مقالة منهجية

خلية كاملة تسجيلات التصحيح، المشبك من Morphologically- وحددت Neurochemically-الحصين Interneurons

DOI:

10.3791/51706

⸱

سبتمبر 30, 2014

 ,  , 
1Institute of Integrative Neuroanatomy, NeuroCure Cluster of Excellence, Charité Universitätmedizin

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم التحكم في الشبكات القشرية من قبل مجموعة صغيرة، ولكنها متنوعة من interneurons المثبطة. ولتحقيق الوظيفي للinterneurons يتطلب تسجيل المستهدفة وتحديد دقيق. الموصوفة هنا هو نهج مجتمعة تشمل تسجيلات خلية كاملة من أزواج واحدة أو جانب synaptically من الخلايا العصبية بين الخلايا مع وضع العلامات، خاصة بعد المورفولوجية والتحليل immunocytochemical.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GABAergic interneurons المثبطة تلعب دورا مركزيا في الدوائر العصبية في الدماغ. تشمل Interneurons مجموعة فرعية صغيرة من السكان العصبية (10-20٪)، ولكن تظهر مستوى عال من الفسيولوجية، الصرفي، وعدم التجانس الكيميائية العصبية، والتي تعكس وظائفها المتنوعة. لذلك، والتحقيق في interneurons يوفر نظرة ثاقبة على مبادئ تنظيم وظيفة الدوائر العصبية. هذا، ومع ذلك، يتطلب نهجا الفسيولوجية وتشريحي عصبي متكامل لاختيار وتحديد أنواع عصبون الفردية. خلية كاملة تسجيل من شرائح الدماغ الحادة من الحيوانات المعدلة وراثيا، معربا عن بروتينات الفلورسنت تحت المروجين للعلامات عصبون محددة التصحيح، المشبك، ويوفر وسيلة فعالة لاستهداف وelectrophysiologically تميز الخصائص الذاتية ومتشابك من أنواع عصبون محددة. جنبا إلى جنب مع وضع العلامات الصبغة داخل الخلايا، ويمكن تمديد هذا النهج مع ما بعد مو خاصةتحليل rphological وimmunocytochemical، مما يتيح تحديد منهجي من الخلايا العصبية المسجلة. هذه الأساليب يمكن أن تكون مصممة لتناسب مجموعة واسعة من المسائل العلمية المتعلقة بالخصائص الوظيفية لأنواع مختلفة من الخلايا العصبية القشرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكانت الدوائر العصبية قرن آمون منذ فترة طويلة موضوع تدقيق مكثف، فيما يتعلق بكل من علم التشريح وعلم وظائف الأعضاء، وذلك بسبب الدور الأساسي في التعلم والذاكرة، فضلا عن الملاحة المكانية في كل من البشر والقوارض. وبالمثل، فإن منظمة الصفحي بارزة، ولكن بسيطة من الحصين يجعل هذه المنطقة وهو موضوع مفضل من الدراسات التي تتناول الخصائص التركيبية والوظيفية للشبكات القشرية.

وتتألف الدوائر من خلايا قرن آمون مثير الرئيسية (> 80٪) وأصغر (10-20٪)، ولكن فوج متنوعة للغاية من interneurons المثبطة 1-3. Interneurons الافراج حامض γ-امينوبوتيريك (GABA) من المحطات محوار بهم الذي يعمل في ionotropic سريع GABA A مستقبلات (GABA A روبية) وبطيئة metabotropic مستقبلات GABA B (GABA B روبية) 4. هذه الآليات المثبطة موازنة الإثارة وتنظيم استثارة الخلايا الرئيسية، وبالتاليتوقيت الأشعة تحت الحمراء ونمط التصريف. ومع ذلك، GABA سراحه من interneurons تعمل ليس فقط على الخلايا الرئيسية، ولكن أيضا على interneurons أنفسهم 5،6. قبل وبعد المشبكي مستقبلات توسط تنظيم ردود الفعل والتفاعلات المتبادلة المثبطة بين أنواع مختلفة من عصبون. ويعتقد أن هذه الآليات المثبطة في شبكات عصبون أن تكون مركزية في جيل وتشكيل أنماط النشاط السكاني، في التذبذبات خاصة على ترددات مختلفة 7.

