مبركن في عام 2002 3. مماثلة لPGS، وقد وضعنا بنجاح بولي (الجلسرين-dodecanoate) (PGD) من خلال التكثيف الحراري من الجلسرين وحمض dodecanedioic وأظهرت فريدة الذاكرة شكل ممتلكاتها 1. خلافا لصلابة المواد الاصطناعية بولي (الهيدروكسيل بوتيرات) أو بولي (L-lactide) (معاملات الرجوعية يونغ من 250 ميجا باسكال و 660 ميجا باسكال، على التوالي)، PGD يسلك الملكية المرنة مثل المطاط، مع معامل يونج (أ) من 1.08 ميجا باسكال عندما تكون درجة الحرارة فوق 37 درجة C، وهي المباراة على مقربة من الأعصاب الطرفية في الموقع (0.45 ميجا باسكال). بالإضافة إلى ذلك، PGD هو القابلة للتحلل وتدهور الوقت يمكن صقلها من خلال تغيير نسبة الجلسرين وحمض dodecanedioic. حمض Dodecanedioic هو دون الاثني عشر الكربونموقف مع مجموعتين الكربوكسيلية المحطة، HOOC (CH 2) 10 COOH. الأحماض ثنائي الكربوكسيل الزوجية مثل حمض سيباسيك وحمض dodecanedioic يمكن استقلابه إلى أسيتيل التميم وأدخل حمض الكربوكسيليك (TCA) / (حمض الستريك) دورة. المنتج التمثيل الغذائي للأحماض ثنائي الكربوكسيل، succinyl، لجنة الزراعة، هو السلائف gluconeogenetic والمتوسطة دورة TCA 4. وبالتالي، اقترحت بعض الدراسات أنه يمكن استخدامها بوصفها الركيزة الوقود البديلة للتغذية المعوية وبالحقن، وخاصة في الحالات المرضية. بالإضافة إلى ذلك، PGD يسلك الذاكرة شكل فريد لأن درجة حرارة التحول الزجاجي لها هو 31 درجة مئوية، وبالتالي فإنه يظهر الخواص الميكانيكية متميزة في درجة حرارة الغرفة وبدرجة حرارة الجسم. في خلاصة القول، PGD هو القابلة للتحلل، حيويا، واظهار خصائص المرونة فريدة من نوعها مع الخصائص الميكانيكية مماثلة لأنسجة العصب؛ وبالتالي، فإنه هو مادة مناسبة للتطبيقات هندسة الأنسجة العصبية. في هذا البروتوكول، وelectrospunملفقة ألياف طويلة تمتد منطقة ديعة كبيرة عن طريق جمع المصممة حديثا من PGD. يمكن السقالات الألياف دعم نمو الخلايا الجذعية المحفزة الماوس والتمايز.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد Electrospinning جامع
- قطع رقائق الألومنيوم في قطعة مستطيلة.
- طي قطعة مستطيلة في شريط مستطيل، ونعلق عليه عمودي على لوحة معدنية مسطحة مع الشريط (الشكل 1). ملاحظة: حجم حصيرة الألياف يعتمد على طول وعرض قطاع غزة. وبالتالي، فإن أبعاد الشريط يمكن تعديلها حسب الحاجة.
2. إعداد البوليمر الحل
- خلط الجلسرين وحمض dodecanedioic (DDA) في نسبة 1:1 المولي في كوب على 120 درجة مئوية لمدة 100 ساعة للحصول على PGD البوليمر.
- حل بولي (أكسيد الإيثيلين) (PEO) والجيلاتين في 65٪ من الإيثانول مع نسبة وزن 1.5:3:95.5 في أنبوب 15 مل، وتشديد سقف وتسخين الخليط في الفرن على 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع التحريك حتى يصبح الحل متجانسة (حل بصل).
- لelectrospinning، مزيج البوليمر PGD والحل القاعدية في 04:06 نسبة الوزن. ملاحظة: تركيز PGD لديه ثنائيةز تأثير على قطر الألياف. 30٪ -50٪ في المئة PGD هو مقبول لإنتاج ألياف أطول من 5 سم مع زيادة أقطار الألياف.
- إضافة 0.1٪ الريبوفلافين إلى حل البوليمر وتخلط جيدا.
3. Electrospinning
- تغذية حل البوليمر إلى 5 مل حقنة القياسية مع 18 G قلل المقاوم للصدأ إبرة الصلب.
- إدراج حقنة في ضخ حقنة.
- إرفاق الرصاص على الارض من مصدر الطاقة العالية الجهد لوحة معدنية والرصاص موجبة الشحنة إلى الإبرة.
- ضبط المسافة بين الإبرة واحباط قطاع الألمنيوم إلى 15 سم.
- وضع مضخة الحقنة في زاوية من حوالي 15 درجة مع الأفقي لمنع تجميع الألياف في الجزء الأمامي من قطاع غزة.
- بدوره على ضخ حقنة وضبط معدل تدفق المضخة إلى 0.6 مل / ساعة.
- بدوره على مصدر الطاقة عالية الجهد وضبط الجهد التشغيل إلى 14.6 كيلو فولت.
