من اللعاب مصدرا متاحا بسهولة للحمض النووي عالي الوزن الجزيئي ، مع القليل من التدهور / التجزئة. يوفر هذا البروتوكول معلمات محسنة لجمع / تخزين اللعاب واستخراج الحمض النووي لتكون ذات جودة وكمية كافية لمقايسات الحمض النووي النهائية مع متطلبات الجودة العالية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
جمع واستخراج الحمض النووي من اللعاب لتسلسل الجيل القادم
في هذه المقالة
ملخص
يمكن أن يوفر استخراج الحمض النووي
الملخص
المصدر المفضل للحمض النووي في أبحاث علم الوراثة البشرية هو الدم ، أو خطوط الخلايا المشتقة من الدم ، حيث تنتج هذه المصادر كميات كبيرة من الحمض النووي عالي الجودة. ومع ذلك ، يمكن أن ينتج عن استخراج الحمض النووي من اللعاب حمض نووي عالي الجودة مع القليل من التدهور / التجزئة أو عدم التجزئة المناسبة لمجموعة متنوعة من فحوصات الحمض النووي دون حساب الفصد ويمكن حتى الحصول عليها عن طريق البريد. ومع ذلك ، في الوقت الحاضر ، لم يتم تقديم بروتوكولات جمع / استخراج الحمض النووي للعاب لتسلسل الجيل التالي في الأدبيات. يعمل هذا البروتوكول على تحسين معلمات جمع / تخزين اللعاب واستخراج الحمض النووي لتكون ذات جودة وكمية كافية لمقايسات الحمض النووي بأعلى المعايير ، بما في ذلك التنميط الجيني للمصفوفات الدقيقة وتسلسل الجيل التالي.
المقدمة
الحصول على الحمض النووي عالية الجودة للدراسات الجينية البشرية أمر أساسي في عملية اكتشاف الجين المرض. الدم، على الرغم تتطلب إجراء الغازية وكونها أكثر تكلفة من جمع اللعاب أيضا، ويحظي لإنشاء خطوط الخلايا خلد كمصدر لانهائي من الحمض النووي، أو iPSCs للدراسات وظيفية، وأحيانا يستخدم الحمض النووي في الدم عند خطوط الخلايا غير متوفرة. ومع ذلك، يتطلب الحصول على الدم فصاد المدربين والدم لديه نصف عمر أقصر من اللعاب 1. DNA من اللعاب هو أقل كلفة وأكثر سهولة الحصول عليها، لأنها يمكن جمعها وإرسالها عبر البريد دون الحاجة إلى فصاد، وبالتالي زيادة برك الموضوع المحتملة إلى ما وراء منطقة مستجمعات المياه من المستشفيات والمختبرات 2. يمكن تحسين التحاق دراسة عندما يكون الخيار من المواضيع إعطاء عينة من اللعاب بدلا من الدم 3، 4. المخاوف بشأن كمية ونوعية الحمض النووي من اللعاب قد تقتصر على نطاق واسع لناه على الرغم من العديد من الدراسات الدراسات الحديثة تظهر مدى ملاءمة اللعاب كله، بمتوسط قدره 4.3 × 10 5 خلية في الملليمتر الواحد، لاختبار الحمض النووي على مدى القديمة مسحات الشدق الأساليب التي لم تحصل على كميات كبيرة من اللعاب 2، 3، 4، 5، 6. في حين أن الأدب متواضع موجود تبين مدى ملاءمة DNA اللعاب كله مستمد للتطبيقات بما في ذلك أساليب التنميط الجيني القائم على ميكروأري 8، 9، 10، وقد درست توجد دراسات الجيل القادم التسلسل (خ ع). كان الهدف لتحسين هذا البروتوكول استخراج الحمض النووي اللعاب كله لتحقيق أقصى قدر من كمية ونوعية لتطبيقات علم الوراثة بطريقة فعالة من حيث التكلفة التي يتم تنفيذها بسهولة في المختبرات المشتركة مع الكواشف والمواد الاستهلاكية.
استخراج الحمض النووي من اللعاب يتطلب العديد من الإجراءات: 1) جمع وتخزين، 2) تحلل الخلايا، 3) العلاج ريبونوكلياز، 4) البروتين هطول، 5) هطول الأمطار الإيثانول، 6) الإماهة الحمض النووي. الحل DNA لتحقيق الاستقرار العازلة، وصفت2 سابقا، وظائف كاف دون تغيير. ولم تبذل أية محاولة لتحسين العلاج ريبونوكلياز وDNA الخطوات الإماهة. لكل خطوة المتبقية، وقد تم تحديد العديد من المتغيرات التي يمكن أن تؤثر على الإنتاجية. تم التلاعب بها كل متغير على حدة وتقييم التحسن في المحصول وجودة إحصائيا. للمتغيرات التي عرضت لتحسين العائد و / أو نوعية الحمض النووي، وأدرجت القيم المثلى في البروتوكول النهائي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: قبل تقديم عينات من اللعاب جميع المواد أعطى موافقة مستنيرة تتفق مع المبادئ التوجيهية للعلاج من المواضيع الإنسان في مستشفى الأطفال على الصعيد الوطني.
