يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الحمض النووي RNA-مجتمعة نيون

27.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51628

⸱

يونيو 14, 2014

 , 
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

فلوري التهجين الموضع (FISH) في يسمح للكشف عن الأحماض النووية في بيئتها الأصلية داخل الخلايا. نحن هنا وصف بروتوكول لمجتمعة، كشف في وقت واحد من الحمض النووي الريبي والحمض النووي عن طريق FISH، والتي يمكن استخدامها لدراسة الكروموزوم (اكس) في تعطيل الماوس الخلايا الجذعية الجنينية.

الملخص

فلوري التهجين الموضع (FISH) في هي تقنية الجزيئية التي تمكن الكشف عن الأحماض النووية في خلايا. وكثيرا ما يستخدم الحمض النووي FISH في علم الوراثة الخلوية وتشخيص السرطان، ويمكن الكشف عن الانحرافات من الجينوم، والذي لديه كثير من الأحيان آثار طبية هامة. RNA FISH يمكن استخدامها للكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي في الخلايا، وقدمت معلومات هامة في تنظيم التعبير الجيني. الجمع بين DNA و RNA FISH ضمن نفس الخلية يمثل تحديا تقنيا، والظروف المناسبة لالحمض النووي FISH قد تكون قاسية جدا بالنسبة الهشة، واحد الذين تقطعت بهم السبل جزيئات الحمض النووي الريبي. ونحن هنا نقدم بروتوكول يسهل تطبيقها والتي تمكن المشترك، وكشف في وقت واحد من الحمض النووي الريبي والحمض النووي Xist المشفرة بواسطة X الكروموسومات. يمكن المرجح أن يتم تطبيق هذا الحمض النووي RNA-FISH البروتوكول جنبا إلى جنب مع الأنظمة الأخرى التي يحتاج فيها كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي ليتم الكشف.

المقدمة

دراسة الخلايا والأنسجة عن طريق فلوري التهجين الموضع (FISH) في، منذ بدء العمل به في أواخر 1970s 1، سمح الباحثون لدراسة الجينات، وتنظيم الكروماتين والتعبير الجيني على مستوى التحت خلوية. وكثيرا ما يستخدم الحمض النووي FISH في علم الوراثة الخلوية، تنميط نووي 2، 3 تشخيص السرطان وما قبل الزرع الفحص الجيني 4، ولها دور مهم في مجال الأبحاث الجزيئية 5-6 لأنه يسمح للكشف عن الأحماض النووية في بيئتها الأصلية. واحد تحليل التعبير الخلية عن طريق الحمض النووي الريبي FISH يمكن الكشف عن النصوص الأولية المحلية والرنا غير المكودة يتم نسخها من الكروموسومات، ويوفر مزايا لغيرها من التقنيات التي تقيم التعبير الجيني على مستوى السكان، بما في ذلك على سبيل المثال الكمي RT-PCR، تحليل الجينوم واسعة التعبير أو النشاف الشمالية . من خلال وضع تصور النصوص الحمض النووي الريبي التي تنشأ مباشرة من مواقعها الأصلية، فقد كان على سبيل المثاللاحظت أن التعبير الجيني هو مؤشر ستوكاستيك 7، ويمكن أن يكون في بعض الأحيان محددة أليل 8. والتحسينات في تقنية حتى يسمح الكشف النوعي والكمي لجزيئات مرنا واحد داخل الخلايا 9-11.

المبدأ الأساسي للFISH يتكون من تهجين الأحماض النووية داخل الخلية إلى التحقيق الحمض النووي عن طريق محددة للغاية واتسون وكريك قاعدة الاقتران. التحقيق يمكن أن تكون إما مباشرة أو غير مباشرة الكشف، مما أدى إلى إشارة التي يمكن تصور مجهريا. وتألفت المحاولات الأولية لتحقيقات المسمى بالإشعاع، والتي كان من العيوب على أساس قضايا السلامة، والقرار المكانية محدودة والقدرة على الكشف عن هدف واحد فقط في كل مرة 12-14. التطور اللاحق للتسميات امشع، بما في ذلك fluorochromes، (Hapten) الناشب والإنزيمات، وسمح انتشار استخدام واسعة من الأسماك كأسلوب روتين البيولوجيا الجزيئية. يمكن إما التحقيق FISH يكون المسمى مباشرة مع fluorochرميس بواسطة الربط الكيميائي للجزيئات الحمض النووي الفلورسنت لتسلسل 15 والتكامل من النيوكليوتيدات fluorescently المسمى 16-19، أو التحقيق يمكن تصور بشكل غير مباشر بعد دمج (Hapten) الناشب (بما في ذلك البيوتين وdigoxigenin) وكشف المناعية (Hapten) الناشب عن طريق الأجسام المضادة المحددة ناشبة مترافق ل مراسل الفلورسنت جزيئات 20-21. النهج الأخير يسمح إشارة التضخيم باستخدام عدة طبقات من الأجسام المضادة fluorescently المسمى والتي تستخدم لتعزيز الإشارة الأصلية، وتمكن من الكشف عن الحمض النووي الريبي الأنواع التي يتم التعبير عنها في مستويات منخفضة. من خلال الجمع بين تقنيات وضع العلامات المباشرة وغير المباشرة ومختلف (Hapten) الناشب عدة أهداف يمكن تصور في وقت واحد داخل نفس الخلية.

