يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

RNA محفز كمراسلة لفحص الحمض النووي الريبي أدوية ضد التحرير في المثقبيات

8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51712

⸱

يوليو 22, 2014

 ,  , 
1Department of Biochemistry, McGill University, 2Institute of Parasitology, McGill University, 3McGill Centre for Bioinformatics, McGill University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تم وصف الفحص القائم على الريبوزيم عالي الحساسية ، والذي ينطبق على الفحص عالي الإنتاجية للمواد الكيميائية التي تستهدف العملية الفريدة لتحرير الحمض النووي الريبي في مسببات الأمراض المثقبية ، في هذه الورقة. يمكن استخدام المثبطات كأدوات للتحليل القائم على الفرضيات لعملية تحرير الحمض النووي الريبي وفي النهاية كعلاجات.

الملخص

وقد تم إحراز تقدم كبير في تحديد آلية تحرير RNA الميتوكوندريا في المثقبيات. وبالمثل، تم إحراز تقدم كبير في تحديد مكونات معقدة editosome التي تحفز تحرير الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف تعمل هذه البروتينات معا. المركبات الكيميائية التي تم الحصول عليها من شاشة عالية الإنتاجية ضد editosome قد تمنع أو تؤثر على الخطوات واحدة أو أكثر في دورة التحرير. وبالتالي، فإن تحديد مركبات كيميائية جديدة تولد تحقيقات الجزيئية قيمة للتشريح وظيفة editosome والتجمع. في دراسات سابقة، أجريت في المختبر تحرير المقايسات خارج باستخدام الحمض النووي الريبي المسمى الراديو. هذه المقايسات هي مضيعة للوقت وغير فعالة وغير مناسبة لأغراض الإنتاجية العالية. هنا، واستنادا مضان متجانسة "خلط وقياس" المطرقة ribozyme في المختبر مراسل مقايسة لمراقبة التحرير الحمض النووي الريبي، ويرد. فقط نتيجة لتحرير الحمض النووي الريبيوribozyme المطرقة نقل الطاقة مضان الرنين (الحنق) oligoribonucleotide الركيزة يخضع الانقسام. هذا بدوره يؤدي إلى فصل من fluorophore من فاكهه تقضي بالتالي إنتاج إشارة. في المقابل، عندما يتم تثبيط وظيفة editosome، سيتم تطفئ إشارة مضان. هذا هو الاختبار حساسة للغاية والبسيطة التي يجب أن تكون قابلة للتطبيق عموما لمراقبة التحرير في الحمض النووي الريبي المختبر أو إنتاجية عالية الفرز من المواد الكيميائية التي يمكن أن تحول دون وظيفة editosome.

المقدمة

عملية تحرير الحمض النووي الريبي، تعديل مرنا ما بعد النسخي، اكتشفت لأول مرة في trypanosomatids 1. منذ ذلك الحين، وقد أجريت أعمال كبيرة في دراسة آلية وراء تحرير الحمض النووي الريبي في المثقبية البروسية 2،3. في سلسلة من التفاعلات الإنزيمية، وeditosome، وهو مجمع الأساسية من حوالي 20 البروتينات، ويخلق mRNAs والميتوكوندريا ناضجة لمكونات متعددة من الأكسدة الفسفرة نظام توليد الطاقة. ترتيب الأحداث الحفاز هو الانقسام endonucleolytic، uridylate (U) بالإضافة أو الحذف، والربط، وفقا لما تمليه الرنا دليل (gRNAs) 4.

بالإضافة إلى البروتينات الأساسية المعقدة editosome، كما تم تحديد عدد من العوامل التبعي 5-7. وتعتبر هذه البروتينات معظمها مجمعة في المجمعات مستقلة. ومع ذلك، من اجل تجميع البروتين في مجمع editosome الأساسية وأنماط التفاعل بين مجمع الأساسية مع ملحقالمجمعات هي لم يتحدد بعد. تستهدف عملية تحرير الحمض النووي الريبي في trypanosomatids قد توفر dissectors الكيميائية التي تساعد في دراسة التجمع وظيفة معقدة editosome. علاوة على ذلك، أظهرت دراسات عدة بروتينات وظيفية على editosome الإستخدامات الأساسية عبر مراحل الحياة المختلفة، مشيرا إلى قدرتها كأهداف المخدرات 8-12. وبالتالي، فإن مثبطات جدت من editosome قد تعمل أيضا مركبات الرصاص ضد trypanosomatids. هذا هو الوقت المناسب، والأدوية المتاحة حاليا ضد الأمراض التي تسببها trypanosomatid سامة، غير فعالة ومكلفة 13،14.

