Electrospun الليفية سقالات بولي (الجلسرين-dodecanedioate) للهندسة الأنسجة العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

Electrospinning هي واحدة من طرق المعالجة الفعالة لإنتاج السقالات الألياف الدقيقة لحجم نانومتر. المبدأ الأساسي للelectrospinning ينطوي على مخروط تايلور من الحل الذي يقام في فتحة إبرة من خلال تطبيق الجهد العالي بين رأس الإبرة وجامع الارض. عندما التنافر الكهربائي في حل يتغلب على التوتر السطحي، يتم إخراج طائرة السائل مشحونة من طرف الإبرة، ينتقل عن طريق الهواء مع تبخر المذيبات، ويترسب في النهاية على جامع على الارض. يوفر ضخ حقنة تدفق مستمر من محلول الناشئة من مغزال ويمكن أن تكون ملفقة نسخ بالتالي متعددة من ألياف electrospun في غضون فترة قصيرة من الزمن. أثناء مغادرة مغزال للوصول إلى جامع، فإن طائرة اتهم الخضوع لتمتد والجلد وفقا لعدد من المعايير التي تشمل اللزوجة والتوتر السطحي من الحل البوليمرية، وelectrostatiج القوة في الحل، والتفاعل بين المجال الكهربائي الخارجي، الخ ^2.

في عملية electrospinning، يقدم أحد هواة جمع باعتبارها الركيزة موصل حيث يمكن أن تودع الألياف الدقيقة لنانومتر. في هذه الدراسة، تم تصميم نوع جديد من الألياف جامع للحصول على حصائر الألياف مع الحجم المطلوب (الطول × العرض). تقليديا، يتم استخدام رقائق الألومنيوم وجامع ولكن من الصعب نقل الألياف من سطح مستو لالركيزة أخرى. كانت صعوبة حصاد الألياف حصيرة سليمة من أحد هواة جمع التقليدية ويرجع ذلك أساسا إلى حقيقة أن الألياف electrospun إرفاق بقوة على سطح جامع. ولذلك، فإننا تعديل جامع من قبل للطي قطعة من رقائق الألومنيوم في شريط مستطيل وإرفاقها عمودي على لوحة معدنية مسطحة. وامتدت الألياف electrospun عبر المنطقة الواقعة بين غيض من الشريط وصفيحة معدنية، والتي يمكن نقلها بسهولة إلى substrat أخرىه.

الفائدة في البوليمرات المرنة crosslinked حراريا ينمو بسرعة بسبب العمل الرائد لمجموعة روبرت لانغر، الذي قدم بولي (الجلسرين sebacate) (PGS)، والبوليستر والتي هي مماثلة لمطاط مبركن في عام 2002 ^3. مماثلة لPGS، وقد وضعنا بنجاح بولي (الجلسرين-dodecanoate) (PGD) من خلال التكثيف الحراري من الجلسرين وحمض dodecanedioic وأظهرت فريدة الذاكرة شكل ممتلكاتها ^1. خلافا لصلابة المواد الاصطناعية بولي (الهيدروكسيل بوتيرات) أو بولي (L-lactide) (معاملات الرجوعية يونغ من 250 ميجا باسكال و 660 ميجا باسكال، على التوالي)، PGD يسلك الملكية المرنة مثل المطاط، مع معامل يونج (أ) من 1.08 ميجا باسكال عندما تكون درجة الحرارة فوق 37 درجة C، وهي المباراة على مقربة من الأعصاب الطرفية في الموقع (0.45 ميجا باسكال). بالإضافة إلى ذلك، PGD هو القابلة للتحلل وتدهور الوقت يمكن صقلها من خلال تغيير نسبة الجلسرين وحمض dodecanedioic. حمض Dodecanedioic هو دون الاثني عشر الكربونموقف مع مجموعتين الكربوكسيلية المحطة، HOOC (CH _{2) 10} COOH. الأحماض ثنائي الكربوكسيل الزوجية مثل حمض سيباسيك وحمض dodecanedioic يمكن استقلابه إلى أسيتيل التميم وأدخل حمض الكربوكسيليك (TCA) / (حمض الستريك) دورة. المنتج التمثيل الغذائي للأحماض ثنائي الكربوكسيل، succinyl، لجنة الزراعة، هو السلائف gluconeogenetic والمتوسطة دورة TCA ^4. وبالتالي، اقترحت بعض الدراسات أنه يمكن استخدامها بوصفها الركيزة الوقود البديلة للتغذية المعوية وبالحقن، وخاصة في الحالات المرضية. بالإضافة إلى ذلك، PGD يسلك الذاكرة شكل فريد لأن درجة حرارة التحول الزجاجي لها هو 31 درجة مئوية، وبالتالي فإنه يظهر الخواص الميكانيكية متميزة في درجة حرارة الغرفة وبدرجة حرارة الجسم. في خلاصة القول، PGD هو القابلة للتحلل، حيويا، واظهار خصائص المرونة فريدة من نوعها مع الخصائص الميكانيكية مماثلة لأنسجة العصب؛ وبالتالي، فإنه هو مادة مناسبة للتطبيقات هندسة الأنسجة العصبية. في هذا البروتوكول، وelectrospunملفقة ألياف طويلة تمتد منطقة ديعة كبيرة عن طريق جمع المصممة حديثا من PGD. يمكن السقالات الألياف دعم نمو الخلايا الجذعية المحفزة الماوس والتمايز.

1. إعداد Electrospinning جامع

1. قطع رقائق الألومنيوم في قطعة مستطيلة.
2. طي قطعة مستطيلة في شريط مستطيل، ونعلق عليه عمودي على لوحة معدنية مسطحة مع الشريط (الشكل 1). ملاحظة: حجم حصيرة الألياف يعتمد على طول وعرض قطاع غزة. وبالتالي، فإن أبعاد الشريط يمكن تعديلها حسب الحاجة.

2. إعداد البوليمر الحل

1. خلط الجلسرين وحمض dodecanedioic (DDA) في نسبة 1:1 المولي في كوب على 120 درجة مئوية لمدة 100 ساعة للحصول على PGD البوليمر.
2. حل بولي (أكسيد الإيثيلين) (PEO) والجيلاتين في 65٪ من الإيثانول مع نسبة وزن 1.5:3:95.5 في أنبوب 15 مل، وتشديد سقف وتسخين الخليط في الفرن على 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع التحريك حتى يصبح الحل متجانسة (حل بصل).
3. لelectrospinning، مزيج البوليمر PGD والحل القاعدية في 04:06 نسبة الوزن. ملاحظة: تركيز PGD لديه ثنائيةز تأثير على قطر الألياف. 30٪ -50٪ في المئة PGD هو مقبول لإنتاج ألياف أطول من 5 سم مع زيادة أقطار الألياف.
4. إضافة 0.1٪ الريبوفلافين إلى حل البوليمر وتخلط جيدا.

3. Electrospinning

1. تغذية حل البوليمر إلى 5 مل حقنة القياسية مع 18 G قلل المقاوم للصدأ إبرة الصلب.
2. إدراج حقنة في ضخ حقنة.
3. إرفاق الرصاص على الارض من مصدر الطاقة العالية الجهد لوحة معدنية والرصاص موجبة الشحنة إلى الإبرة.
4. ضبط المسافة بين الإبرة واحباط قطاع الألمنيوم إلى 15 سم.
5. وضع مضخة الحقنة في زاوية من حوالي 15 درجة مع الأفقي لمنع تجميع الألياف في الجزء الأمامي من قطاع غزة.
6. بدوره على ضخ حقنة وضبط معدل تدفق المضخة إلى 0.6 مل / ساعة.
7. بدوره على مصدر الطاقة عالية الجهد وضبط الجهد التشغيل إلى 14.6 كيلو فولت.

4.تجهيز الألياف

1. بعد اكتمال جمع، فضح حصيرة الألياف للأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 دقيقة لعبر ربط.
2. نقل حصيرة الألياف من رقائق الألومنيوم الشريط إلى 100 ملم طبق بيتري، وتعريضها لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة أخرى للتعقيم.
3. في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، وقطع حصيرة الألياف إلى قطع مستديرة من نفس الحجم مع شفرة جراحية ووضع قطع في 24 لوحة جيدا.
4. لخلية العلاج قبل البذر، تزج عينات الألياف في 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
5. في اليوم التالي، نضح PBS بعناية، إضافة 1 مل من التمايز المتوسطة (DMEM/F12، N2، وFGF2) (انظر الوصفة في الجدول مواد) إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعة.
6. نضح بعناية التمايز المتوسطة، إضافة 0.2 مل من matrigel إلى كل عينة الألياف واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: يمكن أيضا أن تستخدم لLaminin الألياف الطلاء. إضافة 0.2 مل من 20 ميكروغرام / مل lamininإلى الألياف ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعة.
7. إزالة بعناية matrigel الزائدة من كل بئر. شطف مع 2 مل من التمايز المتوسطة مرة واحدة. ملاحظة: عينات الألياف مستعدون للثقافة الخلية.