واحدة من أهم الخطوات في بروتوكولات FISH هو التهجين من لجنة التحقيق إلى هدفه. على الرغم من الناحية النظرية، فإن التحقيق على وجه التحديد ربط فقط إلى هدفه، في الممارسة العملية، وهذا التحديدهو لم يتحقق دائما، كما تحقيقات قد ربط مناطق متماثلة، وسوف الظروف التهجين لا يكون دائما مثاليا لبعض الأنواع المنطقة DNA أو الحمض النووي الريبي. ولأهمية خاصة يغسل بعد التهجين هي، لأنها يمكن أن تزيد من صرامة الإجراءات FISH، ويمكن أن تمنع ملزم غير محدد من تحقيقات FISH، الذي من شأنه أن يؤدي إلى ارتفاع مستوى الضوضاء في الخلفية. كما تقطعت بهم السبل جزيئات الحمض النووي الريبي واحد يمكن بسهولة أن تكون المهجنة إلى التحقيق FISH. في المقابل، فإن جزيء الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل يحتاج أولا خطوة تمسخ، وبعد ذلك يمكن اجراء تحقيق هجن. وعادة ما يتحقق هذا عن طريق تسخين العينة، والذي ينتج في تمسخ من الحمض النووي. ومع ذلك، في ظل هذه الظروف القاسية، قد يتم فقدان الهشة، واحد الذين تقطعت بهم السبل جزيئات الحمض النووي الريبي. لذلك، يتطلب الحمض النووي RNA-مجتمعة FISH الأمثل كبيرة من الظروف، وأكثر تحديا تقنيا مقارنة الكشف منفصلة من الحمض النووي الريبي فقط أو الحمض النووي.

نحن هنا حاضراتا بروتوكول مفصلة من جنبا إلى جنب، في وقت واحد FISH الحمض النووي RNA-الذي سمح لنا لدراسة الكروموزوم (اكس) تعطيل (XCI) في التفريق فئران الخلايا الجذعية الجنينية 22-24. XCI هو آلية جينية حاسمة للتنمية الجنينية الإناث 25، والنتائج في الكروماتين المغاير، وبالتالي إسكات واحد من اثنين من الكروموزومات X في الأفراد الإناث 26-27. الأساسية لهذه العملية هو الحمض النووي الريبي Xist غير المكودة 28-30، والتي يتم تنظيمها من قبل RNF12 22-23 وREX1 24 البروتينات. التعبير Xist يصبح غير نشط upregulated على الكروموزوم (اكس) في المستقبل (شي) أثناء التطور الجنيني أو على تمايز الخلايا ES في المختبر ، ويمكن أن ينتشر على طول الكروموسوم X، وبالتالي جذب لونين إعادة عرض الانزيمات التي تؤدي إلى إيقاف النسخي من الكروموزوم (اكس) 31. نشر هذا Xist RNA يمكن تصور بواسطة الحمض النووي الريبي FISH بوصفها طلاء من الصبغي Xبعض، والذي يشار إليه أيضا باسم سحابة Xist. منذ خلايا ES الإناث يمكن أن تفقد واحدا من الكروموسومات X، نظرا لعدم الاستقرار الجيني، ونحن وآخرون يعملون مجتمعة الحمض النووي RNA-FISH لدراسة XCI، للتأكد من أن يتم تقييم الخلايا فقط karyotypically مستقرة في تحليل هذه العملية الهامة 22،32 -34. كما هو الحال مع كل تقنية البيولوجيا الجزيئية، وقد نشرت عدة بروتوكولات مختلفة ممتازة 35-38. هنا نقدم أسلوبنا، بدءا من تحريض التمايز في الخلايا ES الماوس، تثبيت الخلايا، ووضع العلامات تحقيقات FISH نيك الترجمة، قبل المعاملة من خلايا ثابتة للسماح permeabilization واللاحقة امتصاص التحقيق، التهجين من لجنة التحقيق إلى الهدف، وأخيرا كشف التحقيق عن طريق الأجسام المضادة fluorescently المسمى. بروتوكول هنا قدمت يسمح للكشف المؤمنين من Xist الحمض النووي الريبي والكروموزوم (اكس) في غضون يومين، وأساسيات هذه التقنية يمكن المرجح أن تتكيف مع التمديدنظم لها ومجالات البحث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحريض التمايز في الخلايا الجذعية الجنينية أنثى للحث على كروموسوم X التعطيل

ملاحظة: تزرع الخلايا الجذعية الجنينية أنثى (متوفر عند الطلب) في ظل الظروف خلية ES القياسية على أطباق الثقافة مهيلم المغلفة مع الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs). نحن هنا نفترض أن القارئ على دراية تقنيات زراعة الخلايا القياسية 39-41. للحث على التمايز، وسيتم فصل خلايا ES تزرع في أطباق T25 من MEFs، وسيتم مطلي التمايز في المتوسط.

  1. إزالة ES المتوسطة من زراعة الخلايا ES، ويغسل مرتين مع PBS ثقافة الخلية.
  2. إضافة 1.5 مل التربسين EDTA-(استعد مسبقا إلى 37 درجة مئوية)، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. بعد 3.5 دقيقة، ويهز الطبق برفق لتفريق المستعمرات.
  3. إبطال نشاط التربسين EDTA-بإضافة 3.5 مل من المتوسط ​​إلى تمايز الخلايا. خلايا ماصة صعودا وهبوطا للحصول على حل وحيد الخلية، وجمعفي أنبوب 15 مل. تدور لمدة 5 دقائق في 200 x ج، وجمع الخلايا في 10 مل من التمايز المتوسطة.
  4. إضافة تعليق الخلية إلى طبق ثقافة غير مهيلم، واحتضان لمدة 1 ساعة في حاضنة الثقافة الخلية. ملاحظة: سوف MEFs تكون قادرة على الانضمام إلى صحن الثقافة غير مهيلم، في حين أن خلايا ES ستبقى في التعليق.
  5. في غضون ذلك، إضافة coverslips الزجاج معقمة (24 × 24 مم) إلى 6 لوحات جيدا، إضافة 0.2٪ الجيلاتين، واحتضان لمدة 5 دقائق في الحد الأدنى من درجة حرارة الغرفة.
  6. بعد 1 ساعة، وجمع طاف ثقافة الخلية ES قبل مطلي، والتي سوف تتكون أساسا من عدم الالتزام خلايا ES. لوحة خلايا ES إلى 6 لوحات جيدة تحتوي على coverslips. ملاحظة: استخدام ⅙ عشر من صحن متكدسة T25 لمدة 6 آبار لوحة 6 جيدا. وهذا سوف يسمح تمايز متموجة جيدا بعد 3 أيام من التمايز. تغيير المتوسطة على أساس يومي. للدورات وقتا أطول التمايز، لوحة ما قبل مطلي خلايا ES في التمايز المتوسطة في الأطباق البكتيرية، وincubيأكلون على شاكر الخلية دمجها في حاضنة الثقافة الخلية. وسوف تسمح هذه الخلايا لتشكيل هيئات مضغي الشكل، والتي يمكن مطلي إلى coverslips 1-2 أيام قبل التثبيت.

2. تثبيت خلايا ES المتباينة لاحقة تحليل الحمض النووي الريبي DNA-FISH

  1. إزالة التمايز المتوسطة من ثقافات التمايز، ويغسل مرتين مع PBS ثقافة الخلية. ملاحظة: إضافة PBS بعناية لمنع الخلايا جرفت.
  2. إزالة خلية ثقافة برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا بإضافة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) / برنامج تلفزيوني، واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تنبيه: PFA هي سامة ويمكن أن تسبب مخاطر صحية كبيرة عندما يتم استنشاقه أو عندما تكون في اتصال على الجلد أو العينين. علاوة على ذلك، PFA هو مسرطنة.
  3. إزالة 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني، وغسل coverslips 3X مع الايثانول 70٪. ملاحظة: غسل الصحيح هو المهم، لأن أي أثر لمنهاج العمل سوف تتداخل مع الخطوات اللاحقة FISH. ويمكن تخزين Coverslips في الايثانول 70٪ في -20 درجة مئوية لعدة أشهر قبل Fتحليل ISH.