مقايسة فعالة ومريحة في المختبر من الضروري استكشاف الكون الكيميائية لمثبطات معينة التي تعمل على منع تحرير الحمض النووي الريبي. وقد وضعت ثلاثة فحوصات وتستخدم لمراقبة editosome الأنشطة: (أ) جولة كاملة في المختبر فحص الحمض النووي الريبي تحرير 15، (ب) المشقوق مسبقا في المختبر فحص الحمض النووي الريبي تحرير 16،17، والثانية (ج) المطرقة ribozyme (HHR) مقايسة 18 القائم. المقايسات الأولين تعتمد على رؤية مباشرة من المنتج تحريرها (أتباز 6 مرنا) مع مساعدة من النشاط الإشعاعي. يستخدم فحص مقرها HHR-نسخة معدلة من مرنا أتباز 6 التي على غرار لتتصرف كما ribozyme على التحرير. وribozyme وظيفية ثم يشق تحديدا ركيزة الحمض النووي الريبي رديولبلد، بمثابة المراسل. في الآونة الأخيرة، مشيري وآخرون ضعت 'خلط وقياس' المستندة إلى HHR في المختبر مراسل فحص الحمض النووي الريبي لمراقبة التحرير حيث يتم استبدال الركيزة الحمض النووي الريبي رديولبلد مع نقل الطاقة مضان الرنين (الحنق) الركيزة 19. مزايا مبدأ هذا الاختبار هي: (أ) هو مزيج سريع ومريحة ونوع مقياس الفحص، حيث أن إنتاج ribozyme نشطة والركيزة الانقسام تحدث في وقت واحد في نفس الأنبوب في انخفاض حجم (أي 20 ميكرولتر)، (ب ) فإنه يتجنب استخدام المواد المسمى بالإشعاع، (ج) الحساسية التي هيfforded من قبل الأجهزة مضان في شكل لوحة عيار الصغيرة، و (د) إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء. باستخدام هذا الاختبار، تم تأكيد تأثير الحمض النووي الريبي معروفة التحرير مثبطات يغاز ضد editosome النقية 19. هذه التجربة التحقق من صحة الاختبار لتحديد السريع لمثبطات تحرير الحمض النووي الريبي، في المقام الأول ضد editosomes كله من T. البروسية.

الرقم 1 هو خطوة بخطوة تخطيطي مفصل للفي المختبر فحص الحمض النووي الريبي التحرير القائم على مضان. هذا البروتوكول يمكن إما أن تستخدم لرصد تحرير الحمض النووي الريبي في المختبر أو يتم تكييفه لفحص المكتبات مركب من المقاييس المختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يصف بروتوكول تحت الإجراء لأداء القائم على مضان الحمض النووي الريبي تحرير مقايسة. الفحص لا يمكن أن يؤديها في PCR أنبوب واحد، 96 جيدا، أو لوحات 384 جيدا تبعا لنطاق التجربة. في وقت لاحق إشارة مضان يمكن قراءتها على الوقت الحقيقي PCR نظام الكشف مناسبة. يوصف الفحص هنا في سياق لوحات 384 جيدا.

