مقالة منهجية

وهناك طريقة جديدة لتوضيح تصور الصفراوية الكبد الصفراء خلال التحول في البحر الجلكى ( Petromyzon مارينوس)

DOI:

10.3791/51648

⸱

يونيو 6, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Fisheries & Wildlife, Michigan State University, 2Hammond Bay Biological Station, Great Lakes Science Center, U.S. Geological Survey

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجلكى البحر تفقد المرارة والقنوات الصفراوية خلال التحول، وهي عملية مشابهة لرتق القناة الصفراوية الإنسان. تم تعديل طريقة التثبيت الجديدة والتوضيح (وضوح) لتصور الشجرة الصفراوية بأكملها باستخدام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهري. وهذه الطريقة توفر أداة قوية لدراسة الضمور الصفراوية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

رتق القناة الصفراوية هو مرض نادر من مرحلة الطفولة، مع ما يقدر بنحو 1 في 15،000 تردد في جنوب شرق الولايات المتحدة، ولكن أكثر شيوعا في بلدان شرق آسيا، مع تردد تقارير عن 1 في 5،000 في تايوان. على الرغم من أن يعرف الكثير عن إدارة رتق القناة الصفراوية، المرضية له لا يزال بعيد المنال. الجلكى البحر (Petromyzon مارينوس) يوفر فرصة فريدة لدراسة آلية وتطور الضمور الصفراوية. الجلكى البحر تتطور من خلال ثلاث مراحل حياة متميزة: اليرقات والطفيلية، والكبار. خلال الانتقال من اليرقات الطفيلية إلى الأحداث، الجلكى البحر الخضوع التحول مع إعادة تنظيم وإعادة دراماتيكية في التشكل الخارجي، والأعضاء الداخلية. في الكبد، يتم فقدان نظام الصفراوي بأكمله، بما في ذلك المرارة والشجرة الصفراوية. تم تعديل طريقة تم تطويرها حديثا يسمى "وضوح" لتوضيح الكبد كامل وتقاطع مع الأمعاء المتحولة في الجلكى البحر. الوتصور عملية انحطاط الصفراوي وتمييزها خلال البحر الجلكى التحول باستخدام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهري. وهذه الطريقة توفر أداة قوية لدراسة رتق القناة الصفراوية في نموذج حيواني فريدة من نوعها.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجلكى البحر تتطور من خلال ثلاث مراحل متميزة حياة 1،2. الجلكى البحر اليرقات (L) يقضون معظم الوقت في الجحور كما مغذيات الترشيح القاعية. بعد أن يمر سبع مراحل المتحولة من تغييرات جذرية في التشكل الخارجي، وإعادة التنظيم في الأعضاء الداخلية 3، والأحداث الناتجة (JV) تدخل مرحلة الطفيلية خلالها تتغذى على الدم وسوائل الأنسجة من الأسماك المضيف، وزيادة كتلة الجسم أكثر من 100 مرة . بعد 1،0-1،5 سنوات تتغذى على الأسماك المضيف في المحيط أو البحيرات الكبيرة، البالغين وقف التغذية في أوائل الربيع وتهاجر إلى الأنهار لتفرخ ثم يموت 1،2.

أثناء التحول، والكبد الجلكى البحر يفقد المرارة والشجرة الصفراوية بأكمله، وهو النمط الظاهري متحولة التطوري الذي يحاكي المرض الرضع الإنسان رتق القناة الصفراوية. رتق القناة الصفراوية الرضع هو مرض الكبد للأطفال نادرة مع مضاعفات طبية شديدة 4،5،6،7، 8،9،10، ولكن المرضية ومسببات رتق القناة الصفراوية غير معروفة إلى حد كبير 4. المرضى الذين يعانون من رتق القناة الصفراوية يموت في غضون عامين بعد الولادة ما لم يتم تنفيذ التدخل الجراحي (إجراء كاساي) 5. في وقت لاحق، هؤلاء المرضى تتطلب إدارة السريرية واسعة وغالبا ما زرع الكبد 6. لقد تم اقتراح العديد من النظريات من الصفراوي رتق etiopathogenesis، مثل العدوى الفيروسية، والتشوهات الخلقية، وأمراض المناعة الذاتية، وإهانة السامة. ومع ذلك، فإن مساهمة كل منهما في تطوير رتق القناة الصفراوية تظل غير حاسمة 7،8،9،10.

على عكس الأطفال الذين يعانون رتق القناة الصفراوية المرضية، الجلكى البحر الخضوع المبرمج تنمويا رتق القناة الصفراوية دون necroinflammation واسعة، والتليف أو التشمع 10. الحيوانات قد تعاني ركود صفراوي عابرة خلال هذه العملية 10، ولكن التكيف مع هذا الشرط التنمويةعبر دي نوفو التوليف وإفراز أملاح الصفراء في الأمعاء بعد رتق القناة الصفراوية التنموية، بالإضافة إلى الآليات المعروفة مثل الحد من التوليف الملح الصفراوية في الكبد 11. هذه العملية التنموية في الجلكى البحر يتيح الفرصة الوحيدة المعروفة لدراسة تطور رتق القناة الصفراوية.

