مقالة منهجية

عكس النهج الوراثية عن طريق القلب البطيني Morpholino حقن لبالنقل متعددة يصعب الهدف الأنسجة في الزرد اليرقة

DOI:

10.3791/51595

⸱

يونيو 17, 2014

 , 
1DFG-Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة الوراثية العكسية للتكيف الزرد لتقييم وظيفة الجين خلال مراحل لاحقة من التطور والتوازن الفسيولوجية مثل تجديد الأنسجة باستخدام الحقن داخل البطينات من morpholinos الجينات المحددة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الزرد هو نموذج مهم لفهم الخلية والبيولوجيا الجزيئية من الجهاز وأطرافهم التجدد. ومع ذلك، استراتيجيات لتوظيف الجزيئية وعلم الوراثة العكسية لم يتم تطويرها بشكل كاف لتقييم وظيفة الجين في تجديد أو توازن الأنسجة أثناء مراحل اليرقات بعد مرحلة التطور الجنيني الزرد، والعديد من الأنسجة داخل اليرقة الزرد يصعب استهدافها. الحقن داخل البطينات من morpholinos الجينات المحددة تقدم طريقة بديلة لعدم القدرة الحالية لاستهداف genomically الجينات الزرد في الطريقة التي تسيطر عليها مؤقتا في هذه المراحل. يسمح هذا الأسلوب لتشتت كاملة والتأسيس لاحقة من morpholino في الأنسجة المختلفة في جميع أنحاء الجسم، بما في ذلك الهياكل التي كانت في السابق من المستحيل التوصل إلى مثل تلك الموجودة في الزعنفة الذيلية اليرقات، بنية غالبا ما تستخدم للبحث noninvasively تجديد الأنسجة. وحاضرا أيضا العديد من الجينات تفعيلها خلال اليرقات finfold التجديدر في تجديد الأنسجة الفقاريات الكبار، وبالتالي فإن اليرقة هو نموذجا مفيدا لفهم التجديد في البالغين. يسمح هذا الأسلوب morpholino التشتت لتحديد سريعة وسهلة من الجينات المطلوبة لتجديد أنسجة اليرقات وكذلك الظواهر الفسيولوجية الأخرى التي تنظم توازن الأنسجة بعد مرحلة التطور الجنيني. لذلك، يوفر هذا الأسلوب تسليم استراتيجية حاجة حاليا للسيطرة الزمني لتقييم وظيفة الجين بعد مرحلة التطور الجنيني.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تجديد الأجهزة والزوائد المهم بشكل أساسي من أجل البقاء واللياقة البدنية؛ ومع ذلك، العديد من الفقاريات بما في ذلك رجل حدت قدرات التجدد. بينما توجد العديد من النماذج الحيوانية التي لديها القدرة على التجدد واسعة، عكس التقنيات الوراثية لتقييم وظيفة الجين خلال الجهاز وأطرافهم التجديد تبقى محدودة جدا أو غير موجودة. لذا، ثمة حاجة إلى نهج جديد لتشريح البيولوجيا الجزيئية للتجديد في هذه الكائنات الطراز.

الزرد هو نموذج راسخة لفهم الخلية والبيولوجيا الجزيئية من الجهاز وأطرافهم تجديد 1، وليس فقط بسبب قدرة كبيرة لتجديد أجهزة متعددة والأنسجة والزوائد، ولكن أيضا لأن....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الإبر الزجاج (الشكل 1)

  1. استخدام الزجاج الشعيرات الدموية مع 0.75 مم لإعداد الإبر الحقن (الشكل 1A).
  2. وضع الزجاج الشعرية في مجتذب الإبرة وسحب الإبرة مع المعلمة التالية: قيمة دورة التدفئة: 463؛ سحب قيمة دورة: 230؛ السرعة: 150 ميللي ثانية؛ الوقت: 150 ميللي ثانية (الشكل 1B).
  3. كسر الزجاج الشعرية سحبت مع ملاقط ساعاتي لإنتاج إبرة قطرها 20 ميكرومتر تحت المجسام مع العدسة ميكرون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم وضع حاد، مشطوف حقن الإبرة بسهولة في البطين في القلب من اليرقة الزرد عندما اقترب ظهريا (الشكل 3A). قلب يستمر الضخ ويتم الاحتفاظ تدفق الدم رغم وجود إبرة (أرقام 3B و 3C). الحقن الدقيق لا يعطل التشكل من البطين أو تقلصات القلب (الشكل 3D) على الرغم من حقن morpholino في قلب (الشكل 3E).

في غضون دقائق، والحل morpholino-إندو بورتر توزع.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر حقن داخل البطيني طريقة تقييم سريع وموثوق بها لاختبار وظيفة الجين في مراحل لاحقة من التطور أو من التوازن الجسم دون التأثير على وظيفة الجين خلال مرحلة التطور الجنيني. لضمان نجاح هذه التقنية، ينبغي للمرء أن يكون على بينة من أربع نقاط هامة: 1) حجم الإبرة، 2) التجفيف من الإبرة، 3) التقليل من حجم، و4) الحد الأدنى من التعرض الوقت في حل التخدير. سوف الإبر التي هي صغيرة جدا تسد كثير من الأحيان، بينما الإبر التي تكون كبيرة جدا سيضر البطين ويسبب النزيف. في حين أن 20 ميكرون من المستحسن، .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG)، ونحن نود أن نشكر أييلي تسيديكي Taddese للدعم التقني.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مورفولينو مع 3 & حاد; علامة الفلورسينGene Tools Inc.تخصيصمزيد من المعلومات في www.gene-tools.com
Endo-PorterGene Tools Inc.مزيد من المعلومات في www.gene-tools.com
AgaroseServa120623لصب الأطباق لوضع الأسماك أثناء الحقن والتصوير
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)Applichemللتخدير
E3 medium (5 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 0.17 ملي كلوريد كلوريد الصوديوم ؛ 0.17 ملي كلوريد ؛ 0.33 ملي كاستوريد الكالسيوم < الفرعي >2< / فرعي > 0.33 ملي مولار MgSO4< / sub>)لتربية اليرقات
أطباق بتريSarstedt821.472لوضع الأسماك أثناء الحقن وتصوير
الشعيرات الدموية الزجاجية رقيقةالجدران World Precision Instruments، Inc.TW100F-3لتحضير إبر الحقن
أطراف ماصة MicroloaderEppendorf5،242،956،003لتحميل الإبرة
ماصات باستور (3 مل / 1 مل)العلامة التجارية747760/74775لنقل اليرقة
المشتعلة / مجتذب الإبرةالبني Sutterمزيد من المعلومات في www.sutter.com
ملاقط صانع الساعات (دومونت) (مقاس 5)الدقة العالمية الأدوات ، شركة501985لفرملة الإبرة قبل شحذ
تشريح المجهرأوليمبوس ، لايكا ، زايسيختلف مع الشركة المصنعةجزء من إعداد الحقن بالكامل
كاميرا مضانأوليمبوس ، لايكا ، زايسيختلف مع الشركة المصنعةلتصوير التألق بعد مجموعة injeciton
PicoNozzle (حامل حاقن دقيق)الدقة العالمية5430-12ل الحقن المجهري
مضخة بيكو الهوائية (حاقن دقيق)أدوات الدقة العالميةSYS-PV820للحقن المجهري
أدوات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
  2. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Zebrafish LarvaMorpholino InjectionVentricular InjectionFin RegenerationGene KnockdownTissue TargetingFiji ImageJAnesthesia ProtocolCapillary NeedleRegeneration Assessment

مقالات ذات صلة