3. صفها من تحقيقات الحمض النووي للتجارب FISH

ملاحظة: الحصول على جزء من الحمض النووي والجينات في المصالح (الحد الأدنى من طول> 2 كيلو بايت لRNA FISH، أو> 20 كيلو بايت لFISH DNA)، أو BAC تغطي الجين من الفائدة. للكشف عن الحمض النووي الريبي، يمكن للمسبار أصغر تكون كافية بالمقارنة مع اكتشاف الحمض النووي، لأن معظم النسخ من المرجح أن يؤدي في محاضر متعددة، والتي يمكن أن يتم الكشف عن في وقت واحد. للإشارة قوية على واحدة حبلا الحمض النووي نسخة، لا بد من التحقيق لفترة أطول، لتكون قادرة على الكشف عن وجود عدد كاف من (Hapten) الناشب يدمج. ويفضل أن يتم اختيار منطقة الجيني غير كتب لتصميم مسبار الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك، عند استخدام مسبار أصغر للكشف عن الحمض النووي الريبي، سيتم منع أن مواضع الجيني الذي يتم نسخها الحمض النووي الريبي ويجري الكشف في نهج FISH الحمض النووي RNA-مجتمعة، رغم أن هذا لا يمكن استبعاد تماما. للكشف عن الماوس Xist، تم استخدام [كدنا] المسبار 5.5 كيلو بايت. لديتection من الكروموزوم (اكس)، ويمكن استخدام عدة تحقيقات BAC. وقد تم الحصول على نتائج جيدة مع خليط من BAC RP23-100E1 وBAC-CT7 474E4، والتي تقع على مقربة من موضع Xist. اعتمادا على الجينات أو الكروموسومات من الفائدة، قد يكون مطلوبا عدة تحقيقات مختلفة للحصول على أفضل النتائج. كلما العمل مع المواد التي سيتم استخدامها لRNA-FISH، استخدم نصائح عقيمة التصفية، ريبونوكلياز H 2 O الحرة، والعمل في بيئة نظيفة.

  1. تأخذ 1 ميكروغرام من الحمض النووي وتمييع في H 2 O في حجم ما مجموعه 16 ميكرولتر. إضافة 4 ميكرولتر من digoxigenin أو حل وضع العلامات البيوتين (انظر الكواشف)، ومزيج من قبل vortexing واحتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. ملاحظة: سيتم الآن إدراج البيوتين أو النيوكليوتيدات المسمى digoxigenin التي كتبها نيك الترجمة.
  2. في هذه الأثناء، وإعداد أعمدة G50 لإزالة النيوكليوتيدات غير متكاملة. أخذ حقنة 2 مل، وإزالة الختام، وإضافة القطن المعقمة في حقنة. إضافة كرات G50 في حل رس ملء حقنة، ضع الحقنة في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 642 x ج لمدة 1 دقيقة. ملاحظة: يجب الآن شغل حوالي 80٪ من المحاقن مع G50. أكرر عند أقل G50 موجودا.
  3. بعد 90 دقيقة، وإضافة 40 ميكرولتر من H 2 O إلى نيك الترجمة خليط التفاعل، وإضافة رد الفعل إلى العمود G50. إضافة أنبوب فارغ تحت العمود، وأجهزة الطرد المركزي في 642 x ج لمدة 2 دقيقة. جمع تدفق من خلال أنبوب في رد الفعل.
  4. قياس حجم تدفق من خلال مع ماصة، وإضافة H 2 O للتوصل إلى حجم مجموعه 200 ميكرولتر. يعجل تدفق من خلال من خلال إضافة 13.3 ميكرولتر الحمض النووي الحيوانات المنوية السلمون (10 ملغ / مل)، 13.3 ميكرولتر الحمض الريبي النووي النقال الخميرة (10 ملغ / مل)، 26.7 ميكرولتر الماوس المهد-1 الحمض النووي (1 ملغ / مل) و 28 ميكرولتر 2 M NAAC، ودرجة الحموضة 5.6. مزيج من قبل vortexing، وإضافة 533 ميكرولتر الجليد الباردة الإيثانول بنسبة 100٪. يهز الأنبوب، وأجهزة الطرد المركزي في 16،200 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  5. إزالة طاف، ويغسل بيليه مرتين مع الايثانول 70٪. أجهزة الطرد المركزي في 16،200 x ج لمدة 5 دقائق في4 درجات مئوية، والهواء الجاف بيليه. إضافة 50 ميكرولتر من حل 50 + التهجين، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتسهيل تذويب. ويمكن تخزين وصفت التحقيق لعدة سنوات في -20 درجة مئوية. ملاحظة: تحذير: 50 + حل التهجين يحتوي الفورماميد، التي هي سامة، يمكن أن تهيج الجلد والعينين والجهاز التنفسي، وأيضا مشوه.

