خلية كاملة تسجيلات التصحيح، المشبك من Morphologically- وحددت Neurochemically-الحصين Interneurons

Summary

يتم التحكم في الشبكات القشرية من قبل مجموعة صغيرة، ولكنها متنوعة من interneurons المثبطة. ولتحقيق الوظيفي للinterneurons يتطلب تسجيل المستهدفة وتحديد دقيق. الموصوفة هنا هو نهج مجتمعة تشمل تسجيلات خلية كاملة من أزواج واحدة أو جانب synaptically من الخلايا العصبية بين الخلايا مع وضع العلامات، خاصة بعد المورفولوجية والتحليل immunocytochemical.

Abstract

GABAergic interneurons المثبطة تلعب دورا مركزيا في الدوائر العصبية في الدماغ. تشمل Interneurons مجموعة فرعية صغيرة من السكان العصبية (10-20٪)، ولكن تظهر مستوى عال من الفسيولوجية، الصرفي، وعدم التجانس الكيميائية العصبية، والتي تعكس وظائفها المتنوعة. لذلك، والتحقيق في interneurons يوفر نظرة ثاقبة على مبادئ تنظيم وظيفة الدوائر العصبية. هذا، ومع ذلك، يتطلب نهجا الفسيولوجية وتشريحي عصبي متكامل لاختيار وتحديد أنواع عصبون الفردية. خلية كاملة تسجيل من شرائح الدماغ الحادة من الحيوانات المعدلة وراثيا، معربا عن بروتينات الفلورسنت تحت المروجين للعلامات عصبون محددة التصحيح، المشبك، ويوفر وسيلة فعالة لاستهداف وelectrophysiologically تميز الخصائص الذاتية ومتشابك من أنواع عصبون محددة. جنبا إلى جنب مع وضع العلامات الصبغة داخل الخلايا، ويمكن تمديد هذا النهج مع ما بعد مو خاصةتحليل rphological وimmunocytochemical، مما يتيح تحديد منهجي من الخلايا العصبية المسجلة. هذه الأساليب يمكن أن تكون مصممة لتناسب مجموعة واسعة من المسائل العلمية المتعلقة بالخصائص الوظيفية لأنواع مختلفة من الخلايا العصبية القشرية.

Introduction

وكانت الدوائر العصبية قرن آمون منذ فترة طويلة موضوع تدقيق مكثف، فيما يتعلق بكل من علم التشريح وعلم وظائف الأعضاء، وذلك بسبب الدور الأساسي في التعلم والذاكرة، فضلا عن الملاحة المكانية في كل من البشر والقوارض. وبالمثل، فإن منظمة الصفحي بارزة، ولكن بسيطة من الحصين يجعل هذه المنطقة وهو موضوع مفضل من الدراسات التي تتناول الخصائص التركيبية والوظيفية للشبكات القشرية.

وتتألف الدوائر من خلايا قرن آمون مثير الرئيسية (> 80٪) وأصغر (10-20٪)، ولكن فوج متنوعة للغاية من interneurons المثبطة ^1-3. Interneurons الافراج حامض γ-امينوبوتيريك (GABA) من المحطات محوار بهم الذي يعمل في ionotropic سريع GABA _A مستقبلات (GABA _A روبية) وبطيئة metabotropic مستقبلات GABA _B (GABA _B روبية) ^4. هذه الآليات المثبطة موازنة الإثارة وتنظيم استثارة الخلايا الرئيسية، وبالتاليتوقيت الأشعة تحت الحمراء ونمط التصريف. ومع ذلك، GABA سراحه من interneurons تعمل ليس فقط على الخلايا الرئيسية، ولكن أيضا على interneurons أنفسهم ^5،6. قبل وبعد المشبكي مستقبلات توسط تنظيم ردود الفعل والتفاعلات المتبادلة المثبطة بين أنواع مختلفة من عصبون. ويعتقد أن هذه الآليات المثبطة في شبكات عصبون أن تكون مركزية في جيل وتشكيل أنماط النشاط السكاني، في التذبذبات خاصة على ترددات مختلفة ^7.

