يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

وضع النطاقي الحماقي الفيروسات محددة بوساطة خلية الحصانة ELISPOT الفحص لتقييم الإنترفيرون γ-عقب الحبل السري زرع الدم

14.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51643

⸱

يوليو 9, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Unité d'Immunopathologie Virale, Centre de Recherche du CHU Sainte-Justine, Department of Microbiology, Infectiology & Immunology, Faculty of Medicine, Université de Montréal, 2Infectious Diseases Service, CHU Sainte-Justine, Faculty of Medicine, Université de Montréal, 3Department of Paediatrics, Université de Montréal

في هذه المقالة

ملخص

أجيال جديدة من المقايسات وظيفية مثل انترفيرون غاما (الإنترفيرون γ) ELISPOT، الذي كشف عن إنتاج السيتوكينات على مستوى خلية واحدة وتقديم كل من توصيف الكمي والنوعي للاستجابات الخلايا التائية يمكن استخدامها لتقييم الاستجابات بوساطة الخلايا المناعية الموجهة ضد الحماق النطاقي فيروس (جدري الماء).

الملخص

الفيروس النطاقي الحماقي (VZV) هو سبب كبير من المراضة والوفيات التالية السري زرع دم الحبل السري (UCBT). لهذا السبب، يتم إدارتها بشكل منهجي الوقاية antiherpetic إلى المستلمين UCBT الأطفال لمنع المضاعفات المرتبطة عدوى جدري الماء، ولكن ليس هناك والتوافق على أساس أدلة قوية على أن يحدد مدته الأمثل. لأن الخلايا التائية الحصانة بوساطة هي المسؤولة عن السيطرة على العدوى الفيروس النطاقي الحماقي، وتقييم إعادة تشكيل استجابات الخلايا التائية VZV المحددة التالية UCBT يمكن أن توفر مؤشرات حول ما إذا كان ينبغي الحفاظ على الوقاية أو يمكن وقفها. تحقيقا لهذه الغاية، تم تطوير انترفيرون غاما VZV محددة (الإنترفيرون γ) انزيم مرتبط immunospot (ELISPOT) مقايسة لتوصيف إنتاج الإنترفيرون γ بواسطة الخلايا اللمفية تي ردا على التحفيز في المختبر مع المشع الحية الموهنة لقاح جدري الماء. ويوفر هذا الاختبار قياس السريع، واستنساخه وحساسة من VZV ج محددةالذراع بوساطة الحصانة مناسبة لرصد إعادة تشكيل VZV الحصانة محددة في عملية إعداد سريرية وتقييم الاستجابة المناعية لمستضدات الفيروس النطاقي الحماقي.

المقدمة

أجريت لأول مرة في عام 1989، ويستخدم UCBT متزايد كجزء من علاج مختلف اضطرابات الدم والأورام لدى الأطفال nonneoplastic 1. جدري الماء هو alphaherpesvirus الإنسان والذي يسبب الاعتلال الخلوي اثنين من أمراض مختلفة، الحماق (بعد العدوى الأولية) والهربس النطاقي (بعد إعادة تنشيط). بعد الإصابة الأولية، VZV استمرت طوال حياة المضيف محمية داخل الأعصاب الحسية من العقد الجذرية الظهرية. واحد من المضاعفات المعدية الأكثر تهديدا التالية UCBT يرتبط مع VZV 2-4. في مركز السريرية لدينا، في غياب VZV الاتقاء، وكان معدل التراكمي للمرض جدري الماء مرض جدري الماء في 3 سنوات postUCBT 46٪ 2. في هؤلاء المرضى، وغالبا ما يترافق مع الإصابة من جديد أو تنشيط VZV مع نشر الحشوية إلى الجهاز العصبي المركزي والرئتين والكبد 5-7. كما يتم إدارتها نتيجة لذلك، الأسيكلوفير، valacyclovir أو famciclovir الوقاية عادة لUBالمتلقين CT 8،9. ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية العلاج لا تأخذ بعين الاعتبار إمكانات واقية من الفيروس النطاقي الحماقي الخلايا الليمفاوية T معينة أو حركية إعادة تشكيل استجابات الخلايا التائية VZV محددة. المشاكل المحتملة المرتبطة التوسع في استخدام العلاج الوقائي antiherpetic المدى الطويل وتشمل أ) overtreatment المريض؛ ب) تطوير فيروسات مقاومة للأدوية 10،11؛ وج) ضعف المناعة من الفيروس النطاقي الحماقي إعادة محددة 12،13. لأن الكشف عن الفيروس النطاقي الحماقي وظيفية محددة الخلايا اللمفية تي يرتبط مع وجود حماية على المدى الطويل من عدوى جدري الماء وتحسين النتائج السريرية 4،14،15، ورصد الخلية بوساطة الاستجابات المناعية الموجهة ضد الفيروس النطاقي الحماقي خلال الفترة posttransplant قد يؤدي إلى استخدام أكثر عقلانية من فيروسات العلاج عن طريق تمكين الأطباء الممارسين للتمييز المرضى الذين سيستفيدون من العلاج الوقائي VZV من أولئك الذين قادرة على السيطرة على تكرار VZV 4،13 الجهاز المناعي.