4. Permeabilization، ما قبل المعالجة والتهجين من خلايا ثابتة لمتحدة الحمض النووي RNA-FISH

  1. ترطيب خلايا ثابتة coverslips على، عن طريق إزالة 70٪ من الإيثانول وإضافة خلية ثقافة PBS إلى 6 لوحات جيدة. احتضان لمدة 5 دقائق. تكرار في مجموع ثلاث مرات.
  2. إزالة خلية ثقافة برنامج تلفزيوني، وإضافة 0.2٪ البيبسين إلى 6 لوحات جيدة، لpermeabilize الخلايا. احتضان 6 لوحات جيدا في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. إزالة البيبسين، وتعطيل مع ريبونوكلياز H 2 O. مجانا
  3. الخلايا في مرحلة ما بعد الإصلاح التي يحتضنها مع PFA 4٪ / برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد fixatiعلى، ويغسل مرتين مع خلية ثقافة برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  4. يذوى الخلايا التي يحتضنها مع الايثانول 70٪ لمدة 3 دقائق، والإيثانول 90٪ لمدة 3 دقائق والإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 3 دقائق. نقل coverslips من 6 لوحات جيدة، وcoverslips الهواء الجاف لعدة دقائق.
  5. الخلايا التي يحتضنها سن coverslips عند 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على طبق من الحرارة.
  6. قبل هجن FISH التحقيق مع الماوس المهد-1 الحمض النووي عن طريق جمع كل ساترة ليتم تحليلها، 25 ميكرولتر من حل 50 + التهجين، 0.5 ميكرولتر الماوس المهد-1 الحمض النووي، 1 ميكرولتر من البيوتين المسمى Xist التحقيق و1 ميكرولتر من digoxigenin وصفت التحقيق BAC كشف الكروموزوم (اكس). مزيج من قبل vortexing، وتفسد على 99 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. احتضان فورا عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، للسماح المهد-1 الحمض النووي لهجن لتكرار متواليات موجودة في التحقيقات.
  7. بعد الشيخوخة، بقعة 50 ميكرولتر من العازلة تمسخ (تتألف من 70٪ formamide/2x العازلة الفوسفات SSC/10 ملم) على شريحة زجاجية، ووضع على رأس coverslips مع الخلايا التي تواجه طوارس المخزن المؤقت تمسخ. احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
  8. إضافة coverslips إلى 6 لوحات جيدة، والخلايا آخر الإصلاح، التي يحتضنها في الجليد الباردة الايثانول 70٪ لمدة 5 دقائق.
  9. يذوى الخلايا عن طريق الحضانة لاحقة في الايثانول 70٪ لمدة 3 دقائق، والإيثانول 90٪ لمدة 3 دقائق والإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 3 دقائق. إزالة coverslips من 6 لوحات جيدة، والسماح الهواء الجاف لعدة دقائق.
  10. بقعة التحقيق المهجنة مسبقا على شريحة زجاجية، واحتضان ساترة على القمة. مكان الشرائح في غرفة ترطيب مليئة 50 مل 50٪ formamide/2x SSC، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