4.تجهيز الألياف
- بعد اكتمال جمع، فضح حصيرة الألياف للأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 دقيقة لعبر ربط.
- نقل حصيرة الألياف من رقائق الألومنيوم الشريط إلى 100 ملم طبق بيتري، وتعريضها لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة أخرى للتعقيم.
- في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، وقطع حصيرة الألياف إلى قطع مستديرة من نفس الحجم مع شفرة جراحية ووضع قطع في 24 لوحة جيدا.
- لخلية العلاج قبل البذر، تزج عينات الألياف في 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- في اليوم التالي، نضح PBS بعناية، إضافة 1 مل من التمايز المتوسطة (DMEM/F12، N2، وFGF2) (انظر الوصفة في الجدول مواد) إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعة.
- نضح بعناية التمايز المتوسطة، إضافة 0.2 مل من matrigel إلى كل عينة الألياف واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: يمكن أيضا أن تستخدم لLaminin الألياف الطلاء. إضافة 0.2 مل من 20 ميكروغرام / مل lamininإلى الألياف ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعة.
- إزالة بعناية matrigel الزائدة من كل بئر. شطف مع 2 مل من التمايز المتوسطة مرة واحدة. ملاحظة: عينات الألياف مستعدون للثقافة الخلية.
5. البذر خلية على ألياف
- إضافة 1 مل من Accutase إلى الخلية صحن الثقافة زارة التربية والعلم واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- بعد 10 دقيقة، يتم فصل الخلايا زارة التربية والعلم من الطبق الثقافة. إضافة 4 مل من التمايز المتوسطة إلى اللوحة. جمع الخلايا زارة التربية والعلم العائمة في أنبوب 15 مل وخلايا ماصة صعودا وهبوطا لكسر المستعمرات (حوالي 15X).
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق واعادة تعليق الخلايا في 4 مل من التمايز المتوسطة.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. نقل 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب 15 مل وتمييع 10X مع تمايز المتوسطة. نقل 15 ميكرولتر من تعليق خلية المخفف إلى غرفة على عدادة الكريات مع غطاء للانزلاق في المكان. عدالخلايا في ساحة المركز 1 مم والساحات الزاوية أربعة من عدادة الكريات تحت المجهر. ملاحظة: خلية لكل مل = متوسط عدد س لكل متر مربع عامل التخفيف × 10 4
- وضع ما يقرب من 5 × 10 4 خلايا زارة التربية والعلم على كل بئر. إسقاط ببطء تعليق الخلية إلى منتصف عينات من الألياف، بدلا من انزلاق إلى جانب البئر، لمنع الحل من استنزاف قبالة حصيرة الألياف.
- إضافة 1 مل من التمايز المتوسطة إلى كل بئر، والحفاظ على لوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 مرفق للسماح للخلايا والنمو والتمايز.
- نضح المتوسطة القديمة من كل بئر واستبدالها مع 1 مل من المتوسط التمايز جديدة كل يوم.
6. بقاء الخلية
- نضح المتوسطة القديمة من كل بئر.
- مزيج حجم ال 1/10 من ريسازورين مضان كاشف مع مستنبت وإضافة 1 مل إلى كل بئر.
- Incubيأكلون في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 4 ساعة، محمية من الضوء المباشر.
- بعد 4 ساعات، ونقل 100 ميكرولتر من كاشف 3X من كل بئر إلى 96 لوحة جيدا، ثم العينات جاهزة للقياس على معمل مضان باستخدام إعدادات التصفية 560EX nm/590EM.
7. في الوقت الحقيقي PCR
- بعد 14 يوما من الثقافة، إضافة تحلل العازلة للعينات وعزل الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا على عينات من الألياف.
- استخدام 4 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي مجموع لتجميع كدنا] في 20 ميكرولتر جداول رد فعل من قبل النسخ العكسي.
- تحضير خليط PCR رد الفعل في كل أنبوب بصري: 10 ميكرولتر ماجستير ميكس (2X)، 0.2 ميكرولتر صبغ، 8 ميكرولتر-نوكلياز الحرة المياه، 1 ميكرولتر [كدنا]، و 1 ميكرولتر التمهيدي (يتم سرد الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول رقم 1).
- إعداد برنامج PCR: أ. 95 ° C 02:20 دقيقة، 1 دورة ب. 95 ° C 3 ثانية → 60 ° C 1 دقيقة، 40 دورة ج. 95 ° C 15 ثانية، 1 دورة د. 60 ° C 1دقيقة، 1 دورة الإلكترونية. 95 ° C 15 ثانية، 1 دورة. اختيار الأسلوب المقارن C T لتحديد مستويات التعبير الجيني النسبي.
