مقالة منهجية

والفحص السلوكية بسيطة لاختبار وظيفة البصرية في

DOI:

10.3791/51726

⸱

يونيو 12, 2014

 , 
1Ophthalmology Department, Center for Vision Research, SUNY Eye Institute, Upstate Medical University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القيطم المورق الضفادع الصغيرة يفضلون السباحة على الجانب الأبيض من الأسود / الأبيض دبابة. ويسترشد هذا السلوك حسب رؤيتهم. بناء على هذا السلوك، نقدم مقايسة بسيطة لاختبار وظيفة البصرية من الضفادع الصغيرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قياس وظيفة البصرية في الضفادع الصغيرة من الضفادع، القيطم المورق، ويسمح الفحص للعمى في الحيوانات الحية. استجابة حركة العين هو القائم على الرؤية، والسلوك الانعكاسي التي لوحظت في جميع الفقاريات التي تم اختبارها. عيون الشرغوف هي صغيرة جدا كانت تستخدم الاستجابة الذيل الوجه كإجراء بديل، الأمر الذي يتطلب تدريب فني لتسجيل استجابة خفية. وضعنا مقايسة السلوك البديلة استنادا إلى حقيقة أن الضفادع الصغيرة يفضلون السباحة على الجانب الأبيض من دبابة عند وضعه في خزان مع الجانبين على حد سواء بالأبيض والأسود. مقايسة المقدمة هنا هي غير مكلفة، والبديل بسيط هو أن يخلق الاستجابة التي يتم قياسها بسهولة. يتكون الإعداد ترايبود، وكاميرا ويب والدبابات اختبار متداخلة، متوفرة في معظم المختبرات القيطم. يتضمن هذا المقال فيلم يظهر سلوك الضفادع الصغيرة، قبل وبعد قطع العصب البصري. من أجل اختبار وظيفة عين واحدة، ونحن تشمل أيضا تمثيلاالنتائج sentative من الشرغوف الذي خضع كل عين axotomy الشبكية في أيام متتالية. يمكن أن الدراسات المستقبلية تطوير نسخة من هذا الاختبار الآلي لاختبار رؤية العديد من الضفادع الصغيرة في آن واحد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت المورق القيطم كما كائن نموذج لدراسة تشكيل العين. عيون تتطور بسرعة، وتزايد إلى النضج في أقل من أسبوع لاختبار الجينات أو الممرات التي يكون لها تأثير على تطوير البصرية وظيفة. لاختبار وظيفة البصرية، وقد استخدمت استجابة حركة العين وoptomotor في الزرد والشراغف القيطم، على التوالي 1،2. لأن عيون الضفادع الضفدع هي أصغر نسبيا من الزرد، ويتطلب هذا الاختبار استخدام المعدات المتخصصة والموظفين المدربين للكشف عن ذيل الوجه وحركة العين السلوك خفية في القيطم. A السلوك أكثر قوة في القيطم هو تفضيل السباحة في خزان مع خلفية بيضاء، الذي يوصف هنا 3. عند وضع الشرغوف في أسود / أبيض نصف خزان نصف، الشرغوف قبل المتحولة تسبح بسرعة إلى الجانب الأبيض من الخزان. كنا في السابق هذا الاختبار لتحديد ما إذا المستمدة الخلايا المحفزةكانت عيناه الوظيفية 4. هنا، ونحن التقرير نسخة مفصلة من هذا الاختبار، والتي يمكن استخدامها لاختبار وظيفة البصرية من الضفادع الصغيرة القيطم premetamorphic.

هذا الاختبار هو أبسط من فحص استجابة optomotor، نظرا لأنه لا يتطلب سوى كاميرا الفيديو الرقمية التي شنت، برنامج الكاميرا الرقمية والمعدات القياسية وجدت في معظم المختبرات القيطم. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب استجابة تسجل أي تدريب خاص لنتائج الفرز. نتائجنا تظهر الممثلة أن نفس المجموعة من الضفادع الصغيرة، بعد أن خضع axotomy الشبكية مزدوجة، والسباحة بشكل عشوائي في جميع أنحاء دبابات. أدرجنا أيضا نتائج فحص السلوك من الشرغوف ممثل، والتي تبين كيف يمكن اختبار عين واحدة للاستجابة بصرية. وقد أدرجت ورقة العمل بحيث أرقام المكتسبة خلال الفحص يمكن إدراجها وتحليلها. ويمكن استخدام ورقة العمل هذه إلى تحديد ما إذا كان اختبار الضفادع الصغيرة لديها استجابة بصرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

رعاية الحيوان

والقيطم المورق كانت تزرع الضفادع الصغيرة المستخدمة في هذه الدراسة، التي أثيرت ويعامل وفقا للإجراءات المعتمدة من قبل جامعة شمالي ولاية الطبية IACUC ودليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1 الإعداد ما قبل السلوك: الشراغف