ويستخدم على نطاق واسع ELISPOT مقايسة-γ IFN للخلية الرصد بوساطة الاستجابات المناعية في مجموعة متنوعة من النظم التجريبية والحالات السريرية. يتم إنشاؤها البقع عقب انشقاق من ركيزة مولد اللون، وتوليد راسب وضوحا واستقرارا في موقع رد الفعل. كل بقعة الفردية مما يمثل البصمة خلية المنتجة للخلوى الفردية. الإنترفيرون γ ELISPOT يقيس ليس فقط قدرة الخلايا الفردية فيفو السابقين لإنتاج الإنترفيرون γ ردا على التحفيز في المختبر مع مستضد وما شابه ذلك، ولكنه يوفر أيضا تقديرا من وتيرة الاستجابة الخلايا في السكان خلية معينة 16،17. بالإضافة إلى حساسية عالية، والإنترفيرون γ ELISPOT واضح ومباشر على القيام بها، مما يجعل من الممكن استخدامه في سياق بروتوكولات سريرية شخصية تهدف إلى بدء أو وقف العلاج المضاد للفيروسات التوجيهية. الإجراء المفصلة أدناه describوفاق مقايسة ELISPOT التي تم تصميمها خصيصا لكشف وقياس إنتاج الإنترفيرون γ من قبل خلايا الدم المحيطية التالية في المختبر التحفيز مع مستضدات الفيروس النطاقي الحماقي مشتقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل مجلس البحوث المؤسسية أخلاقيات استعراض CHU سانت جوستين في مونتريال، كندا، حيث أجريت الدراسة. وطلب الموافقة المسبقة والتي تم الحصول عليها من جميع المشاركين في الدراسة، والديهم أو الأوصياء القانونيين. كافة الإجراءات التي أجريت على أيام 1 و 2 يجب أن تتم تحت ظروف معقمة (أي تحت غطاء تدفق الصفحي). ينبغي مراعاة إجراءات السلامة القياسية للتعامل مع الدم البشري بدقة.

1. طلاء لوحات

  1. Permeabilize في difluoride البولي فينيل (PVDF) الأغشية في الجزء السفلي من 96 جيدا لوحات متعددة الشاشات IP ELISPOT الأبيض بإضافة إلى كل بئر 20 ميكرولتر من 35٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة. ينبغي أن تصبح الأغشية شفافة قليلا.
  2. يغسل فورا الآبار 3 مرات مع 200 ميكرولتر من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 137 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 2 ملي KH 2 PO 4، ودرجة الحموضة 7.4) باستخدام مولtichannel ماصة أو جهاز مماثل. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية بالنظر إلى أن مخلفات الإيثانول يمكن أن تؤثر على بقاء الخلية وملزمة من التقاط الأجسام المضادة. لوحات ELISPOT هشة ويجب التعامل معها بعناية: لا ينصح استخدام لوحة غسالة آلية.
  3. معطف الآبار مع 10 ميكرولتر من الماوس المنقى مكافحة الإنسان الإنترفيرون γ التقاط الأجسام المضادة المخفف في برنامج تلفزيوني 1X إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل. تغطية لوحات مع الاغطية البلاستيكية العادية واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

2. حجب لوحات

  1. إفراغ الآبار، والتنصت لهم الجافة، وغسل الأطباق 5 مرات مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X.
  2. ملء الآبار مع 200 ميكرولتر من اكتمال المتوسط ​​1640 RPMI واحتضان لوحات لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية (عرقلة الخطوة).
  3. تغسل الصحون 5X مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X والحفاظ على آبار كاملة من برنامج تلفزيوني 1X حتى الخلايا جاهزة للمطلي.