1. التثقيف T. خلايا البروسية

  1. إعداد المتوسطة النمو لT. البروسية procyclic الخلايا النموذج. ل1 لتر من المتوسط:
    1. حل ز 25.4 مسحوق SDM-79 في المياه 800 مل miliQ.
    2. إضافة 2 غرام من NaHCO 3 و الرقم الهيدروجيني إلى 7.3 مع هيدروكسيد الصوديوم M 10.
    3. إضافة الماء nanopure إلى الحجم النهائي من 900 مل، فلتر تعقيم.
    4. إضافة مصل بقري جنيني (FBS)، البنسلين الستربتوميسين حل وهيمن (2.5 ملغ / مل) لتركيزات النهائي من 10٪ (ت / ت)، و 100 U / مل و 7.5 ملغم / لتر على التوالي.
  2. تنمو 300 مل من T. <م> البروسية 1.7A النوع البري (شكل procyclic) الخلايا عند 28 درجة مئوية، والهز في 70 دورة في الدقيقة لكثافة 1.5 × 10 7 خلية / مل. ملاحظة: هذا يجب أن ينتج 3 مل من editosome نشطة مع ~ 0.5 ملغ من البروتين الكلي، وتكون كافية ل600 ردود الفعل التحرير.
  3. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  4. غسل بيليه مع 50 مل من العازلة PBSG المبرد (10 ملي نا 2 هبو 4، 10 ملم ناه 2 ص 4، 145 مم كلوريد الصوديوم، و 6 ملي الجلوكوز)، وتدور باستمرار الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 ° C.

2. عزل الخام الميتوكوندريا

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات على الجليد أو على 4 درجات مئوية للحفاظ على editosome النشاط.

  1. resuspend الخلايا تحصد في 30 مل من العازلة DTE (1 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0 و 1 ملم EDTA). استخدام 40 مل العقيمة الخالط Dounce (قبل المبردة) لتعطيل غشاء الخلية عن طريق التمسيد صعودا وهبوطا 10 مرات على الأقل على الجليد.
  2. على الفور إضافة 4.3 مل من 60٪ سكروز (ث / ت، أي 1.75 م) إلى جناسة إلى تركيز النهائي من 0.25 م الطرد المركزي في 15،800 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، لتحقيق تفضيلي أسفل الميتوكوندريا.
  3. resuspend الكرية الميتوكوندريا في 4.6 مل من STM العازلة (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 250 ملي السكروز و 2 ملي MgCl 2). إضافة 13.8 ميكرولتر من 0.1 M و CaCl 2 و 4 ميكرولتر من الدناز ريبونوكلياز خالية من الأول إلى تركيزات النهائي من 0.3 ملي و 9 U / مل، على التوالي. احتضان الخليط لمدة 1 ساعة على الجليد.
  4. إضافة 4.6 مل من العازلة STE (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 250 ملي السكروز و 2 ملي EDTA) لإبطال نشاط الدناز أولا الطرد المركزي في 15،800 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  5. resuspend وبيليه في 400 ميكرولتر من تحلل العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.2 و 10 ملي MgCl 2، 100 ملي بوكل، 1 ميكروغرام / مل pepstatin، 1 ملم DTT، و 1X كاملة خالية من مثبط البروتياز EDTA) ونقل إلى microfuge أنبوب.
  6. إضافة 10٪ تريتون X-100 إلى تركيز النهائي من 1٪ ل الثانية احتضان المحللة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية على محور دوار الأنبوب.
  7. مسح المحللة الميتوكوندريا بواسطة الطرد المركزي مرتين في 17،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية؛ الاحتفاظ طاف تطهيرها في كل مرة.

3. Editosome تنقية

  1. صب 10 مل 10٪ -30٪ (V / V) التدرج الجلسرين الخطي (الجدول 1) في أنبوب نابذة فائقة السرعة باستخدام 2X العازلة HHE التدرج (40 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.9، 20 ملي المغنيسيوم (سلا) 2، 100 ملي بوكل، و 2 مم EDTA) وصانع التدرج باتباع دليل التعليمات.
  2. إزالة بعناية 500 ميكرولتر من الحل من أعلى التدرج الجلسرين وتحميل بلطف 500 ميكرولتر من المحللة الميتوكوندريا تطهيرها. تدور في 178،000 x ج لمدة 6 ساعة في 4 درجات مئوية باستخدام نابذة فائقة السرعة.
  3. جمع الكسور 500 ميكرولتر بالتسلسل من أعلى إلى أسفل الانحدار عند 4 درجات مئوية. ثم المفاجئة تجميد الكسور باستخدام النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

