تم وصف الفحص القائم على الريبوزيم عالي الحساسية ، والذي ينطبق على الفحص عالي الإنتاجية للمواد الكيميائية التي تستهدف العملية الفريدة لتحرير الحمض النووي الريبي في مسببات الأمراض المثقبية ، في هذه الورقة. يمكن استخدام المثبطات كأدوات للتحليل القائم على الفرضيات لعملية تحرير الحمض النووي الريبي وفي النهاية كعلاجات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
RNA محفز كمراسلة لفحص الحمض النووي الريبي أدوية ضد التحرير في المثقبيات
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد تم إحراز تقدم كبير في تحديد آلية تحرير RNA الميتوكوندريا في المثقبيات. وبالمثل، تم إحراز تقدم كبير في تحديد مكونات معقدة editosome التي تحفز تحرير الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف تعمل هذه البروتينات معا. المركبات الكيميائية التي تم الحصول عليها من شاشة عالية الإنتاجية ضد editosome قد تمنع أو تؤثر على الخطوات واحدة أو أكثر في دورة التحرير. وبالتالي، فإن تحديد مركبات كيميائية جديدة تولد تحقيقات الجزيئية قيمة للتشريح وظيفة editosome والتجمع. في دراسات سابقة، أجريت في المختبر تحرير المقايسات خارج باستخدام الحمض النووي الريبي المسمى الراديو. هذه المقايسات هي مضيعة للوقت وغير فعالة وغير مناسبة لأغراض الإنتاجية العالية. هنا، واستنادا مضان متجانسة "خلط وقياس" المطرقة ribozyme في المختبر مراسل مقايسة لمراقبة التحرير الحمض النووي الريبي، ويرد. فقط نتيجة لتحرير الحمض النووي الريبيوribozyme المطرقة نقل الطاقة مضان الرنين (الحنق) oligoribonucleotide الركيزة يخضع الانقسام. هذا بدوره يؤدي إلى فصل من fluorophore من فاكهه تقضي بالتالي إنتاج إشارة. في المقابل، عندما يتم تثبيط وظيفة editosome، سيتم تطفئ إشارة مضان. هذا هو الاختبار حساسة للغاية والبسيطة التي يجب أن تكون قابلة للتطبيق عموما لمراقبة التحرير في الحمض النووي الريبي المختبر أو إنتاجية عالية الفرز من المواد الكيميائية التي يمكن أن تحول دون وظيفة editosome.
المقدمة
عملية تحرير الحمض النووي الريبي، تعديل مرنا ما بعد النسخي، اكتشفت لأول مرة في trypanosomatids 1. منذ ذلك الحين، وقد أجريت أعمال كبيرة في دراسة آلية وراء تحرير الحمض النووي الريبي في المثقبية البروسية 2،3. في سلسلة من التفاعلات الإنزيمية، وeditosome، وهو مجمع الأساسية من حوالي 20 البروتينات، ويخلق mRNAs والميتوكوندريا ناضجة لمكونات متعددة من الأكسدة الفسفرة نظام توليد الطاقة. ترتيب الأحداث الحفاز هو الانقسام endonucleolytic، uridylate (U) بالإضافة أو الحذف، والربط، وفقا لما تمليه الرنا دليل (gRNAs) 4.
بالإضافة إلى البرو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يصف بروتوكول تحت الإجراء لأداء القائم على مضان الحمض النووي الريبي تحرير مقايسة. الفحص لا يمكن أن يؤديها في PCR أنبوب واحد، 96 جيدا، أو لوحات 384 جيدا تبعا لنطاق التجربة. في وقت لاحق إشارة مضان يمكن قراءتها على الوقت الحقيقي PCR نظام الكشف مناسبة. يوصف الفحص هنا في سياق لوحات 384 جيدا.
1. التثقيف T. خلايا البروسية
- إعداد المتوسطة النمو لT. البروسية procyclic الخلايا النموذج. ل1 لتر من المتوسط:
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لشرح الخطوات اللازمة لإنشاء شاشة واسعة النطاق، أرقام 2-5 لتجارب السيطرة ممثل تتعلق نوعية الفحص. هذه هي التجارب التحكم الأساسية للمقايسة متسقة على مدى عدة أيام من فحص أو للمقارنة بين شاشات مختلفة.
تقييم الإسفار نسبة الإشارة إلى الضوضاء
لضمان الاستقرار ونوعية oligoribonucleotide الركيزة المسمى فلوريسئين في إعداد ن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقدم الإنتاجية العالية طريقة الفرز رواية لتحديد مثبطات ضد مجمع التحرير الحمض النووي الريبي من المثقبيات، وتوفير وسيلة جديدة لاكتشاف الأدوية لمواجهة الأمراض التي تسببها trypanosomatids. وقد استند الحنق-ribozyme الفحص المستخدمة على نطاق واسع لأغراض مختلفة 20-22؛ ومع ذلك، لقد استخدمت قدرات الفحص ribozyme مقرها الحنق لرصد النشاط في المختبر من الحمض النووي الريبي تحرير 19. يحتمل أن تتكيف هذا الاختبار على أنواع أخرى من تحرير الحمض النووي الريبي في حقيقيات .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
قدم نجمة نيكبور وفيونا ألوم اقتراحات وحررا هذه المخطوطة. دعم قسم الكيمياء الحيوية في جامعة ماكجيل HM و VM بمبادرة تدريب CIHR في البيولوجيا الكيميائية. تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR) 119464 (إلى R. S.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| SDM-79 Medium | Gibco من Life Technologies | ||
| تقنيات مصل الأبقار الجنينية | 12483-020 | تعطيل الحرارة عند 55 & # 176; C لمدة 1 ساعة | |
| Hemin ، الحد الأدنى 80٪ | Sigma | H5533-10G | |
| البنسلين - الستربتومايسين Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 المؤتلف ، Rnase Free ؛ | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large مقياس RNA نظام الإنتاج | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | فيشر ساينتفيك | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| أنبوب فائق الوضوح ، 13.2 مل | بيكمان كولتر | 344059 | |
| Optima L-100XP & nbsp ؛ أجهزة الطرد المركزي الفائقة | بيكمان كولتر | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | بيكمان كولتر | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal ، أختام | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time Detection | Biorad | 185-5484 | |
| محلول أكريل / بيس (19: 1) ، 40٪ (وزن / حجم) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea ، درجة البيولوجيا الجزيئية ، 1 كجم | تقنيات الحياة | AM9902 |
المراجع
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T. RNA editing in kinetoplastids. RNA biology....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
