يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بروتوكول لتصيب

11.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51703

⸱

يونيو 26, 2014

 , 
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

في هذه المقالة

ملخص

وقد برزت C. ايليجانس نموذجا وراثية جديدة لدراسة التفاعلات المضيف الممرض. نحن هنا وصف بروتوكول لتصيب C. ايليجانس مع السالمونيلا التيفية الفأرية إلى جانب تقنية التدخل رني المزدوج حبلا لدراسة دور الجينات المضيف في الدفاع ضد العدوى السالمونيلا.

الملخص

في العقد الماضي، C. برز ايليجانس كما كائن حي اللافقارية لدراسة التفاعلات بين المضيفين ومسببات الأمراض، بما في ذلك الدفاع المضيف ضد البكتيريا سالبة الجرام السالمونيلا التيفية الفأرية السالمونيلا يحدد العدوى المستمرة في الأمعاء من C. ايليجانس والنتائج في الموت المبكر من الحيوانات المصابة. وقد تم تحديد عدد من الآليات الحصانة في C. ايليجانس للدفاع ضد العدوى السالمونيلا. الالتهام الذاتي، والحفاظ تطويريا تدهور الليزوزومية المسار، وقد تبين للحد من تكرار السالمونيلا في C. وايليجانس في الثدييات. هنا، يوصف بروتوكول لتصيب C. ايليجانس مع السالمونيلا التيفية الفأرية، الذي يتعرض لالسالمونيلا الديدان لفترة زمنية محدودة، على غرار عدوى السالمونيلا في البشر. يقصر عدوى السالمونيلا بشكل كبير من عمر C. ايليجانس <م />. الالتهام الذاتي باستخدام الجينات الأساسية تيرو-1 كمثال على ذلك، ونحن معا هذه الطريقة الإصابة بفيروس C. ايليجانس رني تغذية النهج وأظهر هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة وظيفة C. ايليجانس الجينات المضيف في الدفاع ضد العدوى السالمونيلا. منذ C. ايليجانس الجينوم هي المكتبات رني كله المتاحة، هذا البروتوكول يجعل من الممكن لفحص شامل لC. الجينات ايليجانس التي تحمي ضد السالمونيلا ومسببات الأمراض المعوية الأخرى باستخدام المكتبات رني على نطاق الجينوم.

المقدمة

الديدان الخيطية التربة الحرة الحية انواع معينة ايليجانس هو كائن نموذج بسيط ولين العريكة وراثيا تستخدم لدراسة العديد من الأسئلة البيولوجية. C. ايليجانس موجود يغلب كما المنحرفين-التسميد الذاتي. يتم إنشاؤها من قبل الذكور بشكل عفوي غير انفصال للكروموسوم X أثناء عملية تكوين الأمشاج 1،2. في ظل وجود وفرة من المواد الغذائية، C. ايليجانس تطوير مستمر من خلال أربع مراحل اليرقات إلى الكبار. درجة الحرارة يؤثر أيضا C. التنمية ايليجانس؛ لوحظ تطور أسرع عند ارتفاع درجات الحرارة. في المختبر، C. ايليجانس هو مثقف في درجة حرارة قياسية من 20 درجة مئوية على لوحات أجار مع المصنف القولونية بكتيريا الإشريكية (سلالة OP50) كغذاء 1،2.

في العقد الماضي، C. برز ايليجانس كما كائن حي اللافقارية لدراسة التفاعلات المضيف الممرض 3-5. في الطبيعة، C. ايليجانس يأكل البكتيريا كما nutrien لهار المصدر 1،2. العادية الطعام المختبر الجرثومي، OP50، يمكن أن تكون بديلا بسهولة مع مسببات الأمراض الأخرى لدراسة التفاعلات بين C. ايليجانس وأي الممرض الذي تم اختياره. في ظل هذه الظروف، الأمعاء هو الموقع الرئيسي للعدوى. في الواقع، وقد تبين مجموعة واسعة من مسببات الأمراض البكتيرية للإصابة قاتلة C. ايليجانس 3-5.

