يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استخدام المصابيح الفلورية الهدف صالحة لتقييم T الردود الخليوي

14.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51627

⸱

يونيو 19, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

في هذه المقالة

ملخص

القدرة على رصد استجابات الخلايا التائية بالتفصيل في الجسم الحي المهم لتطوير فهمنا للاستجابة المناعية. نحن هنا وصف استخدام صفائف الهدف الفلورسنت (اتفاقيات التجارة الحرة) في الجسم الحي في فحص الخلايا التائية التي يقيم> 250 معلمات في وقت واحد من قبل التدفق الخلوي.

الملخص

القدرة على رصد استجابات الخلايا T في الجسم الحي المهم لتطوير فهمنا للاستجابة المناعية وتصميم المناعية. نحن هنا وصف استخدام الفلورسنت مجموعة المستهدفة (FTA) والتكنولوجيا، التي تستخدم الأصباغ الحيوية مثل استر carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE)، البنفسجي ليزر الأصباغ منفعل (CellTrace فيوليت: CTV) والليزر الحمراء الأصباغ منفعل (خلية انتشار صبغ eFluor 670: وثيقة البرنامج القطري ) لcombinatorially الخلايا الليمفاوية الماوس في التسمية> 250 ملحوظ مجموعات الخلايا الفلورسنت. مجموعات الخلايا داخل هذه اتفاقيات التجارة الحرة يمكن نابض مع التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) من الدرجة الأولى والدرجة MHC-II الببتيدات ملزمة، وبالتالي تكون بمثابة خلايا CD8 + الهدف لوخلايا CD4 + T، على التوالي. تبقى هذه الخلايا قابلة للحياة واتفاقية التجارة الحرة تعمل بكامل طاقتها، وبالتالي يمكن أن تدار في الفئران للسماح تقييم CD8 + T قتل بوساطة خلية من الخلايا المستهدفة اتفاقية التجارة الحرة وCD4 + T-هيل التأمل الخليةp من اتفاقية التجارة الحرة B الخلايا المستهدفة خلية في الوقت الحقيقي في الجسم الحي بواسطة التدفق الخلوي. منذ> 250 الخلايا المستهدفة يمكن تقييمها في وقت واحد، والأسلوب يسمح رصد استجابات الخلايا T ضد عدة الحواتم المستضد في عدة تركيزات ومكررات متعددة. على هذا النحو، يمكن للتقنية قياس استجابات الخلايا التائية في كل من الكمية (على سبيل المثال حجم التراكمي للاستجابة) والنوعية (على سبيل المثال. الطمع وظيفية وحاتمة عبر التفاعل من الاستجابة) المستوى. هنا، نحن تصف كيفية بناء هذه اتفاقيات التجارة الحرة وتعطي مثالا على الكيفية التي يمكن تطبيقها لتقييم استجابات الخلايا التائية الناجمة عن الفيروس لقاح جدري المؤتلف.

المقدمة

الخلايا التائية تلعب دورا محوريا في الاستجابة المناعية التكيفية، وغالبا ما تستهدف التلاعب في العلاج المناعي. CD4 + T المستجيب الخلايا الرد على مستضد عن طريق إفراز السيتوكينات الخارجية التي تنظم جوانب كثيرة من الحصانة ويمكن أن يساعد أيضا الخلايا البائية مباشرة لتصنيع الأجسام المضادة. خلايا CD8 + T السامة للخلايا (CTLs) يمكن أن تستجيب أيضا لمستضد عن طريق إفراز السيتوكينات الخارجية وكذلك تلعب دورا مركزيا في قتل الخلايا مباشرة تعبر عن مستضد الأجنبية. التفاعل الأساسي الذي يبدأ هذه الوظائف المستجيب الخلايا التائية ينطوي على التفاعل بين الخلايا مستقبلات T (TCR) مع الببتيدات الأجنبية المعروضة على جزيئات MHC على سطح الخلايا. خلايا CD4 + T تعترف الببتيدات المعروضة على جزيئات MHC من الدرجة الثانية على مستضد تقديم الخلايا وخلايا CD8 + T تعترف الببتيدات المعروضة على جزيئات MHC-I الطبقة التي عادة ما يتم عرضها على الخلايا المصابة ميكروب.

