توضح هذه المقالة الفيديو على ميكروأري يستند أسلوب في المختبر لتحديد أهداف الجينات ومواقع الربط لمدة المنظمين استجابة النظام المكون.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تنقية الحمض النووي تقارب رقاقة (DAP رقاقة) طريقة لتحديد الأهداف الجيني للبكتيريا نظامان التنظيمية المكون
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في الأساليب فيفو مثل رقاقة رقاقة هي تقنيات راسخة المستخدمة لتحديد الأهداف الجين العالمية لعوامل النسخ. ومع ذلك، فإنها ليست ذات فائدة محدودة في استكشاف البكتيرية نظامين التنظيمية المكون مع الظروف تفعيل uncharacterized. هذه النظم تنظيم النسخ فقط عند تفعيلها في وجود إشارات فريدة من نوعها. منذ هذه الإشارات غالبا ما تكون غير معروفة، في المختبر ميكروأري تستند الطريقة الموضحة في هذه المقالة الفيديو يمكن استخدامها لتحديد الأهداف الجينات ومواقع الربط للمنظمين الاستجابة. هذا الأسلوب تنقية الحمض النووي تقارب رقاقة يمكن أن تستخدم لأي منظم تنقيته في أي كائن حي مع تسلسل الجينوم. ينطوي على بروتوكول يسمح البروتين الموسومة تنقيته لربط الحمض النووي الجيني المنفصمة ثم تنقية تقارب الحمض النووي المرتبط بالبروتين، يليه وضع العلامات الفلورية من الحمض النووي والتهجين لمجموعة وتبليط مخصصة. السابقة الخطوات التي يمكن استخدامها لتحسين مقايسة لspecifiكما وصف المنظمين ج. وتستخدم القمم الناتجة عن تحليل البيانات للتنبؤ مجموعة زخارف موقع الملزمة، والتي يتم بعد ذلك التحقق من صحة تجريبيا. التنبؤات عزر يمكن استخدامها لتحديد المزيد من الأهداف الجينات المنظمين استجابة orthologous في الأنواع ذات الصلة عن كثب. ونحن لشرح تطبيق هذه الطريقة من خلال تحديد أهداف ملزمة الجينات والزخارف الموقع وبالتالي توقع وظيفة لمنظم استجابة DVU3023 تعتمد على sigma54 في البكتيريا البيئية منتزعة الكبريت الشائع Hildenborough.
المقدمة
قدرة البكتيريا على البقاء على قيد الحياة وتزدهر اعتمادا كبيرا على مدى وهم قادرون على إدراك والرد على الاضطرابات في بيئاتهم، وهذا بدوره يعتمد على أنظمتها نقل الإشارة. وقد دعا عدد من النظم يدل على تشفير بكتيريا في "الذكاء الميكروبي"، ويمكن أن يكون مؤشرا لكلا تنوع بيئتها وقدرتها على الإحساس إشارات متعددة وتهذيب ردها 1. نظامان مكون نقل الإشارة (TCS) هي أنظمة الإشارات الأكثر انتشارا التي تستخدمها البكتيريا، وأنها تتكون من كيناز الحامض الاميني (هونج كونج) تستشعر إشارة خارجية وينقل عبر الفسفرة إلى منظم استجابة المستجيب (RR) 2. يمكن سجلات المورد دينا مجموعة متنوعة من المجالات الانتاج وسائط المستجيب مما مختلفة، لكن....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: بروتوكول الواردة أدناه مصممة لتحديد الأهداف الجين من DVU3023 RR من البكتيريا الشائع Hildenborough منتزعة الكبريت. ويمكن أن تتكيف مع أي منظم النسخي الأخرى ذات الاهتمام.
1. استنساخ وتنقية RR
- استنساخ الجين RR، وتحديدا DVU3023، من D. الشائع Hildenborough إلى القولونية التعبير ناقلات من هذا القبيل أن الجين هو C-عضال صاحب الموسومة والتعبير هو تحت سيطرة المروج T7.
ملاحظة: عدة طرق الاستنساخ ويمكن استخدام ويتم تحديدها من قبل البا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تطبيق الأسلوب أعلاه لتحديد الأهداف الجين العالمية من الممثلين الإقليميين في الحد من كبريتات نموذج بكتيريا منتزعة الكبريت الشائع Hildenborough 7. هذا الكائن لديها عدد كبير من TCSs يمثلها أكثر من 70 سجلات المورد، مما يدل على تشكيلة واسعة من إشارات الممكن أنه يستشعر ويستجيب ل. في الجسم الحي يحلل على وظائف هذه النظم مما يشير يصعب أداء منذ إشاراتها وبالتالي تفعيل الظروف الخاصة غير معروفة. هنا تم استخدام أسلوب DAP رقاقة لتحديد أهداف الجينات، وبالتالي التن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم استخدام أسلوب DAP رقاقة الموصوفة هنا بنجاح لتحديد الأهداف الجين لعدة سجلات المورد في منتزعة الكبريت الشائع Hildenborough 7 من الذي يظهر واحد هنا نتيجة ممثل. لRR DVU3023، واختيار الهدف الجين مرشح كان مباشرة. يقع DVU3025 المصب على الفور من الجين RR، ويتم حفظها لوائح الراديو والهدف الجينات في العديد من الأنواع منتزعة الكبريت، وبالإضافة إلى ذلك DVU3025 لديه تعتمد على sigma54 المروج توقع. يوفر EMSA طريقة بسيطة لاختبار بسرعة لوائح الراديو للربط إلى المرشح.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.