بكتيريا السالمونيلا سالبة الجرام هو الممرض الجهاز الهضمي التي تسبب الأمراض التي تنقلها الأغذية الإنسان في العالم 6،7. C. ايليجانس هو المضيف نموذجا جيدا للالسالمونيلا التيفية الفأرية كما يعيد هذه البكتيريا والالتهابات المعوية يسلك المستمرة 8-10. C. وقد استخدم ايليجانس لتحديد كل من الرواية والعوامل المعروفة سابقا الفوعة السالمونيلا 11. ومن المثير للاهتمام، وC. الجهاز المناعي ايليجانس يحد بنجاح تكرار السالمونيلا. وقد أفيد في وقت سابق ان inhibition الجينات الالتهام الذاتي يجعل زيادة تكرار السالمونيلا في C. ايليجانس، مما أدى إلى وفاة مبكرة من الديدان المصابة 10. Macroautophagy (المشار إليها هنا الالتهام الذاتي) هو عملية دينامية تنطوي على إعادة ترتيب الأغشية التحت خلوية لعزل السيتوبلازم والعضيات للتسليم إلى يحلول لتدهور 12. وقد تم الإبلاغ عن الالتهام الذاتي للحد من تكرار السالمونيلا في C. ايليجانس و10،13 في الثدييات.

وC. كان ايليجانس الجينوم أول جينوم حقيقية النواة متعددة الخلايا متسلسلة؛ هو استجابة للعلاج رني 14-16. علاوة على ذلك، رني يمكن إدارتها بفعالية بإخضاع الديدان لاستيعاب البكتيريا التي تحتوي على الحمض النووي الريبي مزدوج الخيط من الجين المستهدف، والمعروفة باسم رني تغذية 16،17. تم إنشاؤها الجينوم المكتبات التغذية رني كامل لالجينوم على نطاق رني الفرز 16،18. هنا، والسالمونيلا العدوى المواليةويقترن tocol مع رني تغذية للسماح اختبار C. الجينات ايليجانس الاهتمام لقدرتها على حماية ضد عدوى السالمونيلا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. لوحات XLD (الزيلوز يسين Desoxycholate) آجار

XLD أجار هو وسيلة النمو الانتقائي لالسالمونيلا، والذي يظهر كما مستعمرات سوداء على لوحات أجار XLD. ومع ذلك، إذا كان هناك أي مخاوف من التلوث، ويمكن أن تكون بديلا لوحة LB العادية.

  1. تزن 5.5 غرام من XLD أجار وresuspend في 5 مل من الماء منزوع الأيونات.
  2. تخلط جيدا حتى كل أجار هو الرطب. إضافة 95 مل منزوع الأيونات الماء حتى تختفي جميع الكتل والمتوسطة معلق تماما.
  3. تغلي على المديين المتوسط ​​وتذوب تماما (لا الأوتوكلاف).
  4. تبريد المتوسطة في درجة حرارة الغرفة إلى 50 درجة مئوية.
  5. صب 25 مل أجار في كل 95 × 15 ملم (قطر × الارتفاع) لوحة (لوحات مختومة مع parafilm يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر).

2. النيماتودا نمو متوسط ​​(NGM) رني تغذية لوحات

إعداد C. وقد وصفت لوحات ايليجانس NGM سابقا 1 9. هنا يوصف إجراء لفترة وجيزة لإضافة الأمبيسلين المضادات الحيوية ورني محفز كيميائية الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) في وسائل الإعلام NGM لجعل لوحات التغذية رني.

  1. حل 3 غرام كلوريد الصوديوم و 2.5 جرام Bacto ببتون في 1 لتر منزوع الأيونات الماء.
  2. إضافة 17 غرام Bacto أجار في وسائل الإعلام.
  3. الأوتوكلاف وسائل الإعلام لمدة 45 دقيقة وتبريد وسائل الإعلام إلى 50 درجة مئوية في حمام مائي.
  4. إضافة الحلول التالية: 1 مل الكولسترول (5 ملغ / مل في 95٪ من الإيثانول)، 1 مل 1 M و CaCl 2، 1 مل 1 M MgSO 4، و 25 مل 1 M العازلة فوسفات البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني 6.0). تخلط جيدا.
  5. إضافة 1 مل 1 M IPTG و 500 ميكرولتر الأمبيسلين (100 ملغ / مل في الماء المعقم).
  6. مزيج الحل جيدا وتصب 60 × 15 ملم (قطر × الارتفاع) لوحات بتري باستخدام المعونة الماصة و 25 مل ماصة المصلية التالية الإجراءات العقيمة. ملء كل لوحة مع 12 مل أجار. ويمكن تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.

"jove_title"> 3. إعداد الحيوانات المعالجة رني للعدوى

الجينات الالتهام الذاتي الأساسية تيرو-1 يستخدم كمثال لفحص وظيفة الجين في الدفاع المضيف ضد عدوى السالمونيلا. ويوضح الإجراءات التجريبية في الشكل 1 والجدول 1. بروتوكول لإعداد الحيوانات رني المعاملة للعدوى يلي، مع اليوم كل خطوة تجريبية نظرا بين قوسين.

  1. تطعيم تيرو-1 التغذية رني والسيطرة على ناقلات الفارغة L4440 رني تغذية البكتيريا عن طريق وضع رقائق من -80 درجة مئوية البكتيريا المجمدة في 2 مل LB المتوسطة تستكمل مع 100 ملغ / مل الأمبيسلين (يوم 1). كرر هذه الخطوة مرة واحدة في الأسبوع خلال التجربة بأكملها لديها البكتيريا رني الطازجة. تخزين الثقافة في 4 ° C الثلاجة عندما لا تستخدم.
  2. البذور 100 مل من ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها رني على لوحات رني. إعداد ثلاثة تيرو-1 رني وثلاثة السيطرة الخامس فارغةector لوحات رني. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل (اليوم 2).
  3. إزالة لوحات رني من الحاضنة 37 درجة مئوية، والسماح لهم ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء. التقاط تغذية جيدة L4 النوع البري المنحرفين N2 ونقلها إلى تيرو-1 رني والسيطرة فارغة لوحات رني ناقلات. وضع ثلاثة الديدان في لوحة، وعلى لوحات ثلاث نسخ. في نفس اليوم، وإعداد لوحات رني كما هو موضح في الخطوة 3.2 (اليوم 3).
  4. احتضان لوحات رني مع الديدان في الحاضنة 20 درجة مئوية لمدة 36-40 ساعة، ونقل الديدان لوحات رني المقابلة الطازجة المعدة في الخطوة 3.3. بعد أن يتم نقل الديدان، واحتضان لوحات في 20 درجة مئوية لمدة 64 ساعة حاضنة (يوم 4).

4. إعداد السالمونيلا للعدوى

  1. خط السالمونيلا -80 ° C الأسهم المجمدة في 1 XLD أجار لوحة واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية خلال الليل (اليوم 5 ).
  2. اختيار معزولة جيدا مستعمرة السالمونيلا والأسود تطعيم في 2 مل LB المتوسطة عند 37 درجة مئوية مع الهز بين عشية وضحاها (اليوم 6).
  3. البذور 80 مل السالمونيلا الثقافة بين عشية وضحاها في 1 C. ايليجانس 60 × 15 ملم (قطر × الارتفاع) لوحة NGM آغار وإعداد 6 لوحات في المجموع. احتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 ساعة. ثقافة البكتيرية يجب أن تجف وتشكيل العشب على لوحة (يوم 7).

5. الديدان تصيب رني تعامل مع السالمونيلا

  1. نقل تيرو-1 والسيطرة فارغة ناقلات المعالجة رني المنحرفين L4 N2 (ذرية من الديدان التي أنشئت في الخطوة 3) لوحات السالمونيلا المعالجة رني. وضع الديدان في 40 لوحة في 3 لوحات لكل مجموعة. احتضان لوحات دودة عند 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة (يوم 7).
  2. إعداد مجموعة واحدة من لوحات رني جديدة كما هو موضح في الخطوات 3.1 و 3.2 (يوم واحد 7 و يوم 8).
  3. بعد 48 ساعة العدوى، ونقل الديدان المصابة السالمونيلا إلى لوحات رني المقابلة أعدت في الخطوة 5.2 واحتضان عند 20 درجة مئوية (يوم 9).