3. تصفيح الخليوي وتحفيز

  1. إعداد عخلايا الدم وحيدات النوى eripheral (PBMC) من الإنسان عينات الدم الوريدي بواسطة الطرد المركزي على التدرجات Ficoll-Paque باستخدام الإجراءات القياسية. بدلا من ذلك، وذلك باستخدام الأساليب القياسية، ذوبان الجليد مأخوذة من PBMC المجمدة تحت النيتروجين السائل. بعد مشاركة الطرد المركزي، Resuspend الخلايا بتركيز نهائي من 2 × 10 6 خلية / مل واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2 الغلاف الجوي في حاضنة سترة المياه.
  2. إزالة PBMC من الحاضنة و resuspend لهم في الحجم النهائي من 5 مل من المتوسط ​​1640 RPMI كاملة.
  3. احتضان PBMC بحضور 10 ميكرولتر من نوكلياز داخلية وراثيا من السراتية الذابلة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. إزالة قسامة 50 ميكرولتر من PBMC وتخلط مع 50 ميكرولتر من صبغة زرقاء التريبان. عد الخلايا وتقدير الجدوى٪ باستخدام haemocytometer والفحص المجهري (صبغ طريقة الاستبعاد). طرق مختلفة لالعد الآلي المحمولة وتقييم بقاء الخلية يمكن آللذلك يمكن استخدامها. PBMC ينبغي أن تكون> 95٪ قابلة للحياة. تجاهل عينة عندما الجدوى أقل من 95٪.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج PBMC لمدة 5 دقائق، طاف تجاهل، والخلايا resuspend في AIM-V المتوسطة تستكمل مع 2٪ (V / V) مصل الإنسان المعطل (HIS) بتركيز نهائي من 2 × 10 6 خلية / مل. الحفاظ على 37 درجة مئوية حتى يتم إضافة خليط من التحفيز لوحة.
  6. إضافة إلى الآبار، وقطرة واحدة في وقت واحد، و 100 ميكرولتر من خليط التحفيز المناسب. وينبغي استخدام ثلاثة مخاليط التحفيز كما هو موضح أدناه:
    1. استخدام AIM-V المتوسطة تستكمل مع 2٪ (V / V) مصل الإنسان المعطل (IHS) سيطرة سلبية.
    2. استخدام الألغام المضادة للCD3 الأضداد وحيدة النسيلة (استنساخ OKT3) المخفف في AIM-V المتوسطة تستكمل مع 2٪ (ت / ت) IHS إلى تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / مل مراقبة إيجابية ع).
    3. استخدام مستضد الفيروس النطاقي الحماقي، في شكل إما المشع γ (10،000 جراى و 30 دقيقة زمن التعرض) يعيش لقاح جدري الماء الموهن (وحدات تشكيل البلاك 1،350 [PFU] / مل) diluتيد 1:200 في AIM-V المتوسطة تستكمل مع 2٪ (ت / ت) IHS) أو 1 ميكروغرام من خليط متساوي المولية من 67 الببتيدات (15 مخلفات الأحماض الأمينية) توليفها على أساس تسلسل VZV المبكر على الفور (IE63) بروتين فسفوري؛ فسوبروتين . السيطرة فعالية التشعيع عن طريق رصد غياب علامات واضحة للآثار الاعتلال الخلوي بعد 4 أيام في الثقافات PBMC.
    4. إعداد جميع الآبار في مكررة.
  7. إضافة إلى الآبار، وقطرة واحدة في وقت واحد، و 100 ميكرولتر من الخلايا التي أعدت في الخطوة 5.4 إلى الآبار المناسبة. ينبغي أن يترك بئرين دون الخلايا (مراقبة سلبية). احتضان لمدة 20 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2 الغلاف الجوي في حاضنة سترة المياه. لا يهز، نقل، أو كومة لوحات على رأس واحد آخر أثناء الحضانة.