5. يغسل بعد التهجين والكشف عن الأجسام المضادة وساطة من مسبار

  1. ملء 6 لوحات جيدا مع 2X SSC، وقبل دافئ حتى 42 درجة مئوية. إضافة coverslips بعد الحضانة بين عشية وضحاها، واحتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. إزالة 2X SSC، واحتضان coverslips مع 50٪ SSC formamide/2x لمدة 10 دقيقة في 42 درجة مئوية. تكرار في مجموع 3 مرات (30 دقيقة من الغسيل تماما).
  3. إزالة 50٪ formamide/2x SSC، وتغسل الشرائح مع تريس المالحة توين (تجارة الرقيق عبر الأطلسي) ل2 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. بقعة 50 ميكرولتر تريس المالحة BSA (TSBSA) في ساترة على الشرائح الزجاجية الجديدة، واحتضان coverslips رأسا على عقب لعرقلة خلال 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة TST-مرطب.
  5. نقل coverslips إلى 6 لوحات جيدا، وغسل 2 × 5 دقائق مع تجارة الرقيق عبر الأطلسي.
  6. بقعة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأغنام المضادة للحفر (1:500 في TSBSA) في ساترة على الشرائح الزجاجية الجديدة، واحتضان coverslips رأسا على عقب للخطوة الحضانة لأول مرة خلال 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة TST-مرطب.
  7. نقل coverslips إلى 6 لوحات جيدا، وغسل 2 × 5 دقائق مع تجارة الرقيق عبر الأطلسي.
  8. بقعة 50 ميكرولتر من أرنب المضادة للالأغنام الضد مترافق مع FITC (1:250 في TSBSA) في ساترة على الشرائح الزجاجية الجديدة، واحتضان coverslips رأسا على عقب للخطوة الثانية الحضانة خلال 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة TST-مرطب .
  9. عبرفر coverslips إلى 6 لوحات جيدا، وغسل 2 × 5 دقائق مع تجارة الرقيق عبر الأطلسي.
  10. بقعة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الماعز المضادة للأرنب مترافق مع FITC (1:250 في TSBSA) في ساترة على الشرائح الزجاجية الجديدة، واحتضان coverslips رأسا على عقب للخطوة الثالثة الحضانة خلال 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة TST-مرطب .
  11. نقل coverslips إلى 6 لوحات جيدا، وغسل 2 × 5 دقائق مع تجارة الرقيق عبر الأطلسي.
  12. بقعة 50 ميكرولتر من الماوس المضادة للأجسام المضادة البيوتين (1:200 في TSBSA) في ساترة على الشرائح الزجاجية الجديدة، واحتضان coverslips رأسا على عقب للخطوة الحضانة الرابعة خلال 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة TST-مرطب.
  13. نقل coverslips إلى 6 لوحات جيدا، وغسل 2 × 5 دقائق مع تجارة الرقيق عبر الأطلسي.
  14. بقعة 50 ميكرولتر من حمار مكافحة فأر الضد مترافق مع رودامين (1:250 في TSBSA) في ساترة على الشرائح الزجاجية الجديدة، واحتضان coverslips رأسا على عقب للخطوة الخامسة الحضانة خلال 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام chamb TST-مرطبإيه.
  15. نقل coverslips إلى 6 لوحات جيدا، وغسل 2 × 5 دقائق مع تجارة الرقيق عبر الأطلسي.
  16. بقعة 50 ميكرولتر من الماعز المضادة للالحصان الضد مترافق مع رودامين (1:250 في TSBSA) في ساترة على الشرائح الزجاجية الجديدة، واحتضان coverslips رأسا على عقب للخطوة السادسة الحضانة خلال 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة TST-مرطب . ملاحظة: سوف الضد الماعز المضادة للالحصان التعرف على الأجسام المضادة حمار مكافحة فأر؛ عندما تكون متاحة للباحث، فإن الأجسام المضادة الماعز المضادة للحمار العمل كذلك.
  17. نقل coverslips إلى 6 لوحات جيدا، وغسل 2 × 5 دقائق مع تجارة الرقيق عبر الأطلسي. يغسل 5 دقائق إضافية مع تريس المالحة (TS).
  18. يذوى الخلايا عن طريق الحضانة لاحقة في الايثانول 70٪ لمدة 3 دقائق، والإيثانول 90٪ لمدة 3 دقائق والإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 3 دقائق. إزالة coverslips من 6 لوحات جيدة، والسماح الهواء الجاف لعدة دقائق.
  19. بقعة قطرة من تصاعد المتوسطة مع دابي (انظر الكواشف) على شريحة زجاجية، وإضافة ساترة رأسا على عقب على رأس. ختم الشرائح مع طلاء الأظافر وتقييم نتائج FISH بواسطة المجهر الفلورسنت (الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام بروتوكول المذكورة أعلاه مجتمعة لDNA-RNA FISH، وكنا قادرين على تصور الكروموزوم (اكس) في التفريق تعطيل الخلايا الجذعية الجنينية الإناث. الشكل يبين مثال 1 ممثل لFISH التجربة الحمض النووي RNA-، حيث اكتشفنا كلا Xist (والذي هو بوصفها رؤية ما يسمى Xist RNA سحابة على الكروموزوم (اكس) غير نشط ومتناهية النسخ القاعدية على الكروموزوم (اكس) النشط)، ومنطقة من الكروموزوم (اكس)، الذي يكون مرئيا كإشارة بالغة. لاحظ أن واحدا من إشارات بالغ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الجمع بين الحمض النووي RNA-FISH يمكن أن يكون تحديا من الناحية التقنية، والظروف المناسبة لالحمض النووي FISH يمكن أن تكون قاسية جدا لجزيئات الحمض النووي الريبي أقل استقرارا. وقد تم تطبيق عدة نهج لدراسة كل من الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي في نفس الخلية، التحايل على الحاجة إلى الحضانة في وقت واحد مع تحقيقات الكشف عن كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي. على سبيل المثال، في نهج استعلاء، يتم تنفيذ أول FISH الحمض النووي الريبي، ويتم تصوير الخلايا، ويتم أخذ الإحداثيات. بعد ذلك، ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون جميع الأعضاء السابقين والحاليين في قسم الاستنساخ والتطوير في Erasmus MC على المناقشات المفيدة والمحفزة خلال السنوات الماضية. نود أيضا أن نشكر المراجعين الثلاثة المجهولين على تقديم ملاحظات مفيدة. يتم دعم العمل في مختبر Gribnau بتمويل من مجلس الأبحاث الهولندي (NWO-VICI) ومنحة بدء من ERC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سيتم توفيرالجذعية الجنينية الأنثوية للفأر