من أجللتقييم الدور الذي تلعبه الخلايا التائية في الاستجابة المناعية، فمن الضروري أن ظائف المستجيب التي يتم قياسها من خلال تقنيات موثوقة وحساسة. وتشمل الطرق الشائعة لتقييم استجابة الخلايا T؛ MHC class-I/II/peptide tetramer التفاعل؛ إنتاج السيتوكينات التي كتبها ELISPOT والخلايا تلطيخ خلوى؛ وقتل القدرات بنسبة 51 المقايسات الكروم، الإصدار. هذه المقايسات، ومع ذلك، وعادة ما يتم تنفيذ فيفو السابقين مع التحفيز في المختبر، أو تقديم رؤية محدودة في وظيفة خلايا تي. من الناحية المثالية، عند قياس استجابات الخلايا التائية أنه سيكون من المفيد لتقييم لهم في الموقع، في الجسم الحي عند حدوثها، مع عدم وجود التلاعب من الخلايا T وذلك لتجنب التغيرات في المعايير الفنية التي قد تحدث من خلال التحفيز في المختبر. وتستند بعض من الأكثر شيوعا في الجسم الحي الخلايا التائية المقايسات الفنية على قياس القتل CTL بوساطة الخلايا المستهدفة نابض مع الطبقة MHC الببتيدات أنا ملزم بأن يتم تعداد في الجسم الحيعبر الكشف من خلال وضع العلامات الفلورية مع الأصباغ الحيوية مثل CFSE. في حين أن هذه الأنواع من المقايسات يمكن رصد مقتل CTL بوساطة من الأهداف عندما يحدث في الجسم الحي، وكان لديهم في السابق قدرة محدودة نسبيا لتقييم مقتل أهداف متعددة تقديم تركيزات مختلفة وأنواع مختلفة من الحواتم الببتيد، وهو مطلوب للسماح المعلمات النوعية مثل الطمع وظيفية وحاتمة البديل عبر التفاعل ليتم تقييمها. هذه المقايسات أيضا لا توفر أي معلومات عن CD4 + T الخلية بوساطة الاستجابات.

للتغلب على العديد من القيود مع الأساليب الحالية المستخدمة لتقييم استجابات الخلايا التائية، وقد وضعنا مؤخرا مقايسة متعددة استنادا صفائف الفلورسنت الهدف (اتفاقيات التجارة الحرة)، والذي يسمح للرصد استجابات الخلايا T ضد> 250 الخلايا المستهدفة في وقت واحد في حيوان واحد من قبل التدفق الخلوي 1، 2. وتتألف اتفاقيات التجارة الحرة من الخلايا الليمفاوية المسمى مع بغازيتركيزات األطراف ومزيج من الأصباغ الحيوية مثل CFSE، CTV وثيقة البرنامج القطري السماح> 250 خلية من مجموعات مضان فريدة لتكون ولدت. لأن هذه الخلايا لا تزال قابلة للحياة وتعمل بكامل طاقتها، ويمكن حقنها في الحيوانات للسماح رصد تفاعلها مع الخلايا التائية المستجيب في الجسم الحي 3. على سبيل المثال، مجموعات الخلايا اتفاقية التجارة الحرة يمكن نابض مع MHC-I-الببتيدات ملزمة الطبقة للسماح تقييم مستضد محددة CTL بوساطة قتل الخلايا المستهدفة 1. بالإضافة إلى ذلك، ومجموعات الخلايا اتفاقية التجارة الحرة يمكن أيضا أن يكون نابض مع الببتيدات MHC الدرجة الثانية ملزمة، مما يتيح تقييم مستضد محددة الخلايا التائية المساعدة (T H) النشاط عن طريق تقييم تفعيل (عن طريق تقييم علامات تفعيل مثل CD69، CD44 و / أو CD62L) من خلايا B ضمن اتفاقية التجارة الحرة التي تحمل الببتيد وما شابه ذلك 2. منذ ويمكن الكشف عن أكثر من 250 أهداف في وقت واحد، فمن الممكن لقياس CTL وT H الاستجابات ضد العديد من مجموعات الخلايا المستهدفة نابض مع nالببتيدات umerous بتركيزات مختلفة وإدراج العديد من مكررات. وبالتالي يوفر الفحص FTA مستوى غير مسبوق من T تقييم استجابة المستجيب خلية في الجسم الحي.

نحن هنا تصف بالتفصيل بناء منطقة التجارة الحرة وإظهار الكيفية التي يمكن تطبيقها على تقييم استجابات الخلايا T في الجسم الحي. يصف الإجراء بناء منطقة تجارة حرة تتكون من 252 مجموعات الخلايا ملحوظ من خلال استخدام ثلاثة الأصباغ الحيوية، تتألف من 6 تكرارات من 42 مجموعات الخلايا نابض مع الطبقة MHC-I والببتيدات الثاني ملزم. وضع العلامات من 42 مجموعات الخلايا يحدث في 10 مل المخروطية القاع أنابيب وأنها مفيدة لوضع هذه في رف أنبوب كما هو مبين في الجدول رقم 1. يمكن تعديل هذه الطريقة لأعداد أقل من كتل ملحوظ كما هو مطلوب عن طريق تقليل كمية من وضع العلامات كل صبغة يؤديها 1.