4. تنمية بقعة وكشف

  1. تجاهل الخلايا وتغسل الصحون 10X مع برنامج تلفزيوني 1X تستكمل مع 0.05٪ (V / V) توين 20 (PBST). توين 20 يساعد فصل الخلايا التي انضمت إلى PVDF ليmbrane التالية الحضانة بين عشية وضحاها.
  2. باستخدام ماصة الأقنية، إضافة 100 ميكرولتر من 0.5 ملغ / مل البيوتين مترافق الأضداد وحيدة النسيلة المضادة للالإنترفيرون γ (4S.B3 استنساخ) المخفف في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 0.5٪ (ث / ت) ألبومين المصل البقري (BSA). احتضان لوحات لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. غسل الآبار مع PBST 6X وإضافة كل بئر 100 ميكرولتر من streptavidin conjugatd مع الفوسفاتيز القلوية المخففة 1:1،000 في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 0.5٪ (ث / ت) BSA. تغطية لوحات واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تغسل الصحون 3x أخرى مع PBST و 3X مع برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 100 ميكرولتر من الفوسفات 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl (BCIP) / نيترو الأزرق كلوريد نتروبلو (NBT) حل الركيزة واحتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. تغسل الصحون تحت الماء الجاري المقطر. إزالة القسم السفلي من لوحة ELISPOT وغسل جانبي الغشاء مع الماء المقطر. الهواء الجاف لوحات.
  6. دراسة الآبار وتعداد البقع باستخدام د مجسمةالمجهر issection أو تفحص لوحات باستخدام عداد بقعة الآلي. الحفاظ على لوحات بعيدا عن الضوء إذا لم يتمكنوا من دراستها في نفس اليوم.
    1. متوسط ​​عدد البقع تحسب في الآبار مكررة المقابلة وطرح عدد من النقاط المحتسبة في آبار المراقبة السلبية (أي الخلايا) من عدد من البقع تحسب في آبار الاختبار.
    2. التعبير عن إنتاج الإنترفيرون γ حيث بلغ عدد الوحدات المكونة للبقعة (SFU) في 10 6 PBMC.
    3. نعتبر أن عينات الاختبار إيجابية إذا كان عدد SFU هو> 50 في 10 6 PBMC و 2 الانحرافات المعيارية (SD) فوق سيطرة سلبية (خلايا + AIM-V المتوسطة تستكمل مع 2٪ (ت / ت) IHS).
    4. استخدام قيمة 400 SFU لكل بئر عند بقع عديدة جدا بحيث لا يمكن عدها.
  7. اختبار ما إذا كان يتم توزيع البيانات ELISPOT عادة أو باستخدام اختبار كولموجوروف-سميرنوف لا. عندما يتم توزيع البيانات عادة، نفذ المقارنات الإحصائية باستخدام ر الاحصائيين الطالبر (2 مجموعات) أو ANOVA وBonferroni بعد اختبار (مقارنات متعددة). إذا لم يتم توزيع البيانات عادة، استخدام اختبار مان ويتني U (2 مجموعات) أو اختبار كروسكال واليس وآخر اختبار دان (مقارنات متعددة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد تم تطوير بروتوكول ELISPOT-γ IFN المفصلة أعلاه والأمثل في مختبرنا لقياس حجم ونوعية الخلية بوساطة الاستجابات المناعية الموجهة ضد جدري الماء 4. مصادر متنوعة من VZV المستضد يمكن استخدامها للخطوة التحفيز. وتشمل هذه: أ) المنظفات متوفرة تجاريا مقتطفات المعطل من VZV الخلايا المصابة فيرو 18؛ ب) برك من تداخل الببتيدات الاصطناعية من البروتينات المشفرة VZV محددة، بما في ذلك IE63 15 و 19 ORF4؛ ج) يعيش الموهن لقاح الحماق النطاقي 20؛ ود)...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها: قد استخدمت المقايسات الإنترفيرون γ ELISPOT لدراسة الاستجابات بوساطة الخلايا المناعية الموجهة ضد مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض الميكروبية، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية نوع 1 (HIV-1) 24،25، فيروس التهاب الكبد الوبائي (سي) 26، 27، والمتفطرة السلية 28،29، وهذا غيض من فيض. نحن هنا وصف وضع ELISPOT مقايسة-γ IFN لقياس المناعة الخلوية ضد، على أمل تحديد يرتبط من VZV إعادة المناعي محددة في استعادة المتلق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