  1. الحصول على الأجنة المخصبة القيطم من مصدر متاح تجاريا أو إخصاب البويضات في المختبر، كما هو موضح سابقا 6.
  2. وضع الأريمة إلى العصبية الأجنة لوحة خشبة المسرح في 18 ˚ C في 60 ملم أطباق بتري تحتوي 0.1X MMR [10 معدلة الأسهم (MMR) حل رينغر X مارك في (10 ملم MgCl 2 و 20 ملي بوكل، و 20 مم CaCl 2 و 50 ملي HEPES؛ 1 M كلوريد الصوديوم؛ تعديلها لدرجة الحموضة 7.5، تعقيمها وتخزينها في RT)] مع المضادات الحيوية الجنتاميسين 50 ميكروغرام / مل. تغيير 0.1X MMR كل يوم، وإزالة أي أجنة ميتة.
  3. مرة واحدة الأجنة تصل Nieuwkoop وفابر المرحلة ~ 27-30 يوليو، والتبديل عشرالأجنة الإلكترونية في 0.1X MMR دون المضادات الحيوية للسماح نمو الأمعاء البكتيرية.
  4. تنمو الشراغيف حتى يصلوا إلى مرحلة الرضاعة (مرحلة 45) ونقلها الى 100 ملم بيتري أطباق مليئة 0.1X MMR. إطعامهم نبات القراص مسحوق طاف كل يوم لمدة أسبوع، وتغيير 0.1X MMR يوم التدخل.
  5. بعد أسبوع واحد في طبق بتري 100 ملم، نقل الحيوانات إلى نصف غالون الدبابات مليئة الضفدع المياه [0.5 غرام / لتر المحيط الفورية و 2 ملي الصوديوم ثنائي القاعدة فوسفات (نا 2 هبو 4: ميغاواط 141.96) درجة الحموضة 6.8]. إطعامهم كما في الخطوة 2.4، ولكن تغيير الماء فقط 2-3 مرات في الأسبوع عندما الماء عكرا. الحفاظ على الحيوانات في 12 ساعة light/12 دورة ضوء الظلام مع أضواء على تحول في الساعة 6 صباحا.
  6. وضع خزان نصف غالون مع اختبار المواضيع على سطح أبيض مثل مقعد underpad المختبر، لا يقل عن 12 ساعة O / N، قبل الاختبار.
  7. الضفادع الصغيرة في مراحل الاختبار 45-50 كما هو موضح في الخطوة 3 أدناه.

2 إعداد ما قبل السلوك: إقويبمنر

  1. تخصيص مساحة المختبر لفحص السلوك. ينبغي أن يكون في منطقة هادئة ومنخفضة الزيارات مع الإضاءة الفلورسنت القياسية.
  2. إعداد الدبابات اختبار للحيوانات.
    وتتألف والدبابات اختبار نصف غالون متداخلة من جزأين: دبابة الداخلية التي ستعقد الماء والضفادع الصغيرة؛ ودبابة الخارجي مع التحفيز البصري.
    1. للخزان الداخلي، وجعل علامة صغيرة على زوايا خارج مع شربي، 5 سم من الأسفل؛ هذا هو خط المياه (الشكل 1A، خط منقط الأخضر).
    2. أيضا، لالخزان الداخلي، وملء divets في الخزان (في الزوايا والوسط) مع مركب خامل، مثل Sylgard المطاط الصناعي. ملاحظة: إن الضفادع الصغيرة ما زالت قائمة في هذه المناطق إذا لم يتم ردمها
    3. للخزان الخارجي، وتغطية واحد بالضبط نصف خارج خزان واحد مع شريط أسود الكهربائية، والنصف الآخر مع الأنسجة ورقة بيضاء الشكل 1B.
  3. وضع الدبابات علىبتلقيح القرص الدوار.
  4. إعداد الكاميرا / ترايبود بحيث يكون فوق الدبابات الاختبار. ضبط الكاميرا للسماح التصور من منطقة الاختبار، كما هو مبين في الشكل 1C.
  5. توصيل الكاميرا إلى جهاز كمبيوتر مع برنامج كويك تايم بلاير تثبيت 5. بدوره على الكاميرا. في لاعب كويك تايم، تحت ملف، حدد "تسجيل فيلم جديد". سوف الإعداد فحص السلوك تكون مرئية على جهاز الكمبيوتر على الفور.
  6. ثنى قطعة قماش قطنية خفيفة خلال الإعداد بأكمله للحد من الاشارات الخارجية التي يمكن أن تؤثر على سلوك الشرغوف، وكذلك، والحد من الضوء المنعكس على سطح الماء.
  7. تأكد من أن الإنارة في إطار التدابير القماش بين 35-50 شمعة / م 2.