نسلط الضوء على فائدة الفحص من خلال إظهار كيف يمكن قياس رد ووفاق الناتجة عن التطعيم للفيروسات جدري المؤتلف ضد الحواتم متعددة في لفيف صغير من الفئران. هذا يبين كيف يمكن استخدام مقايسة اتفاقية التجارة الحرة لقياس الاستجابات التراكمية والطمع وظيفية من خلال، على التوالي، واستخدام المساحة تحت منحنى (AUC) تقييم وقياس تركيز الببتيد الفعالة اللازمة لتوليد استجابات القصوى نصف (EC 50).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تمت معالجة الفئران المستخدمة في إطار هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات تجارب على الحيوانات الجامعة الوطنية الاسترالية والفئران والموت الرحيم من قبل خلع عنق الرحم.

1. صبغ وإعداد الببتيد

  1. إعداد صبغ
    ملاحظة: يتم prediluted الأصباغ بتركيزات مختلفة للسماح للتوسيم الخلايا في كثافة مضان منفصلة. يستخدم CFSE في سبعة تجمعات تتم من خلال التخفيفات التسلسلي 3.5 أضعاف، وتستخدم CTV وثيقة البرنامج القطري في ستة تركيزات مختلفة تتم من خلال التخفيفات التسلسلي 3.7 أضعاف (انظر الجداول 2-4). سيتم استخدام تركيزات المخزون من الأصباغ المدرجة في الجدولين 2-4 لتسمية الخلايا المستهدفة في تركيزات الصبغة النهائية المدرجة في الجدولين 2-4. الأصباغ تتفاعل عند التعرض لمحلول مائي. ولذا فمن المهم أن تكون قارورة معايرتها لRT قبل فتح للحد من التعرض للأصباغ إلى التكثيف.
    1. CFSE
      ملاحظة: يتم شراء CFSE كما carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات succinimidyl استر (CFDA، SE؛ MW 557.47)، وعادة عند 25 ملغ / القارورة.
      1. في resuspend 25 ملغ من CFSE في 4.48 مل DMSO للحصول على محلول المخزون 10 ملي.
      2. متسلسل تخفيف CFSE: إضافة 35 ميكرولتر من 10 ملي الأسهم CFSE إلى 87.5 ميكرولتر من DMSO وكرر هذا مع محلول المخزون المخفف لإعطاء كل تركيز الصبغة في الجدول 3.
    2. CTV
      ملاحظة: عادة ما يتم شراؤها CTV في حزم من 9 قارورة، كل منها يمكن أن يعاد مع 10 ميكرولتر من DMSO لتوليد حل 10 ملم من الصبغة.
      1. إعادة تجميع وكل قارورة 9 من CTV مع 90 ميكرولتر من DMSO لإعطاء حل 10 ملم.
      2. متسلسل تمييع CTV: إضافة 11 ميكرولتر من 10 ملي CTV الأسهم إلى 29.7 ميكرولتر من DMSO وكرر هذا مع محلول المخزون المخفف لإعطاء كل تركيز الصبغة في الجدول 2.
    3. وثيقة البرنامج القطري
      ملاحظة: وثيقة البرنامج القطري (MW 792.6) هو نموذجيكما اشترت لاي 0.5 ملغ / القارورة.
      1. في resuspend 0.5 ملغ من وثيقة البرنامج القطري في 63 مل من DMSO للحصول على حل 10 ملم.
      2. متسلسل تمييع وثيقة البرنامج القطري: إضافة 11 ميكرولتر من 10 ملي الأسهم وثيقة البرنامج القطري إلى 29.7 ميكرولتر من DMSO وكرر هذا مع محلول المخزون المخفف لإعطاء كل تركيز الصبغة في الجدول 4.
        ملاحظة: يمكن تخزين مخزونات صبغ في -20 درجة مئوية لعدة أشهر ويمكن إذابة وأعيد تجميدها مرة أخرى عدة مرات دون خسارة كبيرة في وظيفة.
  2. إعداد الببتيد
    ملاحظة: يتم استخدام الببتيدات MHC من الدرجة-I-ملزم عموما إلى نبض الخلايا المستهدفة في 6 تركيزات مختلفة مصنوعة باستخدام 10 أضعاف التخفيفات من تركيز بدءا من 1 ميكرومتر (الجدول 5). وتستخدم الطبقة MHC الببتيدات الثاني ملزم عموما إلى نبض الخلايا المستهدفة في 6 تركيزات مختلفة مصنوعة باستخدام 3 أضعاف التخفيفات من تركيز بدءا من 400 ميكرومتر (الجدول 5). يرصد كل الببتيد في التركيز النهائي 2X في برنامج تلفزيوني مثل ثار كل تركيز الببتيد لديه الحد الأدنى من حجم 250 ميكرولتر. الأسهم الببتيد يمكن إعداد اتفاقية التجارة الحرة قبل البناء وتخزينها في -20 درجة مئوية دون خسارة كبيرة في وظيفة.
    1. الببتيدات الأسهم إعداد الطبقة MHC-I-ملزم
    2. إعداد على أعلى تركيز كل حاتمة الببتيد إلى 2 الحلول الأسهم ميكرومتر (2X 1 ميكرومتر)
    3. متسلسل تمييع MHC-I-الببتيدات ملزمة الدرجة: إضافة 44.4 ميكرولتر من 2 ميكرومتر الببتيد محلول المخزون إلى 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. كرر هذا مع محلول المخزون المخفف لإعطاء كل تركيز الببتيد في الجدول 5.
    4. الببتيدات الأسهم إعداد الطبقة MHC-II-ملزم
    5. إعداد على أعلى تركيز كل حاتمة الببتيد إلى 800 ميكرومتر الحلول الأسهم من (2x 400 ميكرومتر).
    6. متسلسل تمييع MHC الببتيدات الفئة-II-ملزم: إضافة 150 ميكرولتر من 800 ميكرومتر حل الببتيد في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. كرر هذا مع محلول المخزون المخفف لإعطاء كل تركيز الببتيد في الجدول 5 .