- بعد الانتهاء PCR، وتحليل في الوقت الحقيقي PCR النتائج مع برنامج StepOne وتصدير النتائج إلى Excel.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح ويبين المكونات الرئيسية للelectrospinning في الشكل 1. تم الحصول على حصيرة كبيرة من الألياف حجم عادة من خلال تعلق عموديا الألومنيوم احباط الشريط وصفيحة معدنية مسطحة الشكل 2 تصميم جامع وحصيرة الألياف electrospinning. عرض وطول يمكن تعديلها لمختلف التطبيقات. طول الألياف المصنوعة من البوليمر PGD والقاعدية خليط الحل هو ما يصل إلى 10 سم. يظهر التشكل من ألياف electrospun في الشكل 3. وبأقطار من ألياف مصنوعة من 40٪ تركيز PGD هي في حدود...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
قيود من هواة جمع بسيطة أو تعقيدات الدورية جامعي التي تستخدم حاليا لelectrospinning زيادة تقييد الحصول على الطول المطلوب وحجم الألياف حصيرة لبعض التطبيقات. بالإضافة إلى ذلك، نقل الألياف من جامع الأرض إلى الطبق الثقافة أو غيرها من ركائز يشكل تحديا 5. في هذا التقرير، وكان أحد هواة جمع المصممة حديثا، أدلى ببساطة عن طريق ربط الشريط احباط الألومنيوم لجامع الارض، وقادرة على الحصول على حصائر الألياف كبيرة الحجم تصل إلى 10 سم في 20 سم في المرة الواحدة. أرقام 1 و...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
أعلن عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأجري هذا العمل باستخدام مرافق قسم الهندسة الطبية الحيوية في جامعة فلوريدا الدولية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الجلسرين | سيجما ألدريتش | G7757 | |
| حمض دوديكانيديويك | سيجما ألدريتش | D1009 | |
| الجيلاتين | سيجما ألدريتش | D1890 | |
| بولي (أكسيد الإيثيلين) (PEO) | سيجما ألدريتش | 182028 | |
| ريبوفلافين | سيجما ألدريتش | 132350250 | 0.10٪ |
| الخلايا الجذعية الجنينية للفأر | GlobalStem | GSC-5002 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| DMEM / F12 | Thermo Scientific | SH30272.02 | |
| N2 مكمل | غذائي Invitrogen | 17502048 | 1٪ |
| FGF2 | Stemgent | 03-0002 | 10 نانوغرام / مل |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | |
| ملحي مخزن بالفوسفات (برنامج تلفزيوني) | Invitrogen | 10010-031 | |
| صبغة مضان Resazurin | Sigma-Aldrich | 62758-13-8 | |
| SV نظام عزل الحمض النووي الريبي | الكلي Promega | Z3100 | |
| GoScript نظام النسخ العكسي | Promega | A5000 | |
| GoTaq qPCR Master Mix | مضخة حقنة Promega | A6001 | |
| فيشر العلمي | 14-831-200 | ||
| مصدر طاقة الجهد العالي | سبيلمان للإلكترونيات | العالي SL30 | |
| ضوء الأشعة فوق البنفسجية | فيليبس | 308643 | 15 واط / G15T8 |
| سينرجي HT قارئ صفيحة متعددة الأوضاع | BioTek | ||
| Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600 | Perkin Elmer | 8488 | |
| StepOne نظام PCR في الوقت الحقيقي | الأنظمة الحيوية | التطبيقية 4376357 |
المراجع
- Migneco, F., Huang, Y. -C., Birla, R. K., Hollister, S. J. Poly (glycerol-dodecanoate), a biodegradable polyester for medical devices and tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 30, 6479-6484 (2009).
- Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
- Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R. A tough biodegradable elastomer. Nature biotechnology. 20, 602-606 (2002).
- Panunzi, S., De Gaetano, A., Mingrone, G. Approximate linear confidence and curvature of a kinetic model of dodecanedioic acid in humans. American Journal of Physiology-Endocrinology And Metabolism. 289, (2005).
- Park, S., et al. Apparatus for preparing electrospun nanofibers: designing an electrospinning process for nanofiber fabrication. Polymer Internationa l. 56, 1361-1366 (2007).
- Barnes, C. P., Sell, S. A., Boland, E. D., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Nanofiber technology: designing the next generation of tissue engineering scaffolds. Advanced drug delivery reviews. 59, 1413-1433 (2007).
- Li, W. -J., Mauck, R. L., Tuan, R. S. Electrospun nanofibrous scaffolds: production, characterization, and applications for tissue engineering and drug delivery. Journal of Biomedical Nanotechnology. 1, 259-275 (2005).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: a review. Tissue engineering. 12, 1197-1211 (2006).
- Lim, S. H., Mao, H. -Q. Electrospun scaffolds for stem cell engineering. Advanced drug delivery reviews. 61, 1084-1096 (2009).
- Lowery, J. L., Datta, N., Rutledge, G. C. Effect of fiber diameter, pore size and seeding method on growth of human dermal fibroblasts in electrospun poly (epsilon-caprolactone) fibrous mats. Biomaterials. 31, 491-504 (2010).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30, 583-588 (2009).
- Ju, Y. M., Choi, J. S., Atala, A., Yoo, J. J., Lee, S. J. Bilayered scaffold for engineering cellularized blood vessels. Biomaterials. 31, 4313-4321 (2010).
- McCullen, S. D., et al. In situ collagen polymerization of layered cell-seeded electrospun scaffolds for bone tissue engineering applications. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1095-1105 (2010).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