الليفية الجنينية للفأرمن أجنة E13.5 ، أو عبر مصادر تجارية على سبيل المثال < / em>
زراعةالخلايا Millipore ESDMEM, 15٪ مصل عجل الجنين, 100 واحد/مل البنسلين, 100 ملغ/مل ستربتومايسين, أحماض أمينية غير أساسية, 0.1 مللي مولار γ-ميركابتو إيثانول, و 1,000 و/مل LIF. تصفية التعقيم والتخزين في 4 &# 176; C لمدة أقصاها 2 أسابيع.
LIFChemiconESG1107
DMEMInvitrogen11960085
مصل العجل الجنينيInvitrogen10099141
البنسلين & ndash ؛ الستربتومايسين (100x)Invitrogen15140-122
الأحماض الأمينية غير الأساسيةInvitrogen11140-050
γ-mercaptoethanolSigma-AldrichM7522
ES تمايز الخلايا المتوسطةIMDM-Glutamax, 15٪ مصل ربلة الساق الجنينية المعطلة بالحرارة, 100 U/مل البنسلين, 100 ملغ/مل ستربتومايسين, الأحماض الأمينية غير الأساسية, 37.8 μ لتر / لتر أحادي الجلسرين و 50 &# 956 ؛ جم / مل حمض الأسكوربيك
IMDM-GlutamaxInvitrogen31980-030
حمض الأسكوربيك (50 مجم / مل)سيجما ألدريتشA4403
أحادي الجلسرينسيجما ألدريتشM6145
أطباق زراعة الخلايا T25Greiner Bio-one690160
أطباق زراعة الخلايا ذات 6 آبارGreiner Bio-one662160
درجة ثقافة الخلايا PBSSigma-AldrichD8537
Trypsin-EDTA 0.25٪ (حجم حجم حجمي) التربسين / 0.2٪ (وزن / حجم) EDTA في PBSGibco25200-056
FalconFalcon352196
24 × 24 مم أغطيةMenzle780882
الجيلاتينSigma-AldrichG1890-100Gإعداد محلول PBS لزراعة الجيلاتين / الخلايا بنسبة 0.2٪ ، والأوتوكلاف
بيبسينسيجما-ألدريتشP7000يخفف إلى 0.2٪ في 0.01 مليون، حمض الهيدروكلوريكال (الرقم الهيدروجيني 2.0)
الإيثانول المطلق 100٪سيجما-ألدريتش32221-2.5 لتريستخدم 100٪ من الإيثانول والمياه الخالية من الحمض النووي الريبي لصنع 70٪ و 90٪ من الإيثانول
، ومياه خالية من الحمض النووي الريبي، أطرافمعقمة TKF7114
باكستر ، رينن بيو كلينGP-L10F ، GP-L200F ، RT-1000F
طقم وضع العلامات على digoxigenin (ترجمة DIG-Nick)مجموعة
(ترجمة البيوتين)Roche11745824910
Sephadex G50Sigma-AldrichG5080
2 مل حقنةBD Plastipak300013
أنابيب Eppendorf القطنية
EppendorfEppendorf30120086
خميرة tRNA 10 مجم / ملInvitrogen15401-029
الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون 10 مجم / ملInvitrogen15632-011
سرير الفأر -1 DNA 1 مجم / ملInvitrogen18440-016
Eppendorf أعلى مقعد الطرد المركزيالدقيق Eppendorfموديل 5417R
Eppendorf جهاز طرد مركزي مبردEppendorfموديل 5810R
2 M NaAc ، درجة الحموضة 5.6Sigma-AldrichS7670
50+ محلول50٪ فورماميد ، 2x SSC ، 50 ملي مولار عازلة فوسفات درجة الحموضة 7 ، 10٪ كبريتات ديكستران درجة الحموضة 7
فورماميدAcros العضوية3272350000
كبريتات ديكسترانFluka31403
10 ملي مولار عازلة الفوسفات ، الرقم الهيدروجيني 7أضف 57.7 مل من 1 M Na2HPO4 و 42.3 مل 1 M NaH2PO4؛ استخدام المياه المعالجة DEPC ومحلول
تمسخ70٪ فورماميد / 2x SSC / 10 ملي مولار عازلة الفوسفات درجة الحموضة 7
توين -20سيجما ألدريتشP2287
2 م تريس درجة الحموضة 7.5 محلول
تریس سالين توين محلول غسيل (TST)100 مل 10x محلول ملحي ، 50 مل 2 م تريس ، 500 & # 956 ؛ ل Tween-20 ، أضف الماء الخالي من RNAse حتى 1 لتر
10x محلوليذوب 85 جم كلوريد الصوديوم في 1 لتر من RNAse خال من H2< / sub>O ، والأوتوكلاف
Tris-saline-BSA (TSBSA)500 & # 956 ؛ ل 10x محلول ملحي ، 250 &# 956 ؛ ل 2 M تريس ، 1 مل 100x BSA ، 3.25 مل خالي من RNAse H2< / sub>O
BSA ، منقى ، 100xنيو إنجلاند بيولابسB9001S
الأغنام المضادة للأجسام المضادة للحفرتستخدم تشخيصاتروش 1: 500 مخففة في TSBSA
الأرانب المضادة للأجسام المضادة للأغنام المقترنة بمختبراتتستخدم 1: 250 مخففة في
الجسم المضاد للماعز TSBSA المضاد للأرانب المقترن ب FITCJackson تستخدم المختبرات1: 250 مخففا في TSBSA
الفأر المضاد للجسم المضاد للبيوتينروش1: 200 مخففا في TSBSA
جسم مضاد للحمار المضاد للفأر المقترن بمختبراتتستخدم 1: 250 مخففا في TSBSA
الأجسام المضادة للماعز المضاد للخيول المقترنة بمختبراتتستخدم 1: 250 مخففا في
محلول غسيل TSBSA Tris-Saline (TS)10 مل 10 منافذ ملحية ، 5 مل 2 م تريس ، 85 مل خالية من RNAse H2< / sub>O
وسيط تركيب Vectashield مع DAPIVectorlabsH-1200
الأظافر
الفلور
الخلايا عند الطلبيمكن اشتقاق الخلايا وسيط أنابيب مرشح ملصقات البيوتين 11745816910 Rocheالمعقمة تهجين الأوتوكلاف ملحي FITC Jackson تستخدم تشخيصات Rhodamine Jackson Rhodamine Jackson طلاء