2. إعداد اتفاقية التجارة الحرة

ملاحظة: يحدد الإجراء أدناه بناء على اتفاقية التجارة الحرة تتألف من خلايا نابض مع 7 الحواتم الببتيد مختلفة في 6 تركيزات مختلفة (أي 42 مجموعات الخلايا.) كرر 6 مرات لتوليد 252 مجموعات الخلايا ملحوظ. داخل كل تكرار، كتلة الخلية لا نابض مع أي حاتمة (النيل)، يتم تضمين كمجموعة تحكم. فإنه من المفيد لاتفاقيات التجارة الحرة لديها اختلاف CD45 النمط الخيفي من الحيوانات المضيفة للسماح التمييز ضدهم من خلايا المتلقي عن طريق وضع العلامات الأجسام المضادة في وقت التحليل. خلاف ذلك اتفاقيات التجارة الحرة يمكن المسمى مع الأصباغ الأخرى مثل PKH-26 لهذا الغرض (موضح في الخطوة 2.6). عادة، يتم إجراء إعداد اتفاقية التجارة الحرة خارج من البداية الى النهاية خلال جلسة واحدة.

  1. تسمية 42، 10 مل المخروطية القاع أنابيب بلاستيكية 1-42 (كما في الجدول رقم 1 على سبيل المثال).
  2. إعداد الخلايا
    1. عزل الطحال و / أو lymphnodes من الفئران. إعداد تعليق خلية واحدة من الأنسجة التي كتبها يهرس من خلال 70 ميكرون مسامي غربال مع 5 مل حقنة الغطاس وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
    2. في resuspend الخلايا اللمفية بسرعة تصل إلى 200 × 10 6 خلية / مل في 11.5 مل من روتشستر معهد ميموريال بارك 1640 (RPMI، أو ما يعادلها) تحتوي على 5٪ مصل العجل الجنين (FCS). ملاحظة: من المهم استخدام العازلة مع ارتفاع محتوى أمين لتقليل سمية للخلايا الصبغة 3.
  3. وضع العلامات CTV
    ملاحظة: وصفت الخلايا في البداية مع 6 تركيزات CTV.
    1. بدقة resuspend الخلايا بواسطة قلب الأنبوب عدة مرات. إضافة 1.9 مل من تعليق خلية إلى 6 من 10 مل أنابيب المسمى 37-42، مع الحرص على عدم الرطب النصف العلوي من الأنابيب.
    2. لتسمية الخلايا مع CTV، وإزالة الغطاء أنبوب ووضع أنبوب أفقيا.
    3. إضافة 83 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى الجزء غير مبلل في الجزء العلوي من الأنبوب، وهذا إضافة 17 ميكرولتر من الأسهم CTV (انظر تبويبلو 2 الذي تم تعيينه حل الأسهم التي أنبوب). ملاحظة: أنبوب غير مبلل المهم لمنع حركة تعليق خلية وخلط المبكرة من الحل الخلية مع محلول الصبغة.
    4. غطاء الأنبوب وخلط تعليق خلية مع الصبغة بسرعة وبدقة من قبل vortexing.
    5. كرر الخطوات 2.3.2-2.3.4 للحلول المخزون من CTV في أنابيب المعين هو موضح في الجدول رقم 2.
    6. احتضان الخلايا لمدة لا تقل عن 5 دقائق على RT (20 درجة مئوية).
  4. وضع العلامات CFSE
    1. بعد وضع العلامات CTV، إضافة 5 مل من RPMI تحتوي على 5٪ FCS إلى كل أنبوب و resuspend بدقة الخلايا من قبل vortexing.
      1. من أنبوب نقل 37 1 مل من تعليق خلية لأنابيب 31، 25، 19، 13، 7، و 1.
      2. من أنبوب نقل 38 1 مل من تعليق خلية لأنابيب 32، 26، 20، 14، 8، و 2.
      3. من أنبوب نقل 39 1 مل من تعليق خلية لأنابيب 33، 27، 21، 15، 9، و 3.
      4. من أنبوب نقل 40 1 مل من خليةتعليق لأنابيب 34، 28، 22، 16، 10، و 4.
      5. من أنبوب نقل 41 1 مل من تعليق خلية لأنابيب 35، 29، 23، 17، 11، و 5.
      6. من أنبوب نقل 42 1 مل من تعليق خلية لأنابيب 36، 30، 24، 18، 12، و 6
        ملاحظة: الحرص على عدم الرطب النصف العلوي من الأنابيب خلال الخطوات 2.4.1.1-2.4.1.6.
    2. لتسمية الخلايا مع CFSE، وإزالة الغطاء أنبوب ووضع أنبوب أفقيا.