6. البقاء على قيد الحياة الفحص

  1. يسجل بقاء الديدان اليومية ونقل الديدان لوحات رني المقابلة الطازجة خلال فترة وضع البيض. إعداد مجموعة من لوحات رني الطازجة قبل كل نقل دودة كما هو موضح في الخطوات 3.1 و 3.2. لمس جسم الدودة (الرأس، والجزء الأوسط والذيل) بلطف مع سلك البلاتين بالارض نهاية. يتم احتسابه دودة في عداد الموتى إذا لوحظ أي حركة للجسم الدودة.
  2. يسجل بقاء الديدان يوميا أو مرة كل يومين، ونقل الديدان لوحات رني المقابلة الطازجة مرتين في الاسبوع بعد وقف الديدان وضع البيض.
  3. بعد موت جميع الديدان، وتجميع البيانات من البقاء على قيد الحياة لوحات ثلاث نسخ كما مجموعة بيانات واحدة. إدخال البيانات بقاء كل مجموعة في صناعة البرمجيات الإحصائية المناسبة مثل GraphPad Prism لتوليد منحنيات البقاء على قيد الحياة وأداء كابلان ماير تحليل البقاء على قيد الحياة. يتم تكرار التجربة بأكملها مرة واحدة على الأقل للتأكد من النتيجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عند 20 درجة مئوية، ومتوسط ​​عمر من النوع البري الديدان N2 هو 17 يوما (الشكل 2A والجدول 2). يقلل الإصابة السالمونيلا بشكل كبير من متوسط ​​عمر الديدان N2 إلى 10.5 يوما (ع = 0.0002، اختبار تسجيل رتبة) (الشكل 2A ).

إذا C. ايليجانس الجينات تلعب دورا هاما في الدفاع ضد العدوى السالمونيلا، ومن المتوقع أن تثبيط لها سوف تضفي القابلية للعدوى السالمونيلا. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

C. ايليجانس هو كائن نموذج الوراثية بسيط هو أن يأكل البكتيريا كمصدر المغذيات فيها. وبالتالي، فمن السهل أن تحل محل المواد الغذائية البكتيرية العادية مع الممرض الأمعاء للتحقيق في التفاعلات بين C. ايليجانس والممرض الذي تم اختياره. هنا يوصف بروتوكول لعدوى السالمونيلا والجمع بين C. ايليجانس رني تغذية العلاج لدراسة دور الجينات المضيف في الدفاع ضد العدوى السالمونيلا. بروتوكولات الإصابة السابقة فضح C. الديدان ايليجانس إلى البكت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

نشكر الدكتورة ديان Baronas-ويل لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل وحدة التحليل المالي تشارلز إي شميت كلية العلوم غرانت البذور ومنحة الشيخوخة من مؤسسة إليسون الطبية لKJ

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
LB مرقفيشرBP9723-500
XLD أجارEMD للكيماويات1.05287.0500
باكتو أجارفيشرDF0140-01-0
ببتونفيشرBP1420-500
كلوريد الصوديومفيشرS671-500
كلوريد الكالسيومفيشرC69-500
كبريتات المغنيسيومفيشرM65-500
IPTGالتكنولوجيا الحيوية الذهبية12481C50
الكوليسترولسيجماC8667-25G
أمبيسلينفيشرBP1760-25
السالمونيلا التيفيموريوم< / em>ATCCATCC14028
طبق بتري 95 × 15 ممفيشرFB0875714G
صحن بتري 60 × 15 مم فيشر08-757-13A
فالكون ماصة مصليةفيشر13-668-2
فالكون اكسبرس بيبيت إيدفيشر13-675-42
ماكس Q6000 حاضنة اهتزاز  ثرمو ساینتيكSHKE6000-7
بيرسيفالI-36DL
حاضنة

المراجع

  1. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  2. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  3. Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
  4. Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
  5. Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
  6. Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
  7. Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
  8. Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
  9. Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
  10. Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
  11. Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
  12. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
  13. Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
  14. The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  15. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  16. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
  17. Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
  18. Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
  20. Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
  21. Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

C elegans RNAi bec 1 XLD NGM L4 RNAi Salmonella typhimurium
بروتوكول لتصيب
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.