المراجع

  1. Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
  2. Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).
  3. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
  4. Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
  5. Martins-Taylor, K., Xu, R. H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 22-27 (2012).
  6. Rens, W., et al. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).
  7. Munsky, B., et al. Using gene expression noise to understand gene regulation. Science. 336, 183-187 (2012).
  8. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  9. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46, 65-72 (2013).
  10. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  11. Femino, A. M., et al. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  12. Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 225, 946-948 (1970).
  13. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  14. John, H. A., et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 223, 582-587 (1969).
  15. Bauman, J. G., et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  16. Wiegant, J., et al. In situ hybridization with fluoresceinated DNA. Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).
  17. Langer, P. R., et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).
  18. Manuelidis, L., et al. High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes. J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).
  19. Kislauskis, E. H., et al. Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments. J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).
  20. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).
  21. Corput, M. P., et al. Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).
  22. Jonkers, I., et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation. Cell. 139, 999-101 (2009).
  23. Barakat, T. S., et al. RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Gontan, C., et al. RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation. Nature. 485, 386-390 (2012).
  25. Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature. 190, 372-373 (1961).
  26. Barakat, T. S., Gribnau, J. X. chromosome inactivation in the cycle of life. Development. 139, 2085-2089 (2012).
  27. Augui, S., et al. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).
  28. Brown, C. J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 349, 38-44 (1991).
  29. Brockdorff, N., et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature. 351, 329-331 (1991).
  30. Borsani, G., et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature. 351, 325-329 (1991).
  31. Barakat, T. S., Gribnau, J. X chromosome inactivation and embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).
  32. Chaumeil, J., et al. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  33. Okamoto, I., et al. Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development. Nature. 472, 370-374 (2011).
  34. Gribnau, J., et al. X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing. J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).
  35. Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
  36. Van Tine, B. A., et al. Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence. Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).
  37. Pollex, T., et al. Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center. Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).
  38. Chaumeil, J., et al. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  39. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).
  40. Meissner, A., et al. Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).
  41. Nichols, J., Ying, Q. L. Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تهجين الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين والحمض النووي الريبوزي المدمج (Combined DNA-RNA FISH)والكشف عن الحمض النووي الريبوزي Xistووسم مسبار الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجينونقل الثلمةوالمجهر الفلوري المناعيوالتثبيت بالبارافورمالدهيدومحلول التهجين المنظموالأجسام المضادة الفلورية
الحمض النووي RNA-مجتمعة نيون
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.