    3. إضافة 103 مل من برنامج تلفزيوني إلى الجزء غير مبلل في الجزء العلوي من الأنبوب، وهذه الإضافة 7 مل من الأسهم CFSE (انظر الجدول 3 الذي تم تعيينه حل الأسهم التي أنبوب).
    4. غطاء الأنبوب وخلط تعليق خلية مع الصبغة بسرعة وبدقة من قبل vortexing.
    5. تفعل الخطوات 2.4.2-2.4.4 للحلول المخزون من CFSE في أنابيب المعين هو موضح في الجدول رقم 3.
    6. احتضان الخلايا لمدة لا تقل عن 5 دقائق على RT (20 درجة مئوية).
    7. غسل الخلايا: تمييع تعليق خلية مع 9 مل من 20 درجة مئويةRPMI تحتوي على 5٪ FCS والرواسب بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة عند 20 درجة مئوية وإزالة supernatants بواسطة الشفط مع ماصة نقل.
  5. ينبض الببتيد وغسل الخلايا
    ملاحظة: بعد أن وصفت الخلايا مع CTV وCFSE، ونابض أنها مع MHC من الدرجة-I و / أو الطبقة MHC-II الببتيدات ملزمة (المعد في 1.2). كما يجب أن لا يكون نابض واحدة من السكان الخلية مع الببتيد (على سبيل المثال. النيل في الجدول 1) وتستخدم كعنصر تحكم السلبية لحساب استجابات الخلايا التائية.
    1. الببتيد النبض
      1. Resuspend الخلايا في الحجم الكلي لل250 ميكرولتر من RPMI تحتوي على 5٪ FCS. ملاحظة: عادة 50 ميكرولتر من تعليق خلية يبقى بعد تطلع طاف في نهاية الخطوة 2.4.7، وبالتالي إضافة 200 ميكرولتر من المتوسطة إلى الخلية بيليه.
      2. إضافة 250 ميكرولتر من الأسهم الببتيد قبل استعداد (كما في الجدول 5) ليعين بشكل مناسب أنابيب (كما في الجدول رقم 1) ويكون سوره لتشمل أنبوب السيطرة من برنامج تلفزيوني وأضاف وحدها دون الببتيد كعنصر تحكم النيل.
      3. مزيج تعليق خلية مع دوامة. ملاحظة: ومن الأهمية بمكان أن كل حاتمة الببتيد وكل تركيز الببتيد تم تعيينه إلى أنبوب واحد وهذا سجلت بوضوح على أساس مضان المتوقع للخلايا في هذا الأنبوب، منذ توقيع مضان من هذه المجموعة ستحدد هذا الببتيد (كما في الجدول 1 على سبيل المثال).
      4. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. غسل الخلايا
      1. إضافة 5 مل من الجليد الباردة (4 ° C) RPMI تحتوي على 5٪ FCS لتعليق الخلية وResuspend الخلايا بواسطة قلب الأنبوب. الأساس الذي تقوم عليه بعناية تعليق الخلية مع 3 مل من الجليد الباردة (4 ° C) FCS.
      2. الرواسب الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. استخدام التسارع والكبح بطيئة لضمان واجهة من FCS ويتم الحفاظ على حل تعليق خلية.
      3. نضح بعناية قبالة RPMI ثمالسفح مع ماصة نقل، وترك الخلايا الكريات غسلها دون عائق. ملاحظة: إن استخدام الأساس الذي تقوم عليه FCS لغسل الخلايا يساعد على ضمان تتم إزالة قدر حل الببتيد من الخلايا ممكن، وبالتالي الحد من التعرض للسكان الخلية إلى الببتيدات حرة متعددة عندما يتم تجميع الخلايا.
      4. غسل خلايا مرة أخرى: Resuspend وكريات خلية في 10 مل من 4 درجات مئوية RPMI تحتوي على 5٪ FCS. الرواسب الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تخلصي supernatants.
      5. تجمع كل سكان الخلية معا في أنبوب واحد مع ماصة باستخدام 6 مل من 4 درجات مئوية RPMI تحتوي على 5٪ FCS. الرواسب المجمعة الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. نضح قبالة طاف مع ماصة نقل.
  6. CPD وضع العلامات الخليوي
    ملاحظة: عند هذه النقطة يمكن أن تتولد ستة مكررات فحص داخل الخلايا عن طريق وضع العلامات الببتيد نابض مع 6 تركيزات مختلفة من وثيقة البرنامج القطري.