1. اللعاب جمع وتخزين
- قبل جمع اللعاب، تأكد من فم هذا الموضوع هو حر من المواد الغذائية أو المواد الغريبة الأخرى من خلال وجود موضوع شطف الفم بالماء وتجنب الأكل أو الشرب لمدة 30 دقيقة قبل جمع العينة.
- فتح 15 مل أنبوب الطرد المركزي مع 2.5 مل من الحمض النووي استقرار عازلة 2 مع التأكد من تجنب لمس داخل الغطاء أو أنبوب، ويكون موضوع يبصقون 2.5 مل من اللعاب في حل العازلة. ملاحظة: يمكن جمع أكثر من 2.5 مل من اللعاب يؤدي إلى تدهور عينة من نسبة كافية من عينة لعازلة الاستقرار DNA. وجمع اللعاب قليلا جدا لحد عوائد المتوقعة من البروتوكول. لتقييم حجم جمع واستخدام التدرجات مرقمة على جانب ركان الأنبوب.
- استبدال الغطاء وتخلط بواسطة قلب حتى يتم الخليط المتجانس. اهتزاز قوي ليست ضرورية. تخزين العينات في RT للتخزين على المدى القصير أو 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل (> 3 أشهر).
2. الاستعدادات الأولية وتحلل الخلية
- قبل بدء الاستخراج، تسخين حمام مائي إلى 37 درجة مئوية، وإعداد دلو الجليد. سوف تكون هناك حاجة إلى ثلاثة 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية لكل عينة المستخرجة. وسوف تستخدم هذه الأنابيب الثلاثة لعقد الخلية والبروتين بيليه، المباراة النهائية المستخرجة gDNA، والأيزوبروبانول والإيثانول supernatants.
- استرجاع عينات من التخزين، وعكس عينات عدة مرات ثم دوامة على سرعة متوسطة لمدة 15 ثانية.
- الاستغناء 2.5 مل من العينة إلى نظيفة 15 مل أنبوب الطرد المركزي، وإضافة 5 مل من خلية تحلل الحل. مزيج العينة 50 مرات انعكاس، واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة.
إزالة 3. RNA
- إضافة 40 ميكرولتر من ريبونوكلياز وسولution في 100 ملغ / مل، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- إزالة عينة من 37 درجة مئوية الماء وحمام بارد على الجليد لمدة 3 دقائق.
- بعد ريبونوكلياز والحضانة، وزيادة درجة حرارة حمام الماء إلى 65 درجة مئوية للخطوة الإماهة الحمض النووي للبروتوكول.
4. البروتين وإزالة الدهون
- إضافة 50 ميكرولتر من بروتين K الحل عند 20 ملغ / مل، مزيج عدة مرات من قبل انعكاس، واحتضان في RT مدة لا تقل عن 30 دقيقة. ملاحظة: هذه هي نقطة التوقف المحتملة للبروتوكول. بعد إضافة من الحل K بروتين، ويمكن تخزين العينة في 4 درجات مئوية حتى يمكن الانتهاء من الاستخراج. لم تظهر تخزين في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة أن يكون لها تأثير كبير على عائدات استخراج أو نوعية الحمض النووي. لم يتم تقييم التخزين على المدى الطويل في هذه المرحلة.
- إضافة 1.7 مل من الهطول البروتين الحل، دوامة بقوة لمدة 20 ثانية بسرعة عالية، ومكان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- بمجرد أن يبرد العينات على الجليد لمدة 10 دقيقة، الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 3،000 x ج و 4 درجات مئوية. يجب على البروتينات عجلت تشكيل بيليه ضيق للمتابعة. إذا كان بيليه ليست ضيقة أو الحل لا تزال غائمة، العينات يمكن تبريده على الجليد لمدة 5 دقائق أكثر وتكرار الطرد المركزي. يجب أن تبقى العينات على الجليد لضمان بيليه مشددة.
5. عزل وتنقية gDNA
- في نظيفة 15 مل أنبوب الطرد المركزي، الماصة 5 مل من كحولالأيسوبروبيل و 8 ميكرولتر من الحل النقي الجليكوجين في 20 ملغ / مل.