5. البذر خلية على ألياف

1. إضافة 1 مل من Accutase إلى الخلية صحن الثقافة زارة التربية والعلم واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
2. بعد 10 دقيقة، يتم فصل الخلايا زارة التربية والعلم من الطبق الثقافة. إضافة 4 مل من التمايز المتوسطة إلى اللوحة. جمع الخلايا زارة التربية والعلم العائمة في أنبوب 15 مل وخلايا ماصة صعودا وهبوطا لكسر المستعمرات (حوالي 15X).
3. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق واعادة تعليق الخلايا في 4 مل من التمايز المتوسطة.
4. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. نقل 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب 15 مل وتمييع 10X مع تمايز المتوسطة. نقل 15 ميكرولتر من تعليق خلية المخفف إلى غرفة على عدادة الكريات مع غطاء للانزلاق في المكان. عدالخلايا في ساحة المركز 1 مم والساحات الزاوية أربعة من عدادة الكريات تحت المجهر. ملاحظة: خلية لكل مل = متوسط ​​عدد س لكل متر مربع عامل التخفيف × 10 ⁴
5. وضع ما يقرب من 5 × 10 ⁴ خلايا زارة التربية والعلم على كل بئر. إسقاط ببطء تعليق الخلية إلى منتصف عينات من الألياف، بدلا من انزلاق إلى جانب البئر، لمنع الحل من استنزاف قبالة حصيرة الألياف.
6. إضافة 1 مل من التمايز المتوسطة إلى كل بئر، والحفاظ على لوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ مرفق للسماح للخلايا والنمو والتمايز.
7. نضح المتوسطة القديمة من كل بئر واستبدالها مع 1 مل من المتوسط ​​التمايز جديدة كل يوم.

6. بقاء الخلية

1. نضح المتوسطة القديمة من كل بئر.
2. مزيج حجم ^ال 1/10 من ريسازورين مضان كاشف مع مستنبت وإضافة 1 مل إلى كل بئر.
3. Incubيأكلون في 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 4 ساعة، محمية من الضوء المباشر.
4. بعد 4 ساعات، ونقل 100 ميكرولتر من كاشف 3X من كل بئر إلى 96 لوحة جيدا، ثم العينات جاهزة للقياس على معمل مضان باستخدام إعدادات التصفية 560EX nm/590EM.

7. في الوقت الحقيقي PCR

1. بعد 14 يوما من الثقافة، إضافة تحلل العازلة للعينات وعزل الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا على عينات من الألياف.
2. استخدام 4 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي مجموع لتجميع كدنا] في 20 ميكرولتر جداول رد فعل من قبل النسخ العكسي.
3. تحضير خليط PCR رد الفعل في كل أنبوب بصري: 10 ميكرولتر ماجستير ميكس (2X)، 0.2 ميكرولتر صبغ، 8 ميكرولتر-نوكلياز الحرة المياه، 1 ميكرولتر [كدنا]، و 1 ميكرولتر التمهيدي (يتم سرد الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول رقم 1).
4. إعداد برنامج PCR: أ. 95 ° C 02:20 دقيقة، 1 دورة ب. 95 ° C 3 ثانية → 60 ° C 1 دقيقة، 40 دورة ج. 95 ° C 15 ثانية، 1 دورة د. 60 ° C 1دقيقة، 1 دورة الإلكترونية. 95 ° C 15 ثانية، 1 دورة. اختيار الأسلوب المقارن C _T لتحديد مستويات التعبير الجيني النسبي.
5. بعد الانتهاء PCR، وتحليل في الوقت الحقيقي PCR النتائج مع برنامج StepOne وتصدير النتائج إلى Excel.