الكتاب أود أن أشكر المشاركين في الدراسة وأولياء أمورهم. نود أيضا أن نشكر الدكتور Réjean ابونت (CHUM نوتردام، مونتريال، كندا) من أجل الوصول إلى القارئ له ELISPOT الدكتور LUBO الكسندروف للتحليل الإحصائي، ودينيس بليس، ساندرا كارون، سيلفي فالوا ومارتين لكاتي الخبراء التقنيين المساعدة. بدعم من المنح المقدمة من لو فون كوت عملية صب ليه PROJETS للبحوث كلينيك آخرون كوت دي évalution التقنيات (CHU سانت جوستين) إلى HS وPO، التي كتبها la مؤسسة مركز دي cancérologie شارل Bruneau ل، وجمعية سرطان الدم والاورام الليمفاوية من كندا. وأيد قوى الأمن الداخلي من خلال منح دراسية من مؤسسة لا CHU سانت جوستين ولو فون دي لا بحوث كيبيك-صحة (FRQS). كان AJG المستفيدة من المنح الدراسية من قسم علم الأحياء الدقيقة، علم المناعة وInfectiology، جامعة مونتريال (غابرييل ماركيز-منحة)، FRQS، والمعاهد الكندية للصحة Research (CIHR). وأيد NM كتبها la مؤسسة CHU سانت جوستين، ومؤسسة كول، وFRQS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب LeucocepVWR89048-936 / 89048-932يمكن استخدام أنابيب 12 مل أو 50 مل اعتمادا على حجم الدم.
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-1440-02حماية من الضوء.
نوكلياز البنزونازنوفاجين70746-3، احتفظ ب -20 &# 176 ؛ درجة مئوية.
MultiScreenHTS-IP Filter PlateMilliporeMSIPS4W10معقمة بحجم مسام 0.45 µm. 
الفأر المضاد للإنسان IFN-& gamma; التقاط الجسم المضادBD Biosciences551221استنساخ NIB42.
Pepmix VZV IE63  JPT Peptide TechnologiesPM-VZV-IE63قم بإذابة محتويات قارورة واحدة في 40 &# 956 ؛ ل من DMSO. يستخدم في غضون 6 أشهر.
الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة للإي فن إن جاماBiosciences5545504SB3.
الستربتافيدين مترافق مع الفوسفاتيز القلوي   ؛Bio-Rad Life Science170-3554مخفف للاستخدام في نفس اليوم.
BCIP / NBTBio-Rad Life Science170-6432الحماية من الضوء.
: استنساخ والبيوتين المضاد BD

المراجع

  1. Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
  2. Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
  3. Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
  4. Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
  5. Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
  6. Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
  7. Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients - a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
  8. Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation--a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
  9. Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
  10. Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
  11. Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
  12. Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
  13. Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
  14. Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
  15. Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
  16. Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
  17. Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
  18. De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
  19. Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
  20. Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
  21. Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
  22. Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
  23. Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
  24. Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
  25. Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
  26. Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
  27. Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
  28. Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
  29. Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
  30. Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
  31. Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
  32. Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  33. Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
  34. Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
  35. Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
  36. Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
  37. Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
  38. Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
  39. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  40. Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
  41. Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
  42. Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
  43. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
  44. Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
  45. Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
  46. Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
  47. Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
  48. Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

مقايسة ELISpot لإنترفيرون غامااستجابة الخلايا اللمفاوية Tتحفيز بمستضد VZVكشف إنترفيرون غاماعزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC)تعداد البقعخلايا T ذات المستضد CD4+
وضع النطاقي الحماقي الفيروسات محددة بوساطة خلية الحصانة ELISPOT الفحص لتقييم الإنترفيرون γ-عقب الحبل السري زرع الدم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.