خلية كاملة تسجيل التصحيح، المشبك هي طريقة راسخة لفحص الخصائص الذاتية والتفاعلات متشابك من الخلايا العصبية. ولكن نظرا لتنوع كبير من أنواع عصبون، والتحقيق في interneurons المثبطة ويتطلب التشخيص الدقيق للخلايا المسجلة. كما تتميز أنواع عصبون قرن آمون بواسطة سمات مميزة المورفولوجية والكيميائية العصبية علامة التعبير، التشريحية مجتمعة والبريد immunocytochemicalيمكن xamination توفر وسيلة لتحديد الهوية الدقيق ^6،8،9 عصبون.

في هذه الورقة وصفنا هذا النهج التجريبي الذي يتم الجمع بين خلية كاملة تسجيلات التصحيح المشبك من الخلايا العصبية واحدة أو أزواج جانب synaptically مع وضع العلامات داخل الخلايا، تليها بعد خاصة التحليل الصرفي وimmunocytochemical، مما يسمح لتوصيف بطيئة GABA _B مستقبلات بوساطة التأثيرات المثبطة interneurons في تحديدها. وكمثال على ذلك، ونحن نركز على نوع واحد رئيسي للعصبون، مجموعة فرعية من ما يسمى "خلايا سلة" (BC)، والتي يعصب سوما والتشعبات القريبة من أهدافها بعد المشبكي ويتميز "ارتفاعه السريع" (FS) تصريف نمط، محور عصبي تغطي طبقة كثيفة جسم الخلية، والتعبير من البروتين parvalbumin ملزم الكالسيوم (PV) ^10،11. تعرض هذه التيارات interneurons المثبطة بعد المشبكي كبيرة، وكذلك قبل بارزتعديل متشابك من إنتاجها متشابك، ردا على GABA _B R تفعيل ^12. مزيج من الأساليب المذكورة هنا يمكن تطبيق جيد على قدم المساواة للتحقيق آليات فعلية أو متشابك في مجموعة متنوعة من غيرها من أنواع الخلايا العصبية التي تم تحديدها.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات والحيوان الصيانة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية، وقانون رعاية الحيوان الألمانية، المجلس الأوروبي التوجيه 86/609 / EEC فيما يتعلق بحماية الحيوانات، والمبادئ التوجيهية من السلطات المحلية (برلين، T-0215/11: بيان الأخلاق )

1. إعداد شرائح الحادة الحصين

1. اتخاذ الفئران المعدلة وراثيا (17 إلى 24 يوما من العمر)، معربا عن بروتين فلوري فينوس / YFP تحت المروج vGAT التي تصف غالبية interneurons المثبطة القشرية ^13. قطع رأس الفئران. بسرعة تشريح الدماغ (<40 ثانية) في semifrozen، carbogenated (95٪ O _2/5٪ CO ₂₎ السائل القائم على السكروز الاصطناعي النخاعي (السكروز-ACSF، الشكل 1A).
2. تقييم تشريح الدماغ الفئران لفينوس / YFP مضان مع 505 نانومتر مصباح LED و515 مرشح الانبعاثات، التي شنت على زوج من نظارات واقية.
3. إزالة الثلث الأمامي من القشرة وcerebellum. ثم فصل نصفي الكرة الأرضية، مع كل مشرط. إزالة السطح الظهري من القشرة لتوفير سطح مستو لالغراء الدماغ أسفل، كما هو موضح سابقا ^14.
4. قطع شرائح عرضية (300 ميكرون) من تشكيل الحصين على vibratome، يجب أن تكون محاطة نصفي الكرة الأرضية مع semifrozen، carbogenated السكروز-ACSF (الشكل 1B) ^14. إزالة مناطق إضافية من القشرة منقاري، الدماغ المتوسط ​​والدماغ. نقل كل شريحة إلى غرفة إجراء المغمورة التي تحتوي على السكروز-ACSF التي carbogenated وتحسنت إلى 35 درجة مئوية.
5. ترك شرائح لاسترداد في 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة من الوقت للشريحة الأخيرة دخول ACSF تحسنت. هل هذا من أجل تنشيط عمليات التمثيل الغذائي وتسهيل إعادة إغلاق العمليات العصبية قطع. ثم نقل إلى درجة حرارة الغرفة لتخزين (الشكل 1C).