يوضح ويبين المكونات الرئيسية للelectrospinning في الشكل 1. تم الحصول على حصيرة كبيرة من الألياف حجم عادة من خلال تعلق عموديا الألومنيوم احباط الشريط وصفيحة معدنية مسطحة الشكل 2 تصميم جامع وحصيرة الألياف electrospinning. عرض وطول يمكن تعديلها لمختلف التطبيقات. طول الألياف المصنوعة من البوليمر PGD والقاعدية خليط الحل هو ما يصل إلى 10 سم. يظهر التشكل من ألياف electrospun في الشكل 3. وبأقطار من ألياف مصنوعة من 40٪ تركيز PGD هي في حدود ميكرون. وصفت الصور المجهري متحد البؤر من الخلايا التمييزية المستمدة من الخلايا المستزرعة زارة التربية والعلم لمدة 3 و 6 أيام على الألياف في الشكل 4. جاءت الإشارات الفلورية الخضراء من التعبير المفرط للبروتين الفلورية الخضراء (GFP) في الخلايا. وأظهرت نتيجة ريسازورين كاشف مضان في الشكل 5 أن الخلايا تنمو زارة التربية والعلمن على طلاء الألياف PGD مع matrigel وlaminin كان بقاء الخلية يعادل وكان أعلى نسبيا الانتشار مقارنة بالمجموعة غير المصقول. وكان كميا في التعبير الجيني للخلايا العصبية تعدد القدرات وعلامات بواسطة PCR الوقت الحقيقي (الشكل 6). أعرب غالبية الخلايا زارة التربية والعلم مثقف على الألياف وOCT4 علامات تعدد القدرات، وNANOG Sox2 في حين أعرب عن أقلية من الخلايا يمثل الخلايا الجذعية العصبية PAX6 وNestin. بعد الثقافة 2 أسابيع، MES نمت على الألياف أظهرت زيادة مستويات التعبير من علامات الخلية العصبية مثل MAP2 وDCX، وكذلك Oligo1 دبقية قليلة التغصن علامة وعلامة نجمية GFAP.

الشكل 1. Electrospinning اقامة. يتم إخراج الحل البوليمرية من إبرة اضعافها. أسس مصدر الطاقة العالية الجهد معدن لوحة مسطحة والثانية لاحباط الشريط الألمنيوم التي تترسب بين ألياف متر الصغرى لنانو (الأزرق).

الشكل 2. تصميم جامع والألياف electrospun حصيرة. العرض وطول حصيرة الألياف يمكن تغييرها بسهولة عن طريق ضبط حجم احباط قطاع الألمنيوم. ليس هناك حد لعرض حصيرة، ويمكن أن تكون أطول الألياف تصل إلى 10 سنتيمترا.

الرقم 3. الصور ووزارة شؤون المرأة electrospun من PGD وحل القاعدية 04:06 (ث / ث)، ومتوسط ​​قطرها من ألياف حوالي 2 ميكرون. عندما ينخفض ​​تركيز PGD إلى 30٪، ومتوسط ​​قطرها من ألياف يقع في نطاق نانومتر. الأبيضيمثل شريط نطاق 10 ميكرون.

الشكل 4. الصور المجهري متحد البؤر الخلايا زارة التربية والعلم متباينة على الألياف. الخلايا تحمل GFP مضان يحمل الخضراء الزاهية عند تعرضها للضوء الأزرق في نطاق الأشعة فوق البنفسجية ل. زيادة عدد الخلايا الفلورية الخضراء يوم 6 يشير إلى أن السقالات الألياف يمكن أن تدعم التصاق الخلايا وانتشارها. يمثل حجم شريط أبيض 100 ميكرون. (يوم 3 ويوم 6).

الرقم 5. الجدوى خلية من خلايا زارة التربية والعلم على ألياف PGD طلاء مع Matrigel وlaminin في 1 و 3 و 5 أيام على النحو الذي يحدده ريسازورين fluoreمسرح الحادث كاشف. الخلايا المستزرعة على ألياف غير المصقول استخدامها لمكافحة (ع <0.05).

الرقم 6. تحليل QRT-PCR في التعبير الجيني في الخلايا زارة التربية والعلم متباينة على ألياف PGD. وعلامات الخلية العصبية واضحا بعد 2 أسابيع أظهرت أن الخلايا زارة التربية والعلم على السقالات ومتباينة في الخلايا العصبية.

أعلن عن أي تضارب في المصالح.