خلية كاملة تسجيل التصحيح، المشبك هي طريقة راسخة لفحص الخصائص الذاتية والتفاعلات متشابك من الخلايا العصبية. ولكن نظرا لتنوع كبير من أنواع عصبون، والتحقيق في interneurons المثبطة ويتطلب التشخيص الدقيق للخلايا المسجلة. كما تتميز أنواع عصبون قرن آمون بواسطة سمات مميزة المورفولوجية والكيميائية العصبية علامة التعبير، التشريحية مجتمعة والبريد immunocytochemicalيمكن xamination توفر وسيلة لتحديد الهوية الدقيق 6،8،9 عصبون.

في هذه الورقة وصفنا هذا النهج التجريبي الذي يتم الجمع بين خلية كاملة تسجيلات التصحيح المشبك من الخلايا العصبية واحدة أو أزواج جانب synaptically مع وضع العلامات داخل الخلايا، تليها بعد خاصة التحليل الصرفي وimmunocytochemical، مما يسمح لتوصيف بطيئة GABA B مستقبلات بوساطة التأثيرات المثبطة interneurons في تحديدها. وكمثال على ذلك، ونحن نركز على نوع واحد رئيسي للعصبون، مجموعة فرعية من ما يسمى "خلايا سلة" (BC)، والتي يعصب سوما والتشعبات القريبة من أهدافها بعد المشبكي ويتميز "ارتفاعه السريع" (FS) تصريف نمط، محور عصبي تغطي طبقة كثيفة جسم الخلية، والتعبير من البروتين parvalbumin ملزم الكالسيوم (PV) 10،11. تعرض هذه التيارات interneurons المثبطة بعد المشبكي كبيرة، وكذلك قبل بارزتعديل متشابك من إنتاجها متشابك، ردا على GABA B R تفعيل 12. مزيج من الأساليب المذكورة هنا يمكن تطبيق جيد على قدم المساواة للتحقيق آليات فعلية أو متشابك في مجموعة متنوعة من غيرها من أنواع الخلايا العصبية التي تم تحديدها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات والحيوان الصيانة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية، وقانون رعاية الحيوان الألمانية، المجلس الأوروبي التوجيه 86/609 / EEC فيما يتعلق بحماية الحيوانات، والمبادئ التوجيهية من السلطات المحلية (برلين، T-0215/11: بيان الأخلاق )

1. إعداد شرائح الحادة الحصين

  1. اتخاذ الفئران المعدلة وراثيا (17 إلى 24 يوما من العمر)، معربا عن بروتين فلوري فينوس / YFP تحت المروج vGAT التي تصف غالبية interneurons المثبطة القشرية 13. قطع رأس الفئران. بسرعة تشريح الدماغ (<40 ثانية) في semifrozen، carbogenated (95٪ O 2/5٪ CO 2) السائل القائم على السكروز الاصطناعي النخاعي (السكروز-ACSF، الشكل 1A).
  2. تقييم تشريح الدماغ الفئران لفينوس / YFP مضان مع 505 نانومتر مصباح LED و515 مرشح الانبعاثات، التي شنت على زوج من نظارات واقية.
  3. إزالة الثلث الأمامي من القشرة وcerebellum. ثم فصل نصفي الكرة الأرضية، مع كل مشرط. إزالة السطح الظهري من القشرة لتوفير سطح مستو لالغراء الدماغ أسفل، كما هو موضح سابقا 14.
  4. قطع شرائح عرضية (300 ميكرون) من تشكيل الحصين على vibratome، يجب أن تكون محاطة نصفي الكرة الأرضية مع semifrozen، carbogenated السكروز-ACSF (الشكل 1B) 14. إزالة مناطق إضافية من القشرة منقاري، الدماغ المتوسط ​​والدماغ. نقل كل شريحة إلى غرفة إجراء المغمورة التي تحتوي على السكروز-ACSF التي carbogenated وتحسنت إلى 35 درجة مئوية.
  5. ترك شرائح لاسترداد في 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة من الوقت للشريحة الأخيرة دخول ACSF تحسنت. هل هذا من أجل تنشيط عمليات التمثيل الغذائي وتسهيل إعادة إغلاق العمليات العصبية قطع. ثم نقل إلى درجة حرارة الغرفة لتخزين (الشكل 1C).

