بروتوكولات لإعداد كفاءة عينات متجانسة من العناكب، الإصابة من النباتات التجريبية، وتقييم الأضرار النبات، كما هو مطلوب للدراسات التفاعل النبات للآفات وضعت.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
* These authors contributed equally
بروتوكولات لإعداد كفاءة عينات متجانسة من العناكب، الإصابة من النباتات التجريبية، وتقييم الأضرار النبات، كما هو مطلوب للدراسات التفاعل النبات للآفات وضعت.
سوس العنكبوت رصدت اثنين، الخاشية urticae، هو في كل مكان عاشب المفصلية قارت التي تتغذى على مجموعة واسعة بشكل ملحوظ من الأنواع، مع أكثر من 150 من القيمة الاقتصادية. بل هو آفة كبرى من المحاصيل المسببة للاحتباس الحراري، وخاصة في الباذنجانية وقرعية (على سبيل المثال، الطماطم، الباذنجان، الفلفل، الخيار، الكوسة) ونباتات الزينة الدفيئة (على سبيل المثال، الورود، والأقحوان، والقرنفل) والمحاصيل الحقلية السنوية (مثل الذرة والقطن و فول الصويا، وبنجر السكر)، وفي الثقافات المعمرة (البرسيم، والفراولة، العنب، الحمضيات، والخوخ) 1،2. بالإضافة إلى polyphagy المدقع الذي يجعل من الآفات الزراعية الهامة، T. urticae لديه ميل لتطوير مقاومة لمجموعة واسعة من المبيدات الحشرية ومبيدات قراد التي تستخدم لسيطرتها 3-7.
T. urticae هو كائن التجريبية ممتازة، كما أن لديها دورة الحياة السريعة (7 أيام في 27 درجة مئوية)ويمكن الحفاظ على كثافة عالية بسهولة في المختبر. وقد تم تطوير طرق لفحص التعبير الجيني (بما في ذلك الموقع التهجين وتلوين الأجسام المضادة في) وتعطيل التعبير عن جينات العنكبوت سوس الذاتية باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي 8-10. في الآونة الأخيرة، وتسلسل الجينوم كله من T. وقد تم الإبلاغ عن urticae، وخلق فرصة لتطوير هذا النبات للآفات باعتبارها كائن النموذج مع الموارد الجيني يعادل موجودة بالفعل في بعض النباتات مضيفه (thaliana نبات الأرابيدوبسيس والطماطم مغد قوطة) 11. معا، يمكن لهذه الكائنات نموذج تقديم نظرة ثاقبة الأسس الجزيئية للتفاعلات النباتات من الآفات.
هنا، يتم وصف وسيلة فعالة لجمع سريعة وسهلة لعدد كبير من العث الإناث الكبار، تطبيقها على المضيف محطة تجريبية، وتقييم الأضرار النباتية بسبب التغذية العنكبوت سوس. بروتوكول قدمت ENABLES جمع سريعة وفعالة من مئات الأفراد في أي مرحلة التطوير (بيض، يرقات، الحوريات، الذكور البالغين، وإناث) التي يمكن استخدامها لتطبيق التجارب اللاحقة.
تفاعل النبات من الآفات هو موضوع من الأهمية العلمية والاقتصادية كبيرة. وقد درس تاريخيا باستخدام كل من نباتات المحاصيل (مثل الطماطم) ومحطة نموذجية، A. thaliana. في كلتا الحالتين، يمكن قياس قابلية النبات لعاشب إما مباشرة من خلال تقييم النمط الظاهري المصنع بعد هجوم عاشب أو بشكل غير مباشر من خلال تقييم الأداء الآفات.
واستخدمت القياسات المباشرة من قابلية النبات سابقا لعدد من أنواع الآفات الحشرية باستخدام مجموعة من الأساليب. على سبيل المثال، يقاس الحيوانات العاشبة من اليرقات lepidopteran بمثابة تقدير جزء من الأنسجة النباتية التي يستهلكها إما Plutella xylostella (الماسي العثة) أو Trichoplusia ني (الملفوف وبير) بالعين المجردة بمساعدة شبكة 12. أيضا، هناك طرق التي تستخدم التصوير الرقمي من الأضرار اللاحقة رقة مع تحليل الصور الكمي. واستخدمت هذه الأساليب فيدراسات A. التفاعل مع thaliana Frankliniella occidentalis (التربس زهرة الغربية) 13، Scaptomyza الضبعة (ذبابة الفاكهة أوراق التعدين) 14، وT. ني 15.