2. تصنيع وتعبئة للتسجيل الماصات

1. بوالماصات ليرة لبنانية التصحيح من الزجاج الشعيرات الدموية، بحيث يتم التوصل إلى المقاومة ماصة من 2-4 MΩ عندما تمتلئ تصفية (فلتر حقنة، حجم المسام: 0.2 ميكرون) حل داخل الخلايا التي تحتوي على 0.1٪ biocytin (لوصفها الخلايا). يبقي الحل داخل الخلايا المبردة على الجليد لمنع تدهور مكوناته.
2. ملء الماصات التصحيح لتحديد التيارات بعد المشبكي مع محلول يحتوي على الكلور منخفضة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ^- تركيز (E _{R (الكلورين)} = -61 بالسيارات، انظر قائمة الحل).
3. لإقران التسجيلات لتحديد مستقبلات بوساطة الردود قبل المشبكي، وملء ماصات التصحيح مع حل داخل الخلايا مع انخفاض الكالسيوم قدرة ²⁺ عازلة لمنع التدخل في الإفراج الارسال presynaptically، فضلا عن 4 أضعاف أعلى الكلور ^- تركيز (E _{R (الكلورين)} = -20 بالسيارات) لتحسين إشارة إلى الضجيج من IPSCs المرصودة ⁵ السماح تقييم دقيق من التركيب الدوائيonsiveness. لاحظ أن تغيير الكلور ^- تركيز يمكن أن يغير حركية IPSC ^15.