    1. إضافة 11.4 مل من 20 درجة مئويةRPMI تحتوي على 5٪ FCS لبيليه الخلية المجمعة و resuspend بدقة باستخدام ماصة.
    2. إضافة 1.9 مل من تعليق خلية إلى 6، 10 مل أنابيب المسمى بالعربية، مع الحرص على عدم الرطب النصف العلوي من الأنابيب.
    3. لتسمية الخلايا مع وثيقة البرنامج القطري، وإزالة الغطاء أنبوب ووضع أنبوب أفقيا.
    4. إضافة 92 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى الجزء غير مبلل في الجزء العلوي من الأنبوب، وهذه الإضافة الأسهم وثيقة البرنامج القطري (انظر الجدول رقم 4 لكمية من محلول المخزون المسندة إلى كل أنبوب).
    5. غطاء الأنبوب وخلط تعليق خلية مع الصبغة بسرعة وبدقة من قبل vortexing.
    6. . لا 2.6.3-2.6.5 الخطوات لحلول الأوراق المالية من وثيقة البرنامج القطري في أنابيب المعين هو موضح في الجدول رقم 4 ملاحظة: خلافا CFSE وCTV، تركيز وضع العلامات وثيقة البرنامج القطري ليست متصلة على وجه التحديد خطيا إلى كثافة مضان الناتجة من الخلايا المسمى، و لذلك كان تركيز وضع العلامات المستخدمة للحصول على مسافة واحدة من قمم الفلورسنت العديد من السكان المسمىتحدد تجريبيا (انظر الجدول 4).
    7. احتضان الخلايا لمدة لا تقل عن 5 دقائق على RT (20 درجة مئوية).
    8. غسل الخلايا مرتين: Resuspend الخلايا إلى 10 مل مع 20 ° C RPMI تحتوي على 5٪ FCS. الرواسب الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة عند 20 درجة مئوية. نضح قبالة طاف مع ماصة نقل. تكرار.
    9. تجمع جميع الخلايا معا في أنبوب واحد باستخدام 8 مل 4 ° C RPMI تحتوي على 5٪ FCS مع ماصة. الرواسب المجمعة الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، ونضح قبالة طاف مع ماصة نقل.
  7. (اختياري) PKH-26 وضع العلامات الخليوي
    ملاحظة: إذا اتفاقيات التجارة الحرة لا يمكن بناؤها مع الخلايا معربا عن اختلاف النمط الخيفي CD45 لاستضافة الفئران، فإنها يمكن أن يكون المسمى مع PKH-26 للسماح التمييز ضدهم من خلايا المتلقي.
    1. إضافة 2.9 مل من 20 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني لبيليه الخلية المجمعة و resuspend بدقة مع ماصة.
    2. إضافة تعليق الخلية إلى أين المبللة 10 مل أنبوب، مع الحرص على عدم الرطب النصف العلوي من الأنبوب.
    3. إزالة الغطاء أنبوب ووضع أنبوب أفقيا.
    4. إضافة 58 ميكرولتر من مخفف C (في الصبغة عدة PKH-26) إلى الجزء غير مبلل في الجزء العلوي من الأنبوب، وهذا إضافة 42 ميكرولتر من 1 ملم الأسهم PKH-26.
    5. غطاء الأنبوب وتخلط مع حل الخلية الصبغة بدقة من قبل vortexing.
    6. احتضان الخلايا لمدة لا تقل عن 10 دقيقة في RT (20 درجة مئوية).
    7. غسل الخلايا مرتين: Resuspend الخلايا إلى 10 مل مع 20 ° C RPMI تحتوي على 5٪ FCS. الرواسب الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة عند 20 درجة مئوية. نضح قبالة طاف مع ماصة نقل. تكرار.
  8. اتفاقيات التجارة الحرة عن طريق الحقن في الحيوانات المضيفة
    ملاحظة: لقياس استجابات الخلايا T في الجسم الحي، يتم حقن الحيوانات في اتفاقيات التجارة الحرة التي لديها استجابة مناعية نشطة وتركت في الموقع لمدة تصل إلى 24 ساعة. فمن الأهمية بمكان أن يتم حقن اتفاقيات التجارة الحرة أيضا في حيوان السذاجة كعنصر تحكم السلبية.
    1. عد و resuspend الخلايا في 2.5 × 10 8 خلايا لكل مل في برنامج تلفزيوني. ضخ 200 ميكرولتر من الخلايا في الفئران عن طريق الوريد المضيفة، بما في ذلك حيوان السذاجة كمجموعة تحكم.