وهناك طريقة المطورة حديثا يسمى "وضوح" تمكن التصوير ذات الدقة العالية في الجهاز العصبي لدى الثدييات المعقدة عن طريق تحويل أنسجة سليمة إلى هيدروجيل نانوية مسامية شفافة بصريا 12. باستخدام الكبد الجلكى البحر وبروتوكول تعديل وضوح، والتصوير أنسجة سليمة من انحطاط المرارية يمكن أن تكون موثقة في جميع أنحاء التحول الكبد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الحل

  1. جعل 1 L 10X 0.1 M العازلة الفوسفات المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4): وزن 26.2 فوسفات الصوديوم ز (أحادى)، 115 غ فوسفات الصوديوم (ثنائي القاعدة)، و87.66 غرام كلوريد الصوديوم. تذوب في حوالي 800 مل المقطر H 2 O، وضبط درجة الحموضة، وجعل حجم ما يصل الى 1 لتر مع H 2 O. المقطر
    1. جعل 1 L 0.1 M العازلة الفوسفات المالحة (الرقم الهيدروجيني 7.4): خذ 100 مل 10X PBS، وإضافة 900 مل المقطر H 2 O.
    2. جعل 1 L 0.1 M العازلة الفوسفات المالحة (درجة الحموضة 7.4) مع 0.1٪ تريتون X-100: خذ 100 مل 10X PBS، إضافة 1 مل تريتون X-100، وجعل حجم ما يصل الى 1 لتر مع H 2 O. المقطر
  2. جعل 1 L 10X 0.1M العازلة الفوسفات (PB، ودرجة الحموضة 7.4): وزن 26.2 فوسفات الصوديوم ز (أحادى) و 115 غ فوسفات الصوديوم (ثنائي القاعدة). تذوب في حوالي 800 مل المقطر H 2 O، وضبط درجة الحموضة، وجعل حجم ما يصل الى 1 لتر مع H 2 O. المقطر
    1. جعل 1 L 0.1 M العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4): خذ 100 مل 10X PB،وإضافة 900 مل المقطر H 2 O.
    2. جعل 1 L 0.1 M العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4) مع 0.1٪ تريتون X-100: خذ 100 مل 10X PB، إضافة 1 مل تريتون X-100، وجعل حجم ما يصل الى 1 لتر مع H 2 O. المقطر
  3. جعل حل 400 مل هيدروجيل مونومر (4٪ الأكريلاميد، 0.25٪ مكرر الأكريلاميد، 4٪ بارافورمالدهيد، فوق كبريتات الأمونيوم 0.0075٪، 0.0005٪ سابونين في 0.1 M PBS): وزن 0.3 غ فوق كبريتات الأمونيوم و 0.2 غرام سابونين. إضافة 210 مل المقطر H 2 O، 40 مل 40٪ الأكريلاميد، 10 مل 2٪ مكرر الأكريلاميد، 40 مل 10X PBS (درجة الحموضة 7.4)، و 100 مل 16٪ بارافورمالدهيد، وتخلط جيدا.
  4. جعل 4 L حل المقاصة (4٪ SDS في 0.2 M حمض البوريك): وزن 49.464 غرام حمض البوريك و160 غ SDS. تذوب في حوالي 3.5 L المقطر H 2 O، وضبط درجة الحموضة إلى 8.5 مع هيدروكسيد الصوديوم، وجعل حجم ما يصل الى 4 L.
  5. جعل 1 L 80٪ الحل الجلسرين: قياس 800 مل الجلسرين، إضافة 200 مل المقطر H 2 O، وتخلط جيدا.