3. خلية كاملة تسجيل التصحيح، المشبك من FS-INS

1. Carbogenate في ACSF وتتغذى من خلال نظام نضح إلى غرفة تسجيل، عن طريق مضخة تحوي (الذي يزيل أيضا ACSF من غرفة تسجيل من خلال خط الشفط، الشكل 2A). تشغيل جميع المعدات على الإعداد استعدادا للتسجيل.
2. نقل شريحة إلى غرفة تسجيل وعقد في مكان مع خاتم البلاتين موتر مع الألياف واحدة من الحرير. ضع شريحة بحيث تكون الطبقة (شارع). الهرمية CA1 من يدير عموديا عبر مجال الرؤية، مما يتيح الوصول مع 2 الماصات على كل من شارع. المشععة وشارع. oriens في وقت واحد (أرقام 2C و4A).
3. وضع الغرفة في الإعداد والبدء نضح من carbogenated وحرارة (32-34 درجة مئوية) تسجيل وCSF بمعدل تدفق 5-10 مل / دقيقة.
4. تقييم جودة شريحة تحت البصريات في مدينة دبي للإنترنت-IR 40X التكبير موضوعي، وتصور مع كاميرا CCD عرضها على الشاشة. نفترض جودة شريحة جيدة اذا يمكن رؤية عدد كبير من الخلايا الهرمية CA1 يتناقض معتدلة مستديرة (PC CA1) في شارع. الهرمية في أعماق 20-30 ميكرومتر أدناه سطح أملس وذا الفوهات طفيفة (الشكل 2C). شرائح نوعية رديئة تحتوي على أعداد كبيرة من يتناقض إلى حد كبير، وخلايا منكمشة أو تورم، مع سطح شريحة متفاوتة.
5. تحديد FS interneurons المفترض تحت epifluorescence إضاءة كتلك التعبير عن فينوس / YFP (الشكل 2B)، مع somata متعدد الأقطاب كبير في أو بالقرب من شارع. الهرمية. حدد الخلايا معقول في أعماق شريحة (50-100 ميكرون، الشكل 2C) من أجل الحفاظ على أفضل سلامتها المورفولوجية.
6. جبل القطب تسجيل في حامل ماصة على headstage. ثم التطبيقلاي منخفضة، وضغط إيجابي (20-30 ميللي بار) من خلال خط الأنبوب. خفض ماصة لسطح شريحة، ويقابل قليلا إلى مركز الخلايا العصبية المحدد.
7. الحصول على خلية كاملة التكوين تسجيل كما هو موضح سابقا ^14،16 وانظر الشكلين أيضا 2D و 2E:
   1. استهداف خلية: زيادة الضغط على 70-80 ميللي بار وخفض بسرعة ماصة من خلال شريحة إلى ما فوق سوما من الخلية المحددة (الشكل 2D، أعلى).
   2. الاقتراب من الخلية: اضغط على ماصة ضد غشاء الخلية لإنتاج "الدمل" على ذلك (الشكل 2D، أعلى). تنفيذ هذه الخطوة على وجه السرعة، من أجل منع وضع العلامات biocytin من الخلايا المجاورة.
   3. إنشاء ختم جيجا أوم: الافراج عن الضغط وتطبيق في وقت واحد أمر الجهد 20 فولت إلى ماصة. ختم جيجا أوم (1-50 GΩ. الشكل 2D، وأسفل الشكل 2E الأوسط) typicحليف يتطور بسرعة. مرة واحدة مختومة، وتطبيق غشاء يستريح المتوقع المحتملين (عادة بين -70 و -60 بالسيارات) كأمر الجهد.
   4. اختراق التصحيح: مرة واحدة مختومة، تمزق غشاء التصحيح مع نبضة قصيرة من الضغط السلبي. وبالتالي تحقيق تكوين خلية كاملة (الشكل 2E، أسفل).
8. تعويض السعة خلية كاملة وسلسلة المقاومة (R _S). R _ق عادة 5-20 MΩ ومستقرة لمدة تصل إلى 120 دقيقة. التخلي عن الخلايا إذا غشاء المحتملة (V _M) على كسر من خلال استقطابها لأكثر من -50 بالسيارات. R _S هو أكبر من 30 MΩ في البداية. أو تغييرات R _S بأكثر من 20٪ على مدار التسجيل.
9. تحديد FS الإضافية من خلال ردهم (في وضع المشبك الحالي) إلى عائلة من فرط لإزالة إستقطاب البقول الحالية (-250 إلى +250 السلطة الفلسطينية، الشكل 2F، أعلى). FS-INS واستقطابها نسبيا V _M (عادة -50 رس -60 بالسيارات)، غشاء القصير وقت ثابت (<20 مللي ثانية) وترد على السلطة الفلسطينية إزالة إستقطاب 500 حقن الحالي مع قطار من إمكانات العمل (الجزائرية) على ترددات> ​​100 هرتز ¹¹ (الشكل 2F، القاع)، والتي هي بشكل ملحوظ تختلف عن تلك الموجودة في أجهزة الكمبيوتر CA1 (الشكل 2F والمتوسطة).