ق = "jove_title"> 4. إعداد RNA

  1. يصلب القالب الحمض النووي منها تحتوي على تسلسل مكملة لتسلسل T7 المروج (الجدول 2) مع قليل النوكليوتيد T7 المروج (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') في نسبة المولي 1:1 من التدفئة في 90 درجة مئوية لمدة 3 دقائق والتبريد في RT لمدة 10 دقيقة على الأقل.
  2. نسخ الحمض النووي الريبي باستخدام النسخ عدة في المختبر عن طريق اتباع دليل التعليمات.
  3. وقف رد فعل النسخ عن طريق إضافة حجم مساو من 7 M اليوريا صبغ (7 M اليوريا، 0.05٪ الزيلين Cynol، و 0.05٪ برموفينول الأزرق). تعمل على تصفية تعقيمها 9٪ هلام بولي أكريلاميد تغيير طبيعة (9٪ الأكريلاميد، 7 M اليوريا، 1X TBE).
  4. استخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) التظليل مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية قصيرة الموجة لتحديد مكان والمكوس RNA منها. وضع قطعة هلام رفعه في أنبوب microfuge وإضافة 400 ميكرولتر من هلام شطف العازلة (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 250 ملي NaOAc، 1 ملم EDTA و0.25٪ SDS). أزل بين عشية وضحاها في RT على محور دوار الأنبوب.
  5. PRECIpitate الحمض النووي الريبي مزال بإضافة 1 مل من البرد الإيثانول بنسبة 100٪ واحتضان إما في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو -20 درجة مئوية خلال الليل.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 16،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، لتكوير أسفل الحمض النووي الريبي.
  7. غسل بيليه مع 1 مل من الإيثانول بنسبة 75٪. أجهزة الطرد المركزي في 16،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  8. resuspend الكرية RNA مناسب في ريبونوكلياز المياه مجانا لتحقيق تركيزات المطلوب، كما هو مبين في الجدول رقم 2.

5. مضان القائم على الفحص-RNA التحرير

  1. لفعل واحد، والجمع بين 1 بمول (1 ميكرولتر) من preA6Rbz و 2.5 بمول (1 ميكرولتر) من gA6Rbz (نسبة المولي 1:2.5) في أنبوب microfuge، احتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، والسماح لها الجلوس على RT لفي لا يقل عن 10 دقيقة.
  2. وفي الوقت نفسه إعداد مزيج الرئيسي باستخدام الجدول 3، من دون preA6Rbz وgA6Rbz، للتفاعل التحرير التي تحتوي على 1X العازلة HHE (25 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.9، 10 ملي المغنيسيوم (سلا) 2، 50 ملي بوكل و 10 ملي EDTA)، 1 ملمATP، 5 مم CaCl 2، 16 نانوغرام / ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المستخفية الخميرة، 0.1٪ تريتون X-100، وeditosome المنقى.
  3. إضافة صلب preA6Rbz وgA6Rbz لإكمال مزيج الرئيسي.
  4. الاستغناء 18 ميكرولتر من مزيج الرئيسي (الجدول 3) في الآبار التي تحتوي إما 2 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه (الآبار مع عدم وجود مركبات) أو 2 ميكرولتر من 200 ميكرومتر المركبات الكيميائية وتشمل عينات السيطرة في لوحة وفقا لشكل 5.
  5. ختم اللوحة مع لوحة سداده وتدور لوحة أسفل، لإزالة أي فقاعات الهواء. احتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 4 ساعة.
  6. إضافة 25 بمول (2 ميكرولتر) من gA6Rbz منافس إلى كل بئر. وضع سداده الطازجة، وتدور لوحة أسفل ووضعه على الوقت الحقيقي PCR الجهاز. برنامج التجربة التالية:
    الخطوة 1: 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ الخطوة 2: 24 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة؛ الخطوة 3: إيقاف.
  7. إضافة 15 بمول (1 ميكرولتر) من الحنق الركيزة إلى كل بئر إلى الحجم النهائي من 23 ميكرولتر. ختم لوحة مع السداده الطازجة.تدور بسرعة لوحة ووضعه مرة أخرى على الوقت الحقيقي PCR الجهاز.
  8. البرنامج تجربة جديدة مع الخطوات التالية:
    الخطوة 1: 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ الخطوة 2: اقرأ؛ الخطوة 3: اذهب إلى الخطوة 1، 40 مرة؛ الخطوة 4: إيقاف.
  9. إعداد لوحة عن طريق تحديد جميع الآبار التي تتطلب القراءة واختيار المرشح FAM. حجم المدخلات إلى 23 ميكرولتر وبدء التشغيل.
  10. حساب المنحدر من القيم التي تم الحصول عليها من كل جانب / عينة للحصول على قياس الحركية من خلال التآمر المنحدرات على الرسم البياني شريط للتحليل. ملاحظة: قراءة الحركية يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء بين العينة والخلفية؛ كما العينة الخلفية سيكون له منحدر قريبة من الصفر. قراءة نقطة النهاية لديها أعلى من الضوضاء في الخلفية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لشرح الخطوات اللازمة لإنشاء شاشة واسعة النطاق، أرقام 2-5 لتجارب السيطرة ممثل تتعلق نوعية الفحص. هذه هي التجارب التحكم الأساسية للمقايسة متسقة على مدى عدة أيام من فحص أو للمقارنة بين شاشات مختلفة.

تقييم الإسفار نسبة الإشارة إلى الضوضاء

لضمان الاستقرار ونوعية oligoribonucleotide الركيزة المسمى فلوريسئين في إعداد ن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقدم الإنتاجية العالية طريقة الفرز رواية لتحديد مثبطات ضد مجمع التحرير الحمض النووي الريبي من المثقبيات، وتوفير وسيلة جديدة لاكتشاف الأدوية لمواجهة الأمراض التي تسببها trypanosomatids. وقد استند الحنق-ribozyme الفحص المستخدمة على نطاق واسع لأغراض مختلفة 20-22؛ ومع ذلك، لقد استخدمت قدرات الفحص ribozyme مقرها الحنق لرصد النشاط في المختبر من الحمض النووي الريبي تحرير 19. يحتمل أن تتكيف هذا الاختبار على أنواع أخرى من تحرير الحمض النووي الريبي في حقيقيات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

قدم نجمة نيكبور وفيونا ألوم اقتراحات وحررا هذه المخطوطة. دعم قسم الكيمياء الحيوية في جامعة ماكجيل HM و VM بمبادرة تدريب CIHR في البيولوجيا الكيميائية. تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR) 119464 (إلى R. S.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
SDM-79 MediumGibco من Life Technologies
تقنيات مصل الأبقار الجنينية12483-020تعطيل الحرارة عند 55 & # 176; C لمدة 1 ساعة
Hemin ، الحد الأدنى 80٪SigmaH5533-10G
البنسلين - الستربتومايسين SollutionFisher ScientificMT-30-002-CI
Dnase 1 المؤتلف ، Rnase Free   ؛Roche4716728001
T7 RiboMax Express Large  مقياس RNA  نظام الإنتاجPromegaP1320
Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders   فيشر ساينتفيكK885300-0040   
Gradient Master, ver 5.25 Biocomp107-201M
أنبوب فائق الوضوح ، 13.2 ملبيكمان كولتر344059
Optima L-100XP & nbsp ؛ أجهزة الطرد المركزي الفائقة بيكمان كولتر392052
SW 41 Ti ROTORبيكمان كولتر331336
MicroSeal 'B' Seal ، أختامBioradMSB1001
CFX 384 Touch Real-Time DetectionBiorad185-5484
محلول أكريل / بيس (19: 1) ، 40٪ (وزن / حجم)Bio BasicA0006-500ML
Urea ، درجة البيولوجيا الجزيئية ، 1 كجمتقنيات الحياةAM9902
System

المراجع

  1. Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
  2. Hajduk, S., Ochsenreiter, T. RNA editing in kinetoplastids. RNA biology. 7, 229-236 (2010).
  3. Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
  4. Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
  5. Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
  6. Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
  7. Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
  8. Huang, C. E., O'Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
  9. Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
  10. Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
  11. Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
  12. Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
  13. Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends in parasitology. 21, 508-512 (2005).
  14. Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
  15. Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
  16. Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
  17. Igo, R. P. Jr, et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
  18. Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
  19. Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138(2010).
  20. Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
  21. Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
  22. Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
  23. Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
  24. Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
  25. Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

محرر رنا التريبانوسوماالفرز عالي الإنتاجيةمقايسة المراسل الفلوريريبوزيم المطرقةركيزة نقل الطاقة الرنيني الفلوري (FRET)تحرير رنا الميتوكوندريامقايسة في المختبرمثبطات تحرير رناتدرج الجلسرول
RNA محفز كمراسلة لفحص الحمض النووي الريبي أدوية ضد التحرير في المثقبيات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.