Method Article

الميكروسكيل Electroporator لتوصيل متسلسل الجزيئية بمساعدة دوامة

DOI:

10.3791/51702

⸱

August 7th, 2014

 , 
1The Rowland Institute, Harvard University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ووضعت دوامة ميكروفلويديك منصة Electroporation للمساعدة للتسليم متتابعة من الجزيئات متعددة في السكان الخلية متطابقة مع التحكم جرعة دقيقة ومستقلة. حجم استنادا خطوة تنقية الخلية المستهدفة Electroporation للسبقت النظام ساعد على تعزيز كفاءة تسليم الجزيئية وبقاء الخلية المصنعة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلقت Electroporation للباهتمام متزايد في السنوات الماضية، لأنها هي تقنية قوية جدا لإدخال جسديا تحقيقات الجزيئية الخارجية غير نفيذ في الخلايا. تقارير هذا العمل منصة Electroporation للميكروفلويديك قادرة على أداء العديد تسليم جزيء إلى خلايا الثدييات مع مراقبة دقيقة والمعلمة الجزيئية التي تعتمد على. قدرة النظام على عزل الخلايا مع توزيع حجم موحد يسمح لأقل من التباين في كفاءة Electroporation للفي نظرا لقوة الحقل الكهربائي. وبالتالي تعزيز قابلية العينة. وعلاوة على ذلك، تتيح ميزة عملية التصور من أجل مراقبة عملية امتصاص الجزيئية فلوري في الوقت الحقيقي، والذي يسمح الجزيئية التعديلات المعلمة التسليم الفوري في الموقع لتعزيز الكفاءة. لإظهار قدرات العظمى من منصة عنها، الجزيئات ذات أحجام مختلفة والشحنات الكهربائية (مثل ديكستران مع ميغاواط من 3،000 و 70،000 دا) كانتتسليمها إلى خلايا سرطان الثدي النقيلي مع الكفاءات تسليم عالية (> 70٪) لجميع الجزيئات التي تم اختبارها. وقد أثبتت منصة وضعت إمكاناتها لاستخدامها في توسيع مجالات البحث حيث Electroporation للتقنيات يمكن أن تكون مفيدة على رقاقة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات الأخيرة، أصبح استخدام النبضات الكهربائية لتسهيل تسليم عصاري خلوي من الجزيئات خارج الخلية وسيلة جذابة بالتلاعب خلايا الثدييات. 1 هذه العملية، التي تعرف أيضا باسم Electroporation لل، permeabilizes عكسية الغشاء الخلوي، مما يسمح للجزيئات الغشاء بطبيعتها غير منفذة للوصول الوسط بين الخلايا إلى الخلايا. لأنه يمكن إدخال تقريبا أي جزيء في العصارة الخلوية عبر خلق المسام مؤقتة في غشاء من أي نوع من الخلايا باستخدام Electroporation لل، تم الإبلاغ عن هذه التقنية بأنها أكثر استنساخه، قابلة للتطبيق عالميا، وأكثر كفاءة من الطرق الأخرى بما في ذلك بوساطة فيروس والكيميائية والنهج البصرية. 2-3 وقد استخدمت هذه التقني....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خلية التحضير