2. تصنيع وتعبئة للتسجيل الماصات

  1. بوالماصات ليرة لبنانية التصحيح من الزجاج الشعيرات الدموية، بحيث يتم التوصل إلى المقاومة ماصة من 2-4 MΩ عندما تمتلئ تصفية (فلتر حقنة، حجم المسام: 0.2 ميكرون) حل داخل الخلايا التي تحتوي على 0.1٪ biocytin (لوصفها الخلايا). يبقي الحل داخل الخلايا المبردة على الجليد لمنع تدهور مكوناته.
  2. ملء الماصات التصحيح لتحديد التيارات بعد المشبكي مع محلول يحتوي على الكلور منخفضة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية - تركيز (E R (الكلورين) = -61 بالسيارات، انظر قائمة الحل).
  3. لإقران التسجيلات لتحديد مستقبلات بوساطة الردود قبل المشبكي، وملء ماصات التصحيح مع حل داخل الخلايا مع انخفاض الكالسيوم قدرة 2+ عازلة لمنع التدخل في الإفراج الارسال presynaptically، فضلا عن 4 أضعاف أعلى الكلور - تركيز (E R (الكلورين) = -20 بالسيارات) لتحسين إشارة إلى الضجيج من IPSCs المرصودة 5 السماح تقييم دقيق من التركيب الدوائيonsiveness. لاحظ أن تغيير الكلور - تركيز يمكن أن يغير حركية IPSC 15.