وتستخدم على نطاق واسع من القياسات غير المباشرة قابلية النبات في دراسات التفاعل النبات من الآفات. على سبيل المثال، حساسية A. ويتم تقييم thaliana إلى الخوخ المن Myzus بيرسيكا الحيوانات العشبية عادة من خلال تحليل خصوبة الآفات وصفا مورفولوجيا الجسيمة لمصنع بعد التفاعل 16،17. آخر مؤشر غير مباشر نموذجية من A. thaliana التعرض للآفة هو تقييم الوزن الجاف أو الرطب من النبات. يتم استخدام هذه المعلمة عادة لوصف الحيوانات العاشبة من lepidoterans، مثل Pieris rapae (بيضاء صغيرة)، P. xylostella، أو T. ني في اليرقات أو مراحل العذراء 15،17.
العناكب هي الخلية محتوى الحديدeders. ومن المسلم به الضرر الناجم عن سوس كمجموعة من البقع داء الاخضرار التي تتراوح في اللون من الأبيض إلى الأخضر الشاحب. قابلية مجموعة مصنع لسوس العنكبوت الحيوانات العاشبة تم تقييم سابقا إما بشكل غير مباشر من خلال تحليل أداء سوس العنكبوت أيام آخر الإصابة، 18،19، أو مباشرة باستخدام التشكل الإجمالي من النباتات أسابيع بعد الإصابة 18 أو باستخدام التصوير الرقمي من الأوراق المكشوفة لالعث لعدة أيام لاحقة مع تحليل الصور الآلي 19. ويجري تطوير هذه الأساليب وتستخدم لدراسات التفاعلات بين نباتات الطماطم وT. urticae، والتي تستخدم عادة أعداد صغيرة من العناكب (5-15 في العلاج) التي تم جمعها من السكان سوس المختلطة ووضعت على سطح الورقة باستخدام فرشاة ناعمة. ومع ذلك، وهذه الأساليب ليست مناسبة للدراسات التي يحتاج فيها أعداد أكبر من العث ليتم تطبيقها. بالإضافة إلى ذلك، في حين أن معالجة مباشرة لأوراق الصور في برنامج تحليل الصورمثل أدوبي فوتوشوب (سان خوسيه، كاليفورنيا) أو يماغيج 20 يمكن استخدامها لتحليل الضرر الطماطم، وهذه البروتوكولات تحتاج إلى تعديل من أجل تطبيقها على الأوراق التي لديها أكبر انعكاسية السطح أو ملونة خفيفة ولها التريكوم واضح للغاية ( على سبيل المثال، A. thaliana) التي تتداخل مع اختيار الآلية من البقع التي تميز داء الاخضرار الضرر النبات. وعلاوة على ذلك، فإن المرحلة التنموية من العناكب التي يمكن استخدامها بسهولة مع الطرق السابقة يقتصر على الإناث الأكثر انتشارا والتي يسهل التعرف عليها الكبار ويحول دون الاستفادة من مراحل النمو الأخرى.
الخطوة الحاسمة الأولى نحو تحليل الإنتاجية العالية من النبات العنكبوت سوس التفاعل هو وضع بروتوكولات استنساخه وبسيطة وقوية لتحدي النباتات مع العناكب وموثوق تقييم نتائج التفاعل.
في هذا الفيديو، وسيلة فعالة لجمع سريعة وسهلة من الأسطوانات الكبيرةالبر من العث الإناث الكبار، موصوفة تطبيقها على المضيف محطة تجريبية، وتقييم الأضرار النباتية بسبب التغذية العنكبوت سوس. بروتوكول قدمت يتيح جمع سريعة وفعالة من مئات الأفراد في أي مرحلة التطوير (بيض، يرقات، الحوريات، الذكور البالغين، وإناث) التