مقالة منهجية

توجه الدوبامين العصبية التمايز من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

DOI:

10.3791/51737

⸱

سبتمبر 15, 2014

 ,  , 
1Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

، بناء على المعرفة من علم الأحياء التنموي والأبحاث المنشورة ، قمنا بتطوير بروتوكول محسن لتوليد الخلايا العصبية الدوبامين A9 في منتصف الدماغ بكفاءة من كل من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ، والتي ستكون مفيدة لنمذجة الأمراض والعلاج باستبدال الخلايا لمرض باركنسون.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا العصبية الدوبامين (DA) في المادة السوداء المضغوطة (المعروفة أيضا باسم الخلايا العصبية A9 DA) هي نوع الخلية المحدد الذي يفقد في مرض باركنسون (PD). هناك اهتمام كبير باستقاق الخلايا العصبية A9 DA من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) لعلاج استبدال الخلايا التجديدية لمرض باركنسون. أثناء التطور العصبي ، تنشأ الخلايا العصبية A9 DA من سلائف صفيحة الأرضية (FP) الموجودة في خط الوسط البطني للجهاز العصبي المركزي. هنا ، قمنا بتحسين ظروف الثقافة للتمايز التدريجي بين الخلايا العصبية hPSCs إلى الخلايا العصبية A9 DA ، والتي تحاكي تطور الخلايا العصبية DA الجنينية. في بروتوكولنا ، نصف أولا التوليد الفعال لخلايا سلائف FP من hPSCs باستخدام طريقة جزيء صغير ، ثم نحول خلايا FP إلى خلايا عصبية A9 DA ، والتي يمكن الاحتفاظ بها في المختبر لعدة أشهر. يعمل هذا البروتوكول الفعال والقابل للتكرار والتحكم بشكل جيد في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) من الأشخاص العاديين ومرضى باركنسون ، حيث يمكن للمرء اشتقاق الخلايا العصبية A9 DA لأداء نمذجة الأمراض في المختبر وفحص الأدوية وعلاج زرع الخلايا في الجسم الحي لمرض باركنسون.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدوبامين (DA) الخلايا العصبية يمكن العثور عليها في عدة مناطق الدماغ، بما في ذلك المخ الأوسط، المهاد، شبكية العين، وبصيلات الشم. الخلايا العصبية A9 DA في بارس المادة السوداء المكتنزة (SNpc) سلوك السيطرة والحركة من خلال إبراز أن المخطط في الدماغ الأمامي وتشكيل الجهاز الحركي خارج الهرمي. تنكس الخلايا العصبية A9 DA يؤدي إلى مرض باركنسون (PD)، الذي هو الثاني الأكثر شيوعا اضطراب الاعصاب البشري وغير قابل للشفاء حاليا. العلاج ببدائل الخلية هي واحدة من الاستراتيجيات الواعدة لعلاج PD 1، لذلك، كان هناك اهتمام كبير في استخلاص الخلايا العصبية A9 DA من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية ا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام

  1. إعداد الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEF) المتوسطة من خلال الجمع ما يلي: 445 مل DMEM، 50 مل مصل بقري جنيني (FBS)، و 5 مل 100X البنسلين / الأمبيسلين محلول المخزون. إبقاء فلتر تعقيم المتوسطة في 4 درجة مئوية لمدة لا تتجاوز 14 يوما.
  2. إعداد hPSC مستنبت من خلال الجمع بين التالية التي تحتوي على المصل: 385 مل DMEM / F12، 100 مل استبدال خروج المغلوب المصل (KSR)، 5 مل 100X غير الأساسيين حل محلول المخزون من الأحماض الأمينية، 5 مل 100X البنسلين / الأسهم الأمبيسلين، 5 مل ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم عرض لمحة عامة عن بروتوكول التمايز في الشكل 1. كفاءة بروتوكول التمايز المعروضة هنا تعتمد على وضع الخلايا تبدأ. لذا، من المهم جدا للتأكد من أن أول واحد يزيل كل المستعمرات متباينة قبل النأي hPSCs إلى الخلايا واحد للتمايز، والثانية، واحد يستنزف معظم، إن لم يكن كلها، والخلايا المغذية MEF التي تفرخ الخلايا على لوحات الجيلاتين المغلفة لمدة 30 دقيقة، والثالثة، واحدة لوحات الخلايا واحدة hPSC في الكثافة المناسبة على لوحة Matrigel. كما هو موضح في الشكل 2،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (بما في ذلك hESCs وhiPSCs) يمكن التفريق في المختبر لتوليد معظم، إن لم يكن كل، أنواع الخلايا من الجسم بما في ذلك الخلايا العصبية DA، الذي ثبت في الدراسات السابقة 19. هنا، على أساس المعرفة من الدوبامين العصبية الجنينية تطوير 20 والبروتوكولات المنشورة من المختبرات الأخرى 14،15، نحن الأمثل الظروف الثقافة لتوليد الخلايا العصبية DA من hESCs وhiPSCs. هذا البروتوكول هو الكفاءة، واستنساخه لدينا تطبيق هذا البروتوكول ا.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون أعضاء مختبر رينيه ريجو بيرا على المساعدة أثناء تطوير هذا البروتوكول وأثناء إعداد هذه المخطوطة. يتم دعم هذا العمل من قبل المختبر المشترك لمعهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) (CL-00518).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEMLife Technologies10569-010
FBSLife Technologies26140
البنسلين / الأمبيسلينLife Technologies15140-122
DMEM / F12Life Technologies10565-018
KSRLife Technologies10828-028
الأحماض الأمينية غير الأساسيةLife تقنيات11140-050
b-mercaptoethanolMilliporeES-007-E
bFGFR& D Systems233-FB-025
mTesR1STEMCELL Technologies5850
Collagenase IVLife Technologies17104-019
الجيلاتينSigma-AldrichG9391
N2 supplementLife Technologies17502-048
ملحق B27Life Technologies17504-044
تقنيات الحياة العصبية21103-049
تقنيات GlutamaxLife35050-061
PBSLife Technologies10010-023
انخفاض عامل النمو matrigelBD Biosciences354230
AccutaseMP Biomedicals1000449
ThiazovivinSanta Cruz Biotechnologysc-361380
SB431542Tocris Bioscience1614
LDN-193189Stemgent04-0074
SAGEMD Millipore566660-1MG
بورمورفامينسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-202785
FGF8bR & D Systems423-F8-025
CHIR99021Cellagen TechnologyC2447-2s
BDNFR& أنظمة D248-BD-025
GDNFR& أنظمة D212-GD-010
TGF-beta3R & D Systems243-B3-002
حمض الأسكوربيكسيجما ألدريتشA4034
cAMPسيجما ألدريتشD0627
الفأر المضاد للإنسان NESTIN الجسم المضادسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-239271/1،000 تخفيف
الأرنب المضاد للإنسان OTX2 الجسم المضادMilliporeAB95661 / 2,000
الماعز المضاد للجسم المضاد FOXA2 البشريR & D SystemsAF24001/200 تخفيف
الأرنب المضاد للجسم المضاد LMX1a للإنسانMilliporeAB105331 / 1,000 التخفيف
الأرنب المضاد للجسم المضاد TH البشريPel FreezP401011/500 تخفيف
الدجاج المضاد للإنسان TH الجسم المضادMilliporeAB97021/500
الفأر المضاد للجسم المضاد للإنسان TUJ1CovanceMMS-435P1 / ، 2000 التخفيف
أرنب مضاد للإنسان GIRK2 الجسم المضادAbcamab307381/300 تخفيف
أرنب مضاد للإنسان كالبيندين الجسم المضادAbcamab250851/400
جهاز الطرد المركزيEppendorf5804
تخفيف تخفيف تخفيف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
  2. Perrier, A. L., et al.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

A9

مقالات ذات صلة