4. خارج الخلية الكهربائية تحفيز لاستحضار الردود GABA _B R بوساطة

1. لمراقبة استجابات أثار synaptically، ضع إلكترود خارج الخلية التحفيز (ماصة التصحيح مليئة 2 M كلوريد الصوديوم، المقاومة: 0.1-0.3 MΩ) في شريحة عند حدود شارع. المشععة وشارع. -الجوبية الجزيئية. اضبط القطب 200-300 ميكرون الجانبي إلى سوما لمنع التحفيز الكهربائي المباشر من الخلية وتقليل التحف التحفيز (الشكل 3A).
2. مرة واحدة يتم وضع القطب التحفيز، الحصول على تسجيل خلية كاملة منالخلية اختيار وتقييم النمط الظاهري الفسيولوجية في وضع المشبك الحالي كما في القسم 3.9 (الشكل 3B).
3. مع الخلايا العصبية المسجلة في الجهد المشبك (V _M -65 بالسيارات)، وتقديم التحفيز الكهربائي من المحاور قبل المشبكي في 50 V (~ 500 أمبير التحفيز الفعال) كل 20 ثانية، باستخدام معزولة مشجعا ثابت الجهد. استخدام المحفزات واحدة (100 μsec المدة، والشكل 3C، أعلى) لمراقبة GABA _B R IPSCs بوساطة، وتعشيق مع القطارات من المحفزات متعددة (في 200 هرتز) لإنتاج أكبر الإفراج الارسال.
4. حمام تنطبق ionotropic مضادات مستقبلات الغلوتامات (أمبا مستقبلات: DNQX [10 ميكرومتر]. NMDA مستقبلات: D-AP5 [50 ميكرومتر]) للكشف عن معزولة الأحادي المشبك IPSC (الشكل 3C، العلوي الأوسط). تزيد من عزلة IPSC GABA _B R بوساطة مع تطبيق مانع GABA _A R (gabazine [10 ميكرومتر]، الشكل 3C المتوسط ​​لOWER).
5. تأكيد الناتجة بطيئة الخارجي الحالي (الشكل 3C أقل، وسعت) كشخص GABA _B R بوساطة من قبل التطبيق اللاحق لCGP-55،845 [5 ميكرومتر] (الشكل 3C أقل، تحتها باللون الرمادي)

5. المقترنة تسجيلات Synaptically إلى جانب FS-IN وCA1 أجهزة الكمبيوتر

1. تقييم GABA _B R بوساطة السيطرة من قبل المشبكي المثبط انتقال متشابك مع التسجيلات في وقت واحد، إلى جانب أداء بين synaptically-IN وPC أزواج كما هو موضح أدناه.
2. أولا، إنشاء تسجيل خلية كاملة من عصبون قبل المشبكي (كما في القسم 3) وتأكيد النمط الظاهري FS (الشكل 4A).
3. ثم التصحيح وCA1 PC المجاورة (20-100 ميكرون المسافة، الشكل 4A) وتطبيق suprathreshold موجز إزالة إستقطاب البقول الحالية (1 مدة ميللي ثانية، 1-5 غ السعة) إلى IN قبل المشبكي (الذي عقد في وضع المشبك الحالي) إلى انتزاع نقاط وصول. إذا كان المشارك متشابكnnection هو الحاضر، نقاط وصول في النتيجة في في IPSCs في PC CA1، الذي عقد في الجهد المشبك (تعويض R _S إلى حوالي 80٪).
4. إذا لزم الأمر، وملء القطب تسجيل جديد وتسجيل المزيد من أجهزة الكمبيوتر CA1 حتى تم العثور على اتصال.
5. مرة يتم تأسيس اتصال، انتزاع أزواج من نقاط وصول في قبل المشبكي FS-IN لتقييم كل من استجابة متشابك وحدوية والسلوك الديناميكي. استخدام بروتوكول نموذجي إقران النبض من 2 المحفزات إزالة إستقطاب مع فاصل زمني 50 مللي ثانية (الشكل 4B).
6. جمع آثار تحكم في ظروف خط الأساس. ثم، تطبيق GABA _B باكلوفين R ناهض انتقائية (10 ميكرومتر) إلى ACSF perfusing، وبالتالي تفعيل GABA _B روبية، تليها خصم CGP-55845 (5 ميكرومتر)، لمنع تماما مستقبلات بوساطة الآثار. جمع 50 ~ آثار خلال حالة مستقرة من كل شرط المخدرات (الشكل 4B و C).
7. بمجرد اكتمال التسجيل، وختم الغشاء الجسدية بتشكيل خارج منالإلكترونية من التصحيح: سحب ببطء ماصة من جسم الخلية في V-المشبك وكما يزيد R _{S، M} خفض V إلى -40 بالسيارات. نفعل ذلك لتسهيل تشكيل التصحيح الخارجي بها؛ ثم إزالة ماصة من الحمام.