  1. لوحة 1 × 10 5 خلية / مل من النقيلي خط خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 في حجم 10 مل لكل زراعة الأنسجة T75 قارورة في يبوفيتش L-15 المتوسطة تستكمل مع 10٪ (V / V) مصل بقري جنيني و 1 ٪ البنسلين، الستربتومايسين.
  2. احتضان MDA-MB-231 الخلايا في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع CO 0٪ 2 البيئة.
  3. خلايا الحصاد للتجارب بعد 2 أيام البذر عن طريق علاج الخلايا مع 0.25٪ التربسين-EDTA لمدة 2 دقيقة وتعطيل النشاط الأنزيمي التربسي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسليم electroporator ميكروفلويديك موازية وضعت الجزيئات مع أحجام متنوعة والشحنات الكهربائية في الخلايا الحية سرطان الثدي النقيلي. تم تحديد تسليم الجزيئي الناجح نوعيا من خلال رصد التغيرات في كثافة الفلورسنت من الخلايا التي تدور حول electroporated في الموقع وأكدته القياسات الكمية عبر تحليل التدفق الخلوي. الشكل 4A تبين أن 90٪ من الخلايا المعالجة للامتصاص 70،000 دا ديكستران محايد. للتحليل الإحصائي، أنشئ عتبة كثافة لكل fluorophore هذا أن الغالبية (> 99٪) من .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع منصة Electroporation للبشكل متوازي جديدة، وتعزيز 10 أضعاف في الإنتاجية والكفاءة في تقديم متعددة جزيء تم تحقيقه بالإضافة إلى جميع المزايا التي يوفرها نظام غرفة واحدة وضعت سابقا. تشمل 18 المزايا المتاحة سابقا (ط) قبل تنقية استهداف الخلايا مع توزيع موحد لتعزيز حجم جدوى، (ب) التحكم جرعة الجزيئية الدقيقة والفردية، و (iii) انخفاض التيار الكهربائي التشغيلي. Fluorescently تم اختيار dextrans وصفت بأنها جزيئات من الفائدة لأنها متاحة بسهولة في مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية، .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويؤيد هذا العمل من قبل برنامج رولاند زميل جديد. فإن الكتاب أود أن أعرب عن امتناني للعلماء والموظفين في معهد رولاند في جامعة هارفارد: كريس ستوكس لمساعدته في تطوير مبنية خصيصا، بمساعدة الحاسوب الإعداد السيطرة على ضغط، وديان Schaak، دكتوراه لها مدخل للتعامل مع عينة البيولوجي، وينفيلد هيل لتطوير الإعداد الكهربائية، Alavaro سانشيز، دكتوراه لمنح الوصول إلى تدفق عداد الكريات، سكوت بيفيس، كيني روجرز دون سبنسر وبالقطع لمكونات السباكة الميكانيكية اللازمة لإعداد الضغط. ملفقة الماجستير ميكروفلويديك في مركز لأنظمة النانو (CNS) في جامعة هارفارد.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MDA-MB-231 خط الخلايا السرطانيةمجموعة الثقافة من النوع الأمريكي (ATCC)HTB-26
Leibovitz s L-15Medium Cellgro ، Mediatech ، Inc.10-045-CV
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Gibco، Life Technologies16000-044
البنسلين الستربتومايسينسيجما-ألدريتشP4333
ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS)Cellgro، Mediatech، Inc.21-030
TrypsinGibco ، Life Technologies25200-056
مقياس التدفق الخلوي easyCyte HTMillipore0500-4008
Oxygen Plasma CleanerTechnics Micro-RIE
Dektak 6M SurfacerVeeco
KMPR 1050Microchem
SYLGARD 184 سيليكون مطاط للطام KITDow Corning
غاز النيتروجين المضغوطAirgasNI 300
منظم الضغط العاليMcMaster-Carr6162K22
منظم المصبMcMaster-Carr4000K563
مشعب صمام عالي السرعة 3/2way-8Festo
صمام فحص مضمنIdex Health and ScienceCV3320
5/32 "OD × 3/32" معرف أنابيب البولي يوريثانPneumadynePU-156F-0
1/4 "OD X 0.17" معرف أنابيب البولي يوريثان أنابيبPneumadynePU-250PB-4
1/16 "أنابيب نظرة خاطفةFestoP1533
1/32" أنابيب نظرة خاطفةIdex الصحة والعلومP1569
نظرة خاطفة على نقابات الأنابيبIdex الصحة والعلومP881
مولد النبضHP8110A
أسلاك الألومنيومشركة بوب مارتن6061 ALUM
راسم الذبذباتAgilentDSO3062A
50 مل أنابيب الطرد المركزيVWR21008-178
15 مل أنبوب الطرد المركزيVWR21008-216
قارورة ثقافة T75VWR82050-862
ديكستران ، تتراميثيل رودامين ، 3,000 ميجاوات ، أنيونيكجيبكو ، لايف تكنولوجيزD3307
ديكستران ، رباعي ميثيل رودامين ، 70،000 ميجاوات ، محايد & nbsp ؛جيبكو ، لايف تكنولوجيزD1819
ديكستران ، تكساس ريد ، 3,000 ميجاوات ،جيبكو محايد ، لايف تكنولوجيزD3329
محلول

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
  2. Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
  3. Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic ElectroporationSequential Molecular DeliveryVortex assisted ElectroporatorCell TrappingFlow CytometryElectric Pulse ApplicationMolecular UptakeBreast Cancer CellsDextran DeliveryPneumatic Flow Control

Related Articles