- صب طاف تحتوي على gDNA من الخطوة 4.3 في أنبوب يحتوي على الأيزوبروبانول والجليكوجين الحل، مخلفين وراءهم البروتين عجلت بيليه. مرة واحدة تمت إضافة طاف، مزيج بلطف العينة 50 مرات من قبل انعكاس وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 3،000 x ج و 4 درجات مئوية.
- صب طاف ببطء في نظيفة أنبوب 15 مل. بعد إزالة طاف، إضافة 1 مل من الايثانول 70٪ لغسل بيليه بواسطة هزاز ببطء وتتحرك بلطف الإيثانول على بيليه عجلت عدة مرات. الإبقاء على الإيثانول في الأنبوب.
- بعد غسل الأولي، الطرد المركزي العينة لمدة 1 دقيقة في 2،000 x ج و 20 درجة مئوية. ويمكن القيام بهذه الخطوة إما الطرد المركزي في 4 درجات مئوية أو 20 درجة مئوية. وقد تبين أي أثر ملموس للحرارة لهذه الخطوة.
- بعد غسل الأولي والطرد المركزي من بيليه، صب ببطء غسل الإيثانول من الأنبوب وتجاهل، ثم إجراء غسل الثاني بتكرار الخطوات 5.3 و 5.4.
- بعد إزالة طاف من غسل الثاني، والسماح بيليه الهواء الجاف لمدة 15 دقيقة.
- إذا لم تجفف العينة تماما، الهواء الجاف لمدة 15 دقيقة أخرى.
6. الإماهة من gDNA
- مرة واحدة قد جفت عينة، إضافة 300 ميكرولتر من تريس، EDTA لترطيب gDNA بيليه المجففة.
- دوامة العينة لمدة 5 ثانية على سرعة متوسطة ومكان في65 ° C حمام الماء الساخن لمدة 1 ساعة.
- إزالة عينات من حمام الماء واحتضان O / N في RT.
ملاحظة: جميع المنتجات والكواشف المستخدمة المذكورة في الجدول المواد، وكذلك الجدول 4.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لتحديد المعايير المثلى لاستخراج الحمض النووي تم تنفيذ سلسلة من عمليات الاستخراج DNA المقترنة. تم تقسيم عينة اللعاب واحدة واختبار كل جزء واحد من اثنين من القيم الممكنة للمتغير معين. وأجريت ثمانية على الأقل مكررات من كل اختبار تقرن (على سبيل المثال، تم aliquoted عينة اللعاب واحدة لاختبار استخراج مع وبدون الأولية 50 ° C حضانة كليهما). واستند الأمثل على أربعة مقاييس معيارية: إجمالي العائد DNA، وقيمة 260/280، قيمة 260/230، والفحص البصري من الحمض النووي electrophoresed لتقييم ت...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الإجراء الحالي هو الأمثل DNA بروتوكول الاستخراج التي قد تحسن بشكل كبير العائد من الحمض النووي الوزن الجزيئي عالية مقارنة بالطرق القياسية، دون المساومة على جودة DNA. كانت الخطوة الحاسمة مع أكبر تأثير على العائد على معظم خطوة 5.2، والذي يتضمن خطوة الطرد المركزي أطول أثناء هطول الإيثانول من أي بروتوكول نشرت استعرض هنا، ما عدا واحدة أن لم يوزع على نطاق واسع 11. تم الكشف عن أية تغييرات في نوعية الحمض النووي المرتبطة بهذا الطرد المركزي أطول، مشيرا إلى أن معظم الحمض النووي الم...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 (دعم DC009453 لمجلس العمل).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 15 مل أنابيب الطرد المركزي | فيشر | 12-565-268 | |
| محلول تحلل الخلية | Qiagen | 158908 | |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | |
| محلول ترسيب البروتين | Qiagen | 158912 | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | |
| Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 | |
| 70٪ إيثانول | فيشر | 04-355-305 | |
| تريس-EDTA (TE) | فيشر | BP2473-1 | |
| كلوريد الصوديوم | فيشر | AC194090010 | |
| تريس هيدروكلوريك | فيشر | BP1757-100 | |
| EDTA (0.5 م) محلول | فيشر | 03-500-506 | |
| كبريتات الصوديوم دوديسيل | فيشر | BP166-100 & nbsp ؛ | |
| خلاط دوامة تناظري | فيشر | 02-215-365 | |
| طرد مركزي 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
المراجع
- Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
- Min, J. L., et al. High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes. Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).
- Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy. Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).
- Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet. European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).
- Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).
- Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16). Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).
- Dawes, C. Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth. Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).
- Bahlo, M., et al. Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).
- Hu, Y., et al. Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison. PLoS ONE. 7 (3), e33968(2012).
- Simmons, T. R., et al. Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families. Human Heredity. 70, 232-244 (2010).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol precipitation of DNA. Focus. 7, 1-2 (1985).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- DePristo, M., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