6. تحليل الخصائص الكهربية

1. ملاحظة: هناك العديد من حزم البرامج المختلفة المتاحة لاقتناء البيانات الكهربية. هنا، WinWCP، يتم استخدام برنامج ويندوز في حزمة ستراثكلايد الكهربية البرمجيات الحرة، والتي تسمح تسجيل ما يصل الى 16 قنوات التناظرية المدخلات والمخرجات من 10 الإشارات الرقمية.
2. المنخفضة تمرير مرشح جميع البيانات في 5-10 كيلو هرتز و 20 كيلوهرتز في العينة.
3. تحليل البيانات الفسيولوجية مع تحليل جناح خارج الخط.
   ملاحظة: Stimfit، حزمة برمجيات المصدر المفتوح والذي يتضمن قذيفة بيثون، ويستخدم في هذه الحالة. ومع ذلك بدائل أخرى يمكن بسهولة أن تستخدم بدلا من ذلك.
   1. تحليل السلبي غشاء صroperties من الخلايا العصبية المسجلة، حصلت في المشبك الحالي، من يستريح غشاء المحتملة.
   2. قياس متوسط ​​يستريح غشاء المحتملة من خط الأساس الردود المسجلة من بداية التسجيل.
   3. حساب المقاومة المدخلات، وذلك باستخدام قانون أوم، من الاستجابة الجهد إلى أصغر البقول الحالية hyperpolarizing (≤ -50 باسكال). لتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء، متوسط ​​آثار متعددة. ملاحظة: أمثلة لدينا هي عادة متوسطات 10-50 الاحتلالات الفردية.
4. تقدير الوقت غشاء الواضح المستمر من المناسب منحنى monoexponential إلى اضمحلال الردود على أصغر البقول الحالية hyperpolarizing.
5. تحليل الموجي العمل المحتملين لتحديد عتبة، السعة (عتبة إلى الذروة) ومدة (عرض قياسها نصف الارتفاع) التي تسببها مستوى عتبة إزالة إستقطاب البقول الحالية.
6. تحليل GABA _B R IPSCs بوساطة من التسجيلات المشبك الجهد. تصفية اثار خارج الخط في500 هرتز (فلتر جاوس) وتقييم السعة الذروة والكمون من GABA _B R استجابة بوساطة (في المتوسط ​​لا يقل عن 10 آثار).
7. كشف تأثير GABA _B روبية على الانتاج المثبطة من الوظائف على أنه تغيير في السعة الذروة من IPSCs GABA _A R بوساطة قياس بين الذروة وتسبق خط الأساس. حساب السعة يعني من ≥50 آثار لفترة الرقابة ودولة مستقرة من جميع العهود الدوائية.