2. تحضير الأنسجة

  1. إعداد هيدروجيل حل مونومر وقسامة 10 مل لكل 15 مل أنبوب الطرد المركزي.
  2. تشريح الأنسجة كله وإصلاح في هيدروجيل لمدة 2 أيام في 4 درجات مئوية. تأكد من أن الحل هو هيدروجيل من 10X حجم الأنسجة على الأقل.
  3. إحضار الأنسجة هيدروجيل الثابتة (في 15 مل أنبوب الطرد المركزي) لغطاء الدخان.
  4. بلمرة الأنسجة الثابتة هيدروجيل بإضافة 5 ميكرولتر TEMED، وتخلط جيدا، وترك الجلوس في غطاء الدخان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 ساعة.
  5. إزالة هلام الزائدة بدقة. ملاحظة: سوف هلام إضافية تعيق عملية المقاصة واختراق الأجسام المضادة خلال تلطيخ.
  6. احتضان الأنسجة الثابتة في 10 مل الحل في تطهير شاكر حاضنة وضعت في 70 دورة في الدقيقة و 50 درجة مئوية لعدة أيام حتى يصبح الأنسجة شفافة. تغيير الحل تطهير مرة واحدة في اليوم على الأقل، وإزالة هلام الزائدة من الأنسجة عند تغيير الحل المقاصة.
  7. شطف الأنسجة في 10 مل 0.1 M PB مع 0.1٪ تريتون X-100 في 70 صمساء و 37 درجة مئوية خلال الليل. كرر هذه الخطوة 3 مرات وإزالة هلام الزائدة من الأنسجة عند تغيير الحل العازلة.
  8. احتضان الأنسجة أوضح في حل الأجسام المضادة الأولية في PB مع 0.1٪ تريتون X-100 على 70 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 2 ايام. ملاحظة: تأكد بما فيه الكفاية حل الأجسام المضادة الأولية لغمر النسيج كله.
  9. شطف الأنسجة في 10 مل PB مع 0.1٪ تريتون X-100 على 70 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية خلال الليل. كرر هذه الخطوة 3 مرات وإزالة هلام الزائدة من الأنسجة عند تغيير الحل العازلة.
  10. نفذ الخطوات التالية في غرفة مظلمة أو تحت ضوء خافت. تغطية العينات مع احباط لمنع تبييض الصورة.
  11. احتضان الأنسجة أوضح مع الفلورسنت حل الضد الثانوية في PB مع 0.1٪ تريتون X-100 و المصل حجب في 70 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 1 يوم.
  12. شطف الأنسجة في 10 مل PB مع 0.1٪ تريتون X-100 على 70 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية خلال الليل. كرر هذه الخطوة 3 مرات وإزالة هلام و الزائدةROM الأنسجة عند تغيير الحل العازلة.
  13. شطف الأنسجة في 10 مل PBS في 70 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية خلال الليل. كرر هذه الخطوة 3 مرات وإزالة هلام الزائدة من الأنسجة عند تغيير الحل العازلة.
  14. احتضان الأنسجة أوضح في الجلسرين 80٪ في 70 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية خلال الليل.
  15. تخزين الأنسجة الملون فلوري في 4 درجات مئوية قبل المجهري متحد البؤر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحدث العديد من الفعاليات التنموية الهامة في النظام الكبد خلال البحر الجلكى التحول. القناة الصفراوية والمرارة الخضوع لموت الخلايا المبرمج والمنحطة (الشكل 1). الجمع بين أسلوب التوضيح تعديل وتلطيخ مع الكبد علامة الخلية cytokeratin 19 (CK19، موجودة في كل خلايا الكبد وcholangiocytes قبل وبعد التحول 13) ومكافحة أفكارك Bcl2 علامة باستخدام متحد البؤر المجهري، اعتقل النظام الصفراوي بأكمله على طول المحور Z ( الشكل 2) وهيكل 3 الابعاد أعيد بناؤها <...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تعديل هذا البروتوكول من أسلوب جديد يسمى "وضوح" 12، التي crosslinks الأنسجة سليمة مع بولكرلميد لتشكيل هيدروجيل نانوية مسامية، ثم يجرد بعيدا غشاء البلازما من الأنسجة لتحقيق الشفافية البصرية ونفاذية الجزيئات. "وضوح" يسمح التصوير أنسجة سليمة من الإسقاط طويلة المدى والأسلاك الدوائر المحلية في الجهاز العصبي. هذه الطريقة الجديدة يمكن استخدامها لتصور نظام الصفراوي كامل في الكبد الجلكى البحر خلال التحول. ذلك هو التحدي في علم الأحياء للحصول على معلومات عال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب يعترف مساهمة محطة البيولوجية هاموند خليج، مركز العلوم البحيرات الكبرى، المسح الجيولوجي الامريكية. نشكر أيضا الدكتور الإطار ميليندا في مركز متقدم المجهر في جامعة ولاية ميشيغان لها الدعم التقني في المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهري. ويدعم هذه الدراسة من المنح المقدمة من هيئة مصايد أسماك البحيرات الكبرى إلى YWCD وWML.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
40٪ أكريلاميد   ؛Bio-Rad161-0140
2٪ bis-acrylamide Bio-Rad161-0142
TEMEDBio-Rad161-0800
بيرسلفات الأمونيوم  سيجماA3678-25G
حمض البوريكسيجماB7901-1KG
الصابونين   ؛سيجما47036
كبريتات دوديسيل الصوديوم  سيجماL337-500G
فوسفات الصوديوم (أحادي القاعدة)سيجما04269-1 كجم
فوسفات الصوديوم (ثنائي الأساسي)سيجماS5136-1KG
تريتون X-100سيجماX100-500 مل
جلسرين   ؛سيجماG9012-500ML
16٪ بارافورمالدهايد   ؛علوم المجهر الإلكتروني15710-S
كريات هيدروكسيد الصوديوم  EMDSX0590-3
أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مل أيالعلامة التجارية
  ؛أي علامة تجارية
أدوات تشريح

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
  2. Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).
  3. Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
  4. Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
  5. Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
  6. Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
  7. Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
  8. Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
  9. Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
  10. Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
  11. Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  13. Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
  14. Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
  15. Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Biliary DegenerationSea LampreyCLARITY MethodLaser Scanning Confocal MicroscopyImmunofluorescent StainingTissue ClearingHydrogel PolymerizationCytokeratin 19BCL TwoMetamorphic Stages

مقالات ذات صلة