3. التدفق الخلوي

  1. 18-24 ساعة بعد الحقن FTA حصاد الدم أو الطحال (أو الأنسجة الأخرى من الفائدة) من الفئران المضيف.
  2. إعداد تعليق خلية واحدة من الأنسجة التي كتبها يهرس من خلال 70 ميكرون مسامي غربال مع 5 مل حقنة الغطاس.
  3. الخلايا resuspend على ما يصل إلى 65 × 10 6 خلية / مل في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA.
  4. الاستغناء 100 ميكرولتر مأخوذة من تعليق خلية في آبار من لوحة microtitre لوضع العلامات الأجسام المضادة.
  5. خلايا التسمية مع تألقي المسمى الأضداد وتحقيقات الجدوى الفلورسنت مع مضان متوافق طيفيا لCFSE، CTV وثيقة البرنامج القطري. ملاحظة: الأجسام المضادة إلى B علامات الخلية مثل B220 وعلامات تفعيل مثل CD69 ضرورية لقياس تنشيط الخلايا B إذا باستخدام FTA لقياس استجابات الخلايا T H 2. وتشمل الأجسام المضادة لCD45.1 و / أو CD45.2 إذا اتفاقيات التجارة الحرة والفئران المضيف لديها اختلاف النمط الخيفي CD45.
  6. إضافة 100 ميكرولتر من محلول المخزون 2X الأصباغ الأجسام المضادة / بقاء (في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA) إلى 100 ميكرولتر مأخوذة من الخلايا، تخلط جيدا واحتضان على الجليد (4 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
  7. غسل الخلايا: خلايا الرواسب بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة طاف. الخلايا resuspend في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA، وخلايا الرواسب بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة طاف.
  8. Resuspend الخلايا في الحجم الكلي لل400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA، وخلايا التصفية من خلال شبكة 70 ميكرون وتحليل التدفق الخلوي في تدفق عداد الكريات قادرة على الكشف عن الأصباغ وتقارن الفلورسنت ذات الصلة. جمع ما يصل إلى 3 × 10 6 اللمفاويات الأحداث من أجل حل كل عنقود خلية اتفاقية التجارة الحرة والحصول على ما يكفي من الخلايا لاحصاءتحليل كال. ملاحظة: تأكد من أن جميع الضوابط النموذجية (مثل التحكم الملون واحد) للالتدفق الخلوي يعملون. عادة، يتطلب CFSE الإثارة من مصدر الليزر الأزرق (عادة في 488 نانومتر) والكشف مع الفرقة تمرير مرشحات طيرانها فوق 520 نانومتر؛ يتطلب CTV الإثارة من مصدر الليزر البنفسجي (عادة في 405 نانومتر) والكشف مع الفرقة تمرير مرشحات طيرانها فوق 450 نانومتر؛ وثيقة البرنامج القطري يتطلب الإثارة من مصدر ليزر أحمر (عادة في 633 نانومتر أو 640 نانومتر) والكشف مع الفرقة تمرير مرشحات طيرانها فوق 670 نانومتر.

4. تحليل البيانات

  1. تحليل التدفق الخلوي البيانات باستخدام معيار البرمجيات التدفق الخلوي (انظر نتيجة ممثل للحصول على مثال من هذا النوع من استراتيجية النابضة العاملين).
  2. لقتل محددة٪، وحساب عدد الخلايا في كل مجموعة خلية اتفاقية التجارة الحرة مع نابض MHC-I-الببتيدات ملزمة الصف والمجموعات اتفاقية التجارة الحرة التي لم الببتيد نابض ("النيل") واستخدام الصيغة التالية لحساب٪ مقتل محددة.
    ٪ مقتل محددة figure-protocol-1
    ملاحظة: في الصيغة أعلاه "تستعد" يشير إلى أهداف من الحيوانات التي يعتقد أن لديهم استجابة مناعية ضد الببتيدات المستهدفة، "السذاجة" يشير إلى أهداف من الحيوانات السذاجة، "ببتيد" يشير إلى أهداف نابض مع الببتيدات و "لا شيء" يشير إلى أهداف لا نابض مع أي الببتيدات.
  3. لتنشيط الخلايا B كمقياس للT H النشاط، وحساب متوسط ​​كثافة مضان هندسية (GMFI) من CD69 الضد مضان على خلايا B اتفاقية التجارة الحرة مع نابض الببتيدات MHC الدرجة الثانية ملزم في الحيوانات "معبي" وهذا من طرح GMFI من CD69 التعبير على الخلايا المناظرة FTA B في الحيوانات "ساذجة" لإعطاء مقياس T H النشاط.
  4. من الإحصاءات التي تم إنشاؤها في الخطوات 4.2 و 4.3، استخدامبرنامج جداول البيانات الحسابية مثل GraphPad بريزم لحساب غيرها من العوامل الكمية والنوعية مثل منطقة تحت منحنى وEC 50 (في عمق صفا لكيفية يتم تنفيذ هذه الحسابات لمفوضية الاتحاد الأفريقي ويمكن الاطلاع على
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm؟stat_area_under_the_curve.htm، وEC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. HTM؟ reg_the_ec50.htm).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كمثال على استخدام مقايسة اتفاقية التجارة الحرة، وتحصين BALB / ج الماوس مع فيروس اللقاحية المؤتلف (VV) معربا عن فيروس نقص المناعة البشرية الحواتم-I (VV-HIV) والردود على فيروس نقص المناعة البشرية الحواتم CTL-I، الكمامة، موت الكمامة، تم تقييم الحياة الفطرية وبول، وVV CTL الحواتم F2L وF2L موت، وفيروس نقص المناعة البشرية حاتمة الخلايا T-I H، الكمامة ث (كما هو موضح في 2) باستخدام 252 معلمة FTA فحص (الشكل 1B). لا يتم التعبير عن المتغيرات حاتمة من ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الاستفادة من اتفاقية التجارة الحرة القائمة على المقايسات هو أنها تسمح للتمييز من> 250 السكان الخلية المستهدفة قابلة للحياة وظيفية بالكامل من حيوان مضيف واحد بواسطة التدفق الخلوي. هذا يوفر مستوى من التعقيد لفي الجسم الحي تتدفق المقايسات مقرها الخلوي الذي لم يكن ممكنا من قبل. ويبرز هذا في التجارب على الحيوانات 2 هو مبين أعلاه، حيث يمكن رصد الاستجابات إلى 7 الحواتم الفيروسية متميزة في 6 تجمعات في مكررات من 6 في وقت واحد في حيوان واحد مما يتيح المعلمات مثل مفوضية الاتحاد ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل عن طريق منح المشروع # 1010395 (بكريل وCP) و # 525431 (CR)، وبرنامج المنح # 455395 (CP) من المجلس الوطني للبحوث الصحية والطبية في أستراليا، وهو المركز الأسترالي للالتهاب الكبد وفيروس نقص المناعة البشرية الفيروسات EOI 2012 منحة (CR وRJJ) ومنحة من مؤسسة غوردون وجريتل قسم مشتركي DSL (بكريل وCR). نود أن نشكر Harpreet فوهرا ومايكل Devoy لصيانتها ممتازة من المختبر JCSMR نظام مراقبة الأصول الميدانية، ومرفق الاسترالية مؤسسة أبحاث السرطان الجزيئية البيولوجية للموارد، JCSMR، انو، لتخليق الببتيد، والدكتور ديفيد بويل، معامل CSIRO للصحة الحيوانية، جيلونج، أستراليا لتوفير الوالد الأسهم قاح فيروس نقص المناعة البشرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
RPMISigmaR8758
مصل ربلة الساق الجنينيةSeranaFCS-500
CTVInvitrogenC34557
CFDA ، SEInvitrogenC1157
CPDeBioscience65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5eBioscience110730
anti-CD69 البنفسجي اللامع 605Biolegend104529
PKH-26SigmaPKH26GL-1KT
VortexScientific Industries Inc
طرد مركزيمقياس التدفق الخلوي Eppendorf
(Fortessa أو ما يعادله مع مصدر ليزر أزرق وأحمر وبنفسجي)BD Bioscience
جهاز

المراجع

  1. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
  2. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
  3. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
  4. Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
  5. Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
  6. Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
  7. Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
  8. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
  9. Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
  10. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
  11. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
  13. Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
  14. Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
  15. Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
  16. Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
  17. von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
  18. Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
  19. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
  20. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
  21. Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  22. Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CellTrace Violet CFSE CPD
استخدام المصابيح الفلورية الهدف صالحة لتقييم T الردود الخليوي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.