7. التصور وكيمياء سيتولوجية مناعية من FS-إنس

1. بعد التسجيلات، وتحديد الشرائح عن طريق الغمر في 4٪ بارافورمالدهيد مع 0.1 M الفوسفات عازلة (PB، ودرجة الحموضة = 7.35) O / N في 4 درجات مئوية.
2. إذا يمكن نقلها شرائح اللازمة لPB وتخزينها لمدة تصل إلى ~ 1 قبل أسبوع من المعالجة.
3. شرائح غسل متحررا في PB الطازجة وبعد ذلك في 0.025 M PB مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم (PBS، ودرجة الحموضة = 7.35).
4. للحد من الأجسام المضادة غير محددة ملزمة، منع شرائح FOص 1 ساعة على RT في محلول يحتوي على 10٪ مصل الماعز العادي (خ ع)، 0.3٪ تريتون-X100 (أ المنظفات لpermeabilize الأغشية) و 0.05٪ نان _3، تتكون في برنامج تلفزيوني.
5. لتسمية للتعبير PV، استخدم مضاد-PV الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس المخفف في محلول يحتوي على 5٪ NGS، 0.3٪ تريتون-X100، 0.05٪ نان _3، في برنامج تلفزيوني. احتضان الأجسام المضادة الأولية لمدة 2-3 أيام عند 4 ° C ^12. شطف شرائح بدقة في برنامج تلفزيوني.
6. تطبيق مكافحة فأر الأجسام المضادة الثانوية الفلورية (مثل Alexafluor-546.) جنبا إلى جنب مع البيوتين streptavidin ملزم البروتين، مترافق إلى تألقي (على سبيل المثال، Alexafluor-647). واحتضان في محلول يحتوي على 3٪ NGS، 0.1٪ تريتون-X100، 0.05٪ نان _3، مخففة في برنامج تلفزيوني واحتضان O / N في 4 درجات مئوية.
7. شطف شرائح تحرري 2-3x مع PBS تليها 2-3 يشطف في PB. تركيب شرائح على الشرائح الزجاجية. استخدام 300 ميكرون أجار فاصل لمنع شريحة من الانهيار. شرائح غطاء للانزلاق مع الفلوريةتصاعد المائة المتوسطة وختم مع مسمار الورنيش.

8. التصوير وإعادة بناء متصور FS-إنس

1. تصور شرائح باستخدام مجهر المسح مبائر، مع مراسل fluorochome سعيدا مع خط ليزر المناسب (ليزر ديود 635 نانومتر لAlexafluor-647، هيليوم نيون 543 نانومتر لAlexafluor-546 لوسم PV والأرجون 488 أو 515 نانومتر لفينوس / YFP).
2. التقاط صور في لZ-القرار المناسب (عادة 0.5-1 ميكرومتر الخطوات، وذلك باستخدام الهدف 20X) لإنتاج Z-كومة من الخلية بأكملها. ويطلب عادة أكوام متعددة لصورة خلية كاملة، والتي يمكن مخيط رقميا خارج الخط باستخدام فيجي / برنامج ImageJ (الشكل 5A).
3. إعادة بناء الخلية من الصورة كومة مخيط باستخدام طريقة تتبع شبه التلقائي (بسيط محوار الراسم المساعد في فيجي / يماغيج حزمة البرامج ^17، الشكل C).
4. أخيرا، تقييم PV-مناعية من طnterneuron مع عدسة موضوعية الفتحة العددية العالية (60X السيليكون الغمر، NA = 1.3). جعل صور سوما، التشعبات والداني محوار القريبة، أو بدلا من المحطات محوار إذا تبييض الجسدية من PV قوية جدا. تعتبر الخلايا الكهروضوئية إذا مناعيا لينظر المناعة وضع العلامات لتتماشى مع الهياكل المسمى biocytin (الشكل 5B).

Results

شريطة أن جودة شريحة جيدة بشكل ملحوظ، وتسجيل من كلا CA1 أجهزة الكمبيوتر وFS الإضافية يمكن أن يتحقق بأقل قدر من الصعوبة. خط الفئران المعدلة وراثيا معربا عن فينوس / YFP تحت المروج vGAT ¹³ لا تحدد بشكل قاطع FS الإضافية، أو في الواقع BCS. لكن التسجيلات من دائرة الهجرة والتجنيس في وحول شارع. الهرمي، حيث كثافة FS-INS مرتفعة عادة ^1، والنتائج في وجود احتمال كبير لاختيار FS-INS (الشكل 2B). FS-INS يمكن تمييز بحكم الخصائص الفيزيولوجية مميزة تختل...