3. خلية كاملة تسجيل التصحيح، المشبك من FS-INS

  1. Carbogenate في ACSF وتتغذى من خلال نظام نضح إلى غرفة تسجيل، عن طريق مضخة تحوي (الذي يزيل أيضا ACSF من غرفة تسجيل من خلال خط الشفط، الشكل 2A). تشغيل جميع المعدات على الإعداد استعدادا للتسجيل.
  2. نقل شريحة إلى غرفة تسجيل وعقد في مكان مع خاتم البلاتين موتر مع الألياف واحدة من الحرير. ضع شريحة بحيث تكون الطبقة (شارع). الهرمية CA1 من يدير عموديا عبر مجال الرؤية، مما يتيح الوصول مع 2 الماصات على كل من شارع. المشععة وشارع. oriens في وقت واحد (أرقام 2C و4A).
  3. وضع الغرفة في الإعداد والبدء نضح من carbogenated وحرارة (32-34 درجة مئوية) تسجيل وCSF بمعدل تدفق 5-10 مل / دقيقة.
  4. تقييم جودة شريحة تحت البصريات في مدينة دبي للإنترنت-IR 40X التكبير موضوعي، وتصور مع كاميرا CCD عرضها على الشاشة. نفترض جودة شريحة جيدة اذا يمكن رؤية عدد كبير من الخلايا الهرمية CA1 يتناقض معتدلة مستديرة (PC CA1) في شارع. الهرمية في أعماق 20-30 ميكرومتر أدناه سطح أملس وذا الفوهات طفيفة (الشكل 2C). شرائح نوعية رديئة تحتوي على أعداد كبيرة من يتناقض إلى حد كبير، وخلايا منكمشة أو تورم، مع سطح شريحة متفاوتة.
  5. تحديد FS interneurons المفترض تحت epifluorescence إضاءة كتلك التعبير عن فينوس / YFP (الشكل 2B)، مع somata متعدد الأقطاب كبير في أو بالقرب من شارع. الهرمية. حدد الخلايا معقول في أعماق شريحة (50-100 ميكرون، الشكل 2C) من أجل الحفاظ على أفضل سلامتها المورفولوجية.
  6. جبل القطب تسجيل في حامل ماصة على headstage. ثم التطبيقلاي منخفضة، وضغط إيجابي (20-30 ميللي بار) من خلال خط الأنبوب. خفض ماصة لسطح شريحة، ويقابل قليلا إلى مركز الخلايا العصبية المحدد.
  7. الحصول على خلية كاملة التكوين تسجيل كما هو موضح سابقا 14،16 وانظر الشكلين أيضا 2D و 2E:
    1. استهداف خلية: زيادة الضغط على 70-80 ميللي بار وخفض بسرعة ماصة من خلال شريحة إلى ما فوق سوما من الخلية المحددة (الشكل 2D، أعلى).
    2. الاقتراب من الخلية: اضغط على ماصة ضد غشاء الخلية لإنتاج "الدمل" على ذلك (الشكل 2D، أعلى). تنفيذ هذه الخطوة على وجه السرعة، من أجل منع وضع العلامات biocytin من الخلايا المجاورة.
    3. إنشاء ختم جيجا أوم: الافراج عن الضغط وتطبيق في وقت واحد أمر الجهد 20 فولت إلى ماصة. ختم جيجا أوم (1-50 GΩ. الشكل 2D، وأسفل الشكل 2E الأوسط) typicحليف يتطور بسرعة. مرة واحدة مختومة، وتطبيق غشاء يستريح المتوقع المحتملين (عادة بين -70 و -60 بالسيارات) كأمر الجهد.
    4. اختراق التصحيح: مرة واحدة مختومة، تمزق غشاء التصحيح مع نبضة قصيرة من الضغط السلبي. وبالتالي تحقيق تكوين خلية كاملة (الشكل 2E، أسفل).
  8. تعويض السعة خلية كاملة وسلسلة المقاومة (R S). R ق عادة 5-20 MΩ ومستقرة لمدة تصل إلى 120 دقيقة. التخلي عن الخلايا إذا غشاء المحتملة (V M) على كسر من خلال استقطابها لأكثر من -50 بالسيارات. R S هو أكبر من 30 MΩ في البداية. أو تغييرات R S بأكثر من 20٪ على مدار التسجيل.
  9. تحديد FS الإضافية من خلال ردهم (في وضع المشبك الحالي) إلى عائلة من فرط لإزالة إستقطاب البقول الحالية (-250 إلى +250 السلطة الفلسطينية، الشكل 2F، أعلى). FS-INS واستقطابها نسبيا V M (عادة -50 رس -60 بالسيارات)، غشاء القصير وقت ثابت (<20 مللي ثانية) وترد على السلطة الفلسطينية إزالة إستقطاب 500 حقن الحالي مع قطار من إمكانات العمل (الجزائرية) على ترددات> ​​100 هرتز 11 (الشكل 2F، القاع)، والتي هي بشكل ملحوظ تختلف عن تلك الموجودة في أجهزة الكمبيوتر CA1 (الشكل 2F والمتوسطة).

4. خارج الخلية الكهربائية تحفيز لاستحضار الردود GABA B R بوساطة

  1. لمراقبة استجابات أثار synaptically، ضع إلكترود خارج الخلية التحفيز (ماصة التصحيح مليئة 2 M كلوريد الصوديوم، المقاومة: 0.1-0.3 MΩ) في شريحة عند حدود شارع. المشععة وشارع. -الجوبية الجزيئية. اضبط القطب 200-300 ميكرون الجانبي إلى سوما لمنع التحفيز الكهربائي المباشر من الخلية وتقليل التحف التحفيز (الشكل 3A).
  2. مرة واحدة يتم وضع القطب التحفيز، الحصول على تسجيل خلية كاملة منالخلية اختيار وتقييم النمط الظاهري الفسيولوجية في وضع المشبك الحالي كما في القسم 3.9 (الشكل 3B).
  3. مع الخلايا العصبية المسجلة في الجهد المشبك (V M -65 بالسيارات)، وتقديم التحفيز الكهربائي من المحاور قبل المشبكي في 50 V (~ 500 أمبير التحفيز الفعال) كل 20 ثانية، باستخدام معزولة مشجعا ثابت الجهد. استخدام المحفزات واحدة (100 μsec المدة، والشكل 3C، أعلى) لمراقبة GABA B R IPSCs بوساطة، وتعشيق مع القطارات من المحفزات متعددة (في 200 هرتز) لإنتاج أكبر الإفراج الارسال.
  4. حمام تنطبق ionotropic مضادات مستقبلات الغلوتامات (أمبا مستقبلات: DNQX [10 ميكرومتر]. NMDA مستقبلات: D-AP5 [50 ميكرومتر]) للكشف عن معزولة الأحادي المشبك IPSC (الشكل 3C، العلوي الأوسط). تزيد من عزلة IPSC GABA B R بوساطة مع تطبيق مانع GABA A R (gabazine [10 ميكرومتر]، الشكل 3C المتوسط ​​لOWER).
  5. تأكيد الناتجة بطيئة الخارجي الحالي (الشكل 3C أقل، وسعت) كشخص GABA B R بوساطة من قبل التطبيق اللاحق لCGP-55،845 [5 ميكرومتر] (الشكل 3C أقل، تحتها باللون الرمادي)

5. المقترنة تسجيلات Synaptically إلى جانب FS-IN وCA1 أجهزة الكمبيوتر

  1. تقييم GABA B R بوساطة السيطرة من قبل المشبكي المثبط انتقال متشابك مع التسجيلات في وقت واحد، إلى جانب أداء بين synaptically-IN وPC أزواج كما هو موضح أدناه.
  2. أولا، إنشاء تسجيل خلية كاملة من عصبون قبل المشبكي (كما في القسم 3) وتأكيد النمط الظاهري FS (الشكل 4A).
  3. ثم التصحيح وCA1 PC المجاورة (20-100 ميكرون المسافة، الشكل 4A) وتطبيق suprathreshold موجز إزالة إستقطاب البقول الحالية (1 مدة ميللي ثانية، 1-5 غ السعة) إلى IN قبل المشبكي (الذي عقد في وضع المشبك الحالي) إلى انتزاع نقاط وصول. إذا كان المشارك متشابكnnection هو الحاضر، نقاط وصول في النتيجة في في IPSCs في PC CA1، الذي عقد في الجهد المشبك (تعويض R S إلى حوالي 80٪).
  4. إذا لزم الأمر، وملء القطب تسجيل جديد وتسجيل المزيد من أجهزة الكمبيوتر CA1 حتى تم العثور على اتصال.
  5. مرة يتم تأسيس اتصال، انتزاع أزواج من نقاط وصول في قبل المشبكي FS-IN لتقييم كل من استجابة متشابك وحدوية والسلوك الديناميكي. استخدام بروتوكول نموذجي إقران النبض من 2 المحفزات إزالة إستقطاب مع فاصل زمني 50 مللي ثانية (الشكل 4B).
  6. جمع آثار تحكم في ظروف خط الأساس. ثم، تطبيق GABA B باكلوفين R ناهض انتقائية (10 ميكرومتر) إلى ACSF perfusing، وبالتالي تفعيل GABA B روبية، تليها خصم CGP-55845 (5 ميكرومتر)، لمنع تماما مستقبلات بوساطة الآثار. جمع 50 ~ آثار خلال حالة مستقرة من كل شرط المخدرات (الشكل 4B و C).
  7. بمجرد اكتمال التسجيل، وختم الغشاء الجسدية بتشكيل خارج منالإلكترونية من التصحيح: سحب ببطء ماصة من جسم الخلية في V-المشبك وكما يزيد R S، M خفض V إلى -40 بالسيارات. نفعل ذلك لتسهيل تشكيل التصحيح الخارجي بها؛ ثم إزالة ماصة من الحمام.

6. تحليل الخصائص الكهربية

  1. ملاحظة: هناك العديد من حزم البرامج المختلفة المتاحة لاقتناء البيانات الكهربية. هنا، WinWCP، يتم استخدام برنامج ويندوز في حزمة ستراثكلايد الكهربية البرمجيات الحرة، والتي تسمح تسجيل ما يصل الى 16 قنوات التناظرية المدخلات والمخرجات من 10 الإشارات الرقمية.
  2. المنخفضة تمرير مرشح جميع البيانات في 5-10 كيلو هرتز و 20 كيلوهرتز في العينة.
  3. تحليل البيانات الفسيولوجية مع تحليل جناح خارج الخط.
    ملاحظة: Stimfit، حزمة برمجيات المصدر المفتوح والذي يتضمن قذيفة بيثون، ويستخدم في هذه الحالة. ومع ذلك بدائل أخرى يمكن بسهولة أن تستخدم بدلا من ذلك.
    1. تحليل السلبي غشاء صroperties من الخلايا العصبية المسجلة، حصلت في المشبك الحالي، من يستريح غشاء المحتملة.
    2. قياس متوسط ​​يستريح غشاء المحتملة من خط الأساس الردود المسجلة من بداية التسجيل.
    3. حساب المقاومة المدخلات، وذلك باستخدام قانون أوم، من الاستجابة الجهد إلى أصغر البقول الحالية hyperpolarizing (≤ -50 باسكال). لتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء، متوسط ​​آثار متعددة. ملاحظة: أمثلة لدينا هي عادة متوسطات 10-50 الاحتلالات الفردية.
  4. تقدير الوقت غشاء الواضح المستمر من المناسب منحنى monoexponential إلى اضمحلال الردود على أصغر البقول الحالية hyperpolarizing.
  5. تحليل الموجي العمل المحتملين لتحديد عتبة، السعة (عتبة إلى الذروة) ومدة (عرض قياسها نصف الارتفاع) التي تسببها مستوى عتبة إزالة إستقطاب البقول الحالية.
  6. تحليل GABA B R IPSCs بوساطة من التسجيلات المشبك الجهد. تصفية اثار خارج الخط في500 هرتز (فلتر جاوس) وتقييم السعة الذروة والكمون من GABA B R استجابة بوساطة (في المتوسط ​​لا يقل عن 10 آثار).
  7. كشف تأثير GABA B روبية على الانتاج المثبطة من الوظائف على أنه تغيير في السعة الذروة من IPSCs GABA A R بوساطة قياس بين الذروة وتسبق خط الأساس. حساب السعة يعني من ≥50 آثار لفترة الرقابة ودولة مستقرة من جميع العهود الدوائية.

7. التصور وكيمياء سيتولوجية مناعية من FS-إنس

  1. بعد التسجيلات، وتحديد الشرائح عن طريق الغمر في 4٪ بارافورمالدهيد مع 0.1 M الفوسفات عازلة (PB، ودرجة الحموضة = 7.35) O / N في 4 درجات مئوية.
  2. إذا يمكن نقلها شرائح اللازمة لPB وتخزينها لمدة تصل إلى ~ 1 قبل أسبوع من المعالجة.
  3. شرائح غسل متحررا في PB الطازجة وبعد ذلك في 0.025 M PB مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم (PBS، ودرجة الحموضة = 7.35).
  4. للحد من الأجسام المضادة غير محددة ملزمة، منع شرائح FOص 1 ساعة على RT في محلول يحتوي على 10٪ مصل الماعز العادي (خ ع)، 0.3٪ تريتون-X100 (أ المنظفات لpermeabilize الأغشية) و 0.05٪ نان 3، تتكون في برنامج تلفزيوني.
  5. لتسمية للتعبير PV، استخدم مضاد-PV الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس المخفف في محلول يحتوي على 5٪ NGS، 0.3٪ تريتون-X100، 0.05٪ نان 3، في برنامج تلفزيوني. احتضان الأجسام المضادة الأولية لمدة 2-3 أيام عند 4 ° C 12. شطف شرائح بدقة في برنامج تلفزيوني.
  6. تطبيق مكافحة فأر الأجسام المضادة الثانوية الفلورية (مثل Alexafluor-546.) جنبا إلى جنب مع البيوتين streptavidin ملزم البروتين، مترافق إلى تألقي (على سبيل المثال، Alexafluor-647). واحتضان في محلول يحتوي على 3٪ NGS، 0.1٪ تريتون-X100، 0.05٪ نان 3، مخففة في برنامج تلفزيوني واحتضان O / N في 4 درجات مئوية.
  7. شطف شرائح تحرري 2-3x مع PBS تليها 2-3 يشطف في PB. تركيب شرائح على الشرائح الزجاجية. استخدام 300 ميكرون أجار فاصل لمنع شريحة من الانهيار. شرائح غطاء للانزلاق مع الفلوريةتصاعد المائة المتوسطة وختم مع مسمار الورنيش.

8. التصوير وإعادة بناء متصور FS-إنس

  1. تصور شرائح باستخدام مجهر المسح مبائر، مع مراسل fluorochome سعيدا مع خط ليزر المناسب (ليزر ديود 635 نانومتر لAlexafluor-647، هيليوم نيون 543 نانومتر لAlexafluor-546 لوسم PV والأرجون 488 أو 515 نانومتر لفينوس / YFP).
  2. التقاط صور في لZ-القرار المناسب (عادة 0.5-1 ميكرومتر الخطوات، وذلك باستخدام الهدف 20X) لإنتاج Z-كومة من الخلية بأكملها. ويطلب عادة أكوام متعددة لصورة خلية كاملة، والتي يمكن مخيط رقميا خارج الخط باستخدام فيجي / برنامج ImageJ (الشكل 5A).
  3. إعادة بناء الخلية من الصورة كومة مخيط باستخدام طريقة تتبع شبه التلقائي (بسيط محوار الراسم المساعد في فيجي / يماغيج حزمة البرامج 17، الشكل C).
  4. أخيرا، تقييم PV-مناعية من طnterneuron مع عدسة موضوعية الفتحة العددية العالية (60X السيليكون الغمر، NA = 1.3). جعل صور سوما، التشعبات والداني محوار القريبة، أو بدلا من المحطات محوار إذا تبييض الجسدية من PV قوية جدا. تعتبر الخلايا الكهروضوئية إذا مناعيا لينظر المناعة وضع العلامات لتتماشى مع الهياكل المسمى biocytin (الشكل 5B).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شريطة أن جودة شريحة جيدة بشكل ملحوظ، وتسجيل من كلا CA1 أجهزة الكمبيوتر وFS الإضافية يمكن أن يتحقق بأقل قدر من الصعوبة. خط الفئران المعدلة وراثيا معربا عن فينوس / YFP تحت المروج vGAT 13 لا تحدد بشكل قاطع FS الإضافية، أو في الواقع BCS. لكن التسجيلات من دائرة الهجرة والتجنيس في وحول شارع. الهرمي، حيث كثافة FS-INS مرتفعة عادة 1، والنتائج في وجود احتمال كبير لاختيار FS-INS (الشكل 2B). FS-INS يمكن تمييز بحكم الخصائص الفيزيولوجية مميزة تختل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف الطريقة التي تجمع بين تقنيات الكهربية وتشريحي عصبي لتوصيف الخلايا العصبية وظيفيا morphologically- وحددت neurochemically في المختبر؛ ولا سيما أنواع متنوعة من الوظائف المثبطة القشرية. الجوانب الرئيسية لهذا الإجراء هي: (1) الاختيار من الوظائف المحتملة؛ (2) تسجيل داخل الخلايا والخلايا العصبية التصور. وأخيرا (3) التحليل الصرفي وimmunocytochemical من الوظائف المسجلة. على الرغم من أن هذه الدراسة قد تناولت PV-INS على وجه الخصوص، وبروتوكول وصف يمكن استخدامها لتسجيلات مشابهة من أي ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أود أن أشكر إينا فولتر لها المساعدة التقنية الممتازة. تم إنشاؤها VGAT-فينوس الفئران المعدلة وراثيا من قبل الدكاترة. Y. ياناغاوا، M. Hirabayashi وY. كاواجوتشي في المعهد الوطني للعلوم الفسيولوجية، أوكازاكي، اليابان، وذلك باستخدام PCS2-فينوس التي يقدمها الدكتور A. Miyawaki.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
جرذان vGAT-venus المعدلة وراثياًراجع أوماتسو ، وآخرون., 2008
نظارات Venus (515 نانومتر).BLS Ltd.، المجر
أدوات التشريحأي. إي. (أي) إحصائية التمايز (FST)لإزالة الدماغ
جهاز التقطيع الاهتزازي (Vibratome)LeicaVT1200Sأو أي جهاز تقطيع اهتزازي (vibratome) آخر عالي الجودة يتميز بأقل قدر من التذبذب الرأسي.
غرف تثبيت الشرائحمُصنّع خصيصاً في المختبر
مجهر IR-DIC القائمOlympus، اليابانBX50WIباستخدام نظام المناولة الدقيقة؛ أي أن لويجز ونومان، كلاينديك إلى آخره.
كاميرا CCDتيل فوتونيكس (Till Photonics)VX55
نظام LED بطول موجي 505 نانومتركيرن للأبحاث (Cairn Research)نظام OptiLEDأو مصباح زئبقي أو نظام LED آخر أي: كوليد (CooLED). 
Multiclamp 700B Axon Instrumentsوبدلاً من ذلك، يمكن استخدام مضخمين من طراز Axopatch 200B. 
برنامج WinWCP للاستحواذ على البياناتجون ديمبستر، جامعة ستراثكلايديمكن استخدام أي برنامج للحصول على البيانات عالية الجودة، أي. EPHUS وpClamp وIgor وغيرها. 
جهاز سحب الأقطاب الكهربائيةSutterP-97تُستخدم مع خيط صندوقي (box-filament)
زجاج الماصات من البورسليكاتهيلجنبرغ، ألمانيا1405020قطر خارجي 2 مم، قطر داخلي 1 مم، بدون خيط (filament)
مضخة تمعجيةGilsonميني بلس (Minipuls)يمكن استخدام مضخات أخرى أو التغذية بالجاذبية بدلاً من ذلك
ميزان حرارة رقميمُصنَّع حسب الطلب
مانومتر رقميسوبيرتيك (Supertech)، المجر
<أداة الارتباط التشعبي (a href=)"http://digitimer.com/products/research/stimulators/" يرجى تزويدي بالنص المصدر المراد ترجمته."يرجى تزويدي بالنص المصدر المراد ترجمته.">محفز جهد ثابت معزولfigure-materials-1 Digitimer Ltd.<أداة الارتباط التشعبي (href)"http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds2a-isolated-constant-voltage-stimulatorstimulus-isolator/ محفز الجهد الثابت المعزول DS2a / عازل التحفيز" يرجى تزويدي بالنص المصدر المراد ترجمته."يرجى تقديم النص المراد ترجمته.">DS-2A
بيوسيستينInvitrogenB1592المعروف أيضاً بـ εبيوتينويل-إل-لايسين 
ملح ثنائي الصوديوم لـ DL-AP5(V)المواد الكيميائية الحيوية من Abcamab120271
ملح ثنائي صوديوم DNQXالكيمياويات الحيوية من Abcamab120169أو بدلاً من ذلك NBQX أو CNQX
غابازين (SR95531)مواد كيميائية حيوية من Abcamab120042أو بدلاً من ذلك، يوديد البيكوكولين
آر-باكلوفين (R-Baclofen)المواد الكيميائية الحيوية من Abcamab120325
هيدروكلوريد CGP-55,845Tocris1248
ستريبتفيدين 647InvitrogenS32357
جسم مضاد أحادي النسيلة للفئران مضاد للفيروس النطاقي (anti-PV)سوانت، سويسرا235تركيز التشغيل 1:5,000-1:10,000
جسم مضاد ثانوي مضاد للفأر InvitrogenA11030إذا كنت تستخدم Venus أو GFP في القوارض باستخدام القناة الحمراء (أي. إي. (أي) من المستحسن استخدام (546 نانومتر).
مصل ماعز طبيعيVector LabsS-1000
شرائح المجهرأي علامة تجارية عالية الجودة
أغطية شرائح زجاجيةعادةً ما تكون 22 × 22 ملم
فواصل الآجاركتلة أغار، تُقطع باستخدام المقطاع الاهتزازي (vibratome) بسماكة 300 ميكرومتر μمـ
المجهر البؤري الماسح بالليزرأوليمبوس، اليابانFluoview FV1000أو أي نظام آخر مماثل
فيجي (Fiji هو مجرد ImageJ)http://fiji.sc/Fijiراجع شنديلين (Schindelin) وآخرون., 2012

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
  2. Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
  3. Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
  4. Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
  5. Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
  6. Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).
  7. Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
  8. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
  9. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  10. Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
  11. Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
  12. Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
  13. Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
  14. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
  15. Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
  16. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  18. Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
  19. Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
  20. Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
  21. Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
  22. Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GABA B

مقالات ذات صلة