شكر وتقدير
نشكر ايمي تشن لمساعدتها في التحضير لتصوير الفيديو ولإظهار هذه التقنية. هذا العمل الذي قامت به ENIGMA: النظم البيئية والشبكات المتكاملة مع الجينات الجزيئية وجمعيات (http://enigma.lbl.gov)، وهو برنامج مجال التركيز العلمي في مختبر لورنس بيركلي الوطني، وبدعم من مكتب العلوم ومكتب البيولوجية و البحوث البيئية، من وزارة الطاقة في الولايات المتحدة بموجب العقد رقم DE-AC02-05CH11231.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| عمود HisTrapFF (عمود Ni-Sepharose) GE | Lfe Sciences ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 17-5255-01 | |
| مستكشف أكتا (أداة FPLC) GE | Lfe Sciences ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| HiPrep 26/10 عمود تحلية | GE Lfe Sciences ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 17-5087-01 | |
| طقم استخراج جل Qiaquick | Qiagen Inc ، فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 28704 | |
| قليل النوكليوتيدات المسمى بالبيوتين | تقنيات الحمض النووي المتكاملة | N / A | |
| 6٪ بولي أكريلاميد -0.5x TBE جل مصغر لتخليص الحمض النووي | Life Technologies ، جراند آيلاند ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية | EC63652BOX | بالتناوب ، يمكنك صب الجل الخاص بك. |
| غشاء النايلون | EMD Millipore ، Billerica ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | INYC00010 | |
| Trans-Blot SD خلية نقل كهربائية شبه جافة | Biorad ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية | 170-3940 | |
| ورق لطخة سميك للغاية ، 8 × 13.5 سم | Biorad ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 170-3967 | |
| الوصلة المتشابكة للأشعة فوق البنفسجية موديل XL-1000 | فيشر Scientific | 11-992-89 | |
| طقم الكشف عن الحمض النووي الكيميائي (بيرس) ثيرمو | فيشر علمي ، روكفورد ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية | 89880 | |
| Ni-NTA راتنج الاغاروز | Qiagen Inc ، فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 30210 | |
| مجموعة تضخيم الجينوم الكامل GenomePlex (المخزن المؤقت للتجزئة ، المخزن المؤقت لإعداد المكتبة ، محلول تثبيت المكتبة ، إنزيم تحضير المكتبة ، مزيج التضخيم الرئيسي 10x ، بوليميراز WGA) | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | WGA2-50RXN | |
| Nanodrop ND-1000 | Thermo Scientific ، ويلمنجتون ، دي ، الولايات المتحدة الأمريكية | لتقدير كمية الحمض النووي | |
| Perfecta Sybr Green SuperMix ، مع ROX | Quanta biosciences | 95055-500 | يمكن استخدام أي مزيج Sybr Green PCR |
| PlateMax Ultra Clear لفيلم الختم الحراري ل qPCR | Axygen | ||
| 96 جيدا واضح منخفض المستوى PCR microplate | Life Technologies ، جراند آيلاند ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية | PCR-96-LP-AB-C | |
| الأنظمة الحيوية التطبيقية StepOne Plus نظام PCR في الوقت الحقيقي | Life Technologies ، جراند آيلاند ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية | 4376600 | استخدام أي نظام PCR في الوقت الفعلي |
| طقم تنقية Qiaquick PCR | Qiagen Inc ، فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 28104 | استخدام أي مجموعة تنظيف PCR |
| علامة Cy3 / Cy5 nonamers | Trilink biotechnologies ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | N46-0001 ، N46-0002 | |
| Klenow polymerase 50،000 U / ml ، 3'-5 'exo-< / sup> New | England Biolabs ، إبسويتش ، MA | M0212M | |
| نظام التهجين | Roche-Nimblegen ، Madison ، WI ، USA | N / A | لم تعد هذه الشركة تصنع مصفوفات أو عناصر ذات صلة ، لذلك يجب استخدام مصادر بديلة مثل Agilent أو Affymetrix. |
| المصفوفات الدقيقة المطبوعة المخصصة والخلاطات | Roche-Nimblegen و Madison و WI و USA | N / A | |
| مجموعة التهجين (2x مخزن مؤقت للتهجين ، مكون التهجين A ، أوليغو المحاذاة) | Roche-Nimblegen ، Madison ، WI ، USA | N / A | |
| مجموعة عازلة الغسيل (10x عازلة غسيل I ، II ، III ، 1 M DTT) | Roche-Nimblegen ، Madison ، WI ، USA | N / A | |
| ماسح ضوئي للمصفوفات الدقيقة GenePix 4200A | الأجهزة الجزيئية ، Sunnyvale CA ، الولايات المتحدة الأمريكية | تم استبدال هذا النموذج بنماذج | |
| GenePix Pro microarray software | Molecular Devices و Sunnyvale CA و USA | ||
| Nimblescan v.2.4 و ChIP-chip software | Roche-Nimblegen و Madison و WI و USA | N / A |
المراجع
- Galperin, M. Y. Diversity of structure and function of response regulator output domains. Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).
- Casino, P., Rubio, V., Marina, A. The mechanism of signal transduction by two-component systems. Curr Opin Struct Biol.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