Discussion

نحن تصف الطريقة التي تجمع بين تقنيات الكهربية وتشريحي عصبي لتوصيف الخلايا العصبية وظيفيا morphologically- وحددت neurochemically في المختبر؛ ولا سيما أنواع متنوعة من الوظائف المثبطة القشرية. الجوانب الرئيسية لهذا الإجراء هي: (1) الاختيار من الوظائف المحتملة؛ (2) تسجيل داخل الخلايا والخلايا العصبية التصور. وأخيرا (3) التحليل الصرفي وimmunocytochemical من الوظائف المسجلة. على الرغم من أن هذه الدراسة قد تناولت PV-INS على وجه الخصوص، وبروتوكول وصف يمكن استخدامها لتسجيلات مشابهة من أي ع...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
الفئران			Uematsu ، et al.< / em> ، 2008
Venus (515 nm) نظارات	BLS Ltd. ، المجر
أدوات التشريح	i.< / em> FST		لإزالة الدماغ
Vibratome	Leica	VT1200S	أو غيرها من الاهتزازات الراقية مع الحد الأدنى من التذبذب الرأسي
عقد الشريحة الغرف			حسب الطلب في المختبر
تستقيم المجهر IR-DIC	أوليمبوس ، اليابان	BX50WI	مع نظام مناور دقيق ؛ <م > أي < / م > لويجز ونيومان ، كلاينديك <م > إلخ < / م >
CCD الكاميرا	حتى الضوئيات	VX55
505 نانومتر نظام LED	Cairn Research	OptiLED	أو مصباح الزئبق أو نظام LED آخر <م > أي < / em> CooLED.
Multiclamp 700B	Axon Instruments		بدلا من ذلك 2x مكبرات الصوت Axopatch 200B   ؛
برنامج الاستحواذ WinWCP	جون ديمبستر ، جامعة		استخدام أي برنامج اكتساب عالي الجودة ، < > أي < / em > EPHUS ، pClamp ، Igor وما إلى ذلك ؛
مجتذب القطب الكهربائي	Sutter	P-97	الخيوط الصندوقية
	هيلجنبرغ ، ألمانيا	1405020	2 مم خارجي ، قطر داخلي 1 مم ، لا توجد مضخة تمعجية خيوط
	جيلسون	مينيبولس	استخدام مضخات أخرى أو تغذية الجاذبية بدلا من ذلك
مقياس حرارة			مخصص مقياس
ضغط رقمي	Supertech، المجر<
a href = "http://digitimer.com/products/research/stimulators/" target = "_blank" >محفز الجهد الثابت المعزول< / a>	Digitimer Ltd.	DS-2A < / a>
Biocytin	Invitrogen	B1592	المعروف باسم &epsilon ؛ -Biotinoyl-L-Lysine   ؛
DL-AP5 (V) ملح ثنائي الصوديوم	Abcam Biochemicals	ab120271
DNQX ملح ثنائي الصوديوم	Abcam Biochemicals	ab120169	بدلا من ذلك NBQX أو CNQX
Gabazine (SR95531)	Abcam Biochemicals	ab120042	بدلا من ذلك bicuculline methiodide
R-Baclofen	Abcam Biochemicals	ab120325
CGP-55،845 هيدروكلوريد	توكرس	1248
Streptavidin 647	Invitrogen	S32357
الأجسام المضادة أحادية النسيلة للفأر المضادة الكهروضوئية	Swan ، سويسرا	235	تركيز العمل 1: 5،000-1: 10،000
الجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر   ؛	Invitrogen	A11030	إذا كان استخدام كوكب الزهرة أو قوارض GFP باستخدام قناة حمراء (i.< / em> 546 نانومتر) مستحسن.
مختبرات ناقلات	مصل الماعز	العادي S-1000
شرائح الفحص المجهري أي
		زجاجية	الجودة عادة 22 × 22 مم
فواصل			أجار ، مقطوعة على الاهتزاز إلى 300 مو ؛ م
مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر	أوليمبوس ، اليابان	Fluoview FV1000	أو أي نظام آخر مماثل
فيجي (فيجي هي مجرد ImageJ)	http://fiji.sc/Fiji		انظر Schindelin et al.< / em> ، 2012