3. سلوك الفحص

  1. ملء خزان الاختبار الداخلي إلى علامة 5 سم المياه في الخطوة 1.2.1 بالماء الضفدع.
  2. باستخدام شبكة صغيرة، تتحرك بلطف الحيوان في خزان الاختبار الداخلي.
  3. مفتوحة سuickTime البرنامج على جهاز الكمبيوتر و، وذلك باستخدام خزان الخارجي كدليل، تأكد من أن الكاميرا قادرة على تصور وتسجل منطقة الاختبار.
  4. كتابة اسم حيوان، التاريخ والوقت على قطعة من الورق، وسجل مع الكاميرا.
  5. وضع خزان اختبار في خزان الخارجي مع الجانب الأسود من الخزان إلى اليمين الشكل 2.
  6. بدء تسجيل الفيلم مباشرة بعد ترتيب خزان وتعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 2 دقيقة.
  7. عندما الصفافير الموقت، وإزالة خزان الاختبار الداخلي، وتناوب على خزان الخارجي 180 درجة ووضع خزان الاختبار الداخلي داخل الخزان الخارجي. بدء موقت. ملاحظة: يجب أن يكون الجانب الأسود الآن على الجانب الآخر.
  8. كرر الخطوة 3.7، ثماني مرات أكثر ليصبح المجموع عشر تجارب. استخدام الشكل 2 كدليل، والتحقق من كل محاكمة.
  9. تكرار فحص السلوك على يومين منفصلين.

4. الشبكية Axotomy

  1. وضع الحيوان في 0.02٪ تريكين حتى أنها لا تستجيبلقرصة الذيل مع # 3 ملقط.
  2. تذوب 1٪ الاغاروز في 0.1X MMR ومن ثم إضافتها إلى طبق بتري 60 مم. مرة واحدة تبرد، وجعل ديفت مستطيلة صغيرة في الاغاروز وإضافة الشرغوف إلى ديفت مع قليلا بنسبة 0.02٪ تريكين، بحيث يتم المغمورة جزئيا الحيوان في السائل.
  3. يخترق الجلد في زاوية 45 درجة وراء ظهري المنطقة من العين مع إبرة 25 G، في حين تستعد الحيوان ضد ملقط على الجانب المقابل.
  4. مع الحرص على عدم قص الوريد، والتي تقع بالقرب من العصب البصري، والوصول إلى بعناية في الحفرة مع # 5 ملقط، قص العصب البصري والوجه للخروج من الطريق. إذا كان هناك نزيف حاد بسبب القص بالصدفه الشريان، ثم ضع بسرعة الحيوان في 2٪ تريكين إلى الموت ببطء. تحذير: 2٪ محلول تريكين يمكن أن تسبب خدر في البشر. وينبغي التعامل مع هذا الحل مع قفازات.
  5. لاستعادة الحيوان بعد الجراحة، ووضع الحيوان في 100 مم طبق بتري مع 0.7X MMR و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين لمدة 20 دقيقة. شمال شرقXT، ونقل الشرغوف إلى خزان المياه الانتعاش مع الضفدع. دعونا بقية الحيوانات O / N.
  6. في صباح اليوم التالي، اختبار وظيفة البصرية كما هو موضح أعلاه (الخطوات 3،1-3،9).

5. تحليل نتائج

  1. بعد الانتهاء من المحاكمات، وقياس مقدار الوقت يبقى الشرغوف على الجانب الأسود من الخزان.
    1. عرض الفيديو باستخدام برنامج الذي يعرض الوقت ويسمح التوقف المتكرر يدويا. ننظر في ذلك الوقت عرض الفيديو. كتابة بدء محاكمة اثنين من دقيقة، وهو عندما أعشاش الخزان الداخلي بنجاح داخل الخزان الخارجي والمربعة في ضوء الكاميرا.
    2. استخدام موقف عيون الشرغوف لتحديد أي جانب من خزان الحيوانات والسباحة على. تحديد عبور من جانب واحد من الدبابة إلى أخرى إلا عندما عبروا كلتا العينين و/ خط أبيض أسود.
  2. أكتب بداية ونهاية كل فترة (في ثانية) أن الحيوان تنفق على الجانب الأسود. وقفة وإعادةالرياح الفيديو لضمان الدقة. مجموع المجلس الأعلى للتعليم في كل محاكمة.
  3. إدخال هذه الأرقام في ورقة عمل السلوك المرفقة. سوف رقة عمل حساب نسبة الوقت الذي قضى الحيوان على الجانب الأبيض من خلال طرح الوقت الذي يقضيه على الجانب الأسود للدبابات من مجموع 120 ثانية المحاكمة والقسمة الوقت الإجمالي في ثانية [(120 - مجموع ثواني تنفق على الجانب الأسود) / 120 ثانية]. المتوسطات ورقة العمل هذه النسبة على جميع التجارب 10.
  4. استخدام اختبار T-طالب، وإرفاقها، توزيع ثنائي الطرف لتحديد ما إذا كانت التجارب بين الأيام هي معنوية (P ≤ 0.05).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أظهرت تقارير سابقة أن الضفادع الصغيرة القيطم premetamorphic يفضلون السباحة على الجانب الأبيض من الأسود / الأبيض دبابة ودعا هذا الاختبار، ولون الخلفية ميول الفحص 3 لقد غيرنا هذا الاختبار من أجل اختبار وظيفة البصرية من العين إما من الضفادع الصغيرة في أقل من أسبوع. في هذه الطريقة، عيونهم يمكن جمعها للفحص النسيجي.

نعرض هنا كيف هو الرد بسبب الإشارات البصرية. في الفيلم 1، والضفا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا التقرير مقايسة السلوكية الموجهة الرؤية البسيطة التي يمكن القيام بها بسهولة في أقل من أسبوع من قبل أفراد مدربين مختبر الحد الأدنى. بينما فحوصات أخرى تتطلب معدات متخصصة وخبرة في سلوك الحيوان، هذا الاختبار يسمح اختبار سريع لتحديد وظيفة البصرية. وقد تم تطوير فحص السلوكية آخر، وتجنب الفحص المرئي، لتحديد كيفية مساهمة السقف إلى الإدراك البصري في القيطم 10. وذكرت هذه التدابير فحص ضبط المكانية وحساسية التباين في استجابة لتتحرك مقابل خلفية مستقرة، وبالتالي، يمكن ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة: ​​EY015748، EY017964 (MEZ)، وEY019517 (ASV). وأيد هذا العمل أيضا من قبل البحوث للوقاية من العمى المطلق منحة لوزارة طب وجراحة العيون والأسود من وسط نيويورك. نود أيضا أن نشكر فني الحيوانية لدينا، ماثيو Mellini بطابع، لرعايته ممتازة من الحيوانات ويخطو في لنجمة في هذا الفيديو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1/2 جالون فليكس تانك مع غطاءeNascoSB19271Mالحجم: 5-3 / 8 بوصة × 7 بوصة × 3-3 / 4 بوصة
شريط
مناديل ورقية
دوار كبير للتلقيحVWR50809-022الحجم: ضياء 114.3 x & nbsp ؛ H 76.2 مم (4 1/2   ؛ x & nbsp ؛ 3 بوصات)
Durasorb underpadVWR82004-836الحجم: 43.2 × 60.1 سم (17 × 24 بوصة) Kimwipe
Krackeler Scientific، Inc.1945-34155-CS
حامل ثلاثي القوائم
كاميرا iSight أو كاميرا ويبAppleM8817LL / Aجيد للضفادع الصغيرة الكبيرة ولكن يصعب رؤية الضفادع
الصغيرة أجهزة الكمبيوتر المحمولةApple / PCمتنوعةاستخدمنا جهاز MacBook مقاس 13 بوصة ، 2 جيجاهرتز Intel Core 2 Duo يعمل بنظام MacOSX Lion 10.7.5
كاميرا فيديو MiniDV handycamSONYDCR-HC42متصلة عن طريق firewire بالكمبيوتر مع 6 موصل و 4 موصل ألفا FireWire 400 & nbsp ؛
محطة HandycamSONYDCRA-C121يمكن استخدام هذا لتوصيل Firewire بالكاميرا
برنامج QuickTime PlayerQuicktime الإصدار 10.1
26 G إبرة (5/8 بوصة)VWRBD305115
Dumont # 5 ملقطأدوات العلوم الدقيقة11295-10
المستهلكات
كبريتات الجنتاميسين [50 مجم / مل]فيشر سينتيفيك17-528Zمخزنة في RT
Sylgard 184 مطاط سيليكونفيشر ساينتفيكNC9644388
المحيط الفوريأطباء فوستر وسميثCD-116528محلول المخزون = 100 جم / لتر مخزن في RT
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةSigma AldrichS0876محلول المخزون = 0.4 متر مخزن في RT
في المختبر < / em > الأجنة المخصبةeNascoLM00490MX100 جنين / وحدة
كهربائي أسودبيضاء قرص قياسي متعدد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).
  2. Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus. J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).
  3. Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole. J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).
  4. Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7 (8), (2009).
  5. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).
  6. Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis. J Vis Exp. 16 (39), (2010).
  7. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
  8. Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms. PLoS One. 5 (12), (2010).
  9. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS One. 6 (5), (2011).
  10. Dong, W., et al. Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum. J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
  11. Lan, L., et al. Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).
  12. De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Xenopus Xenopus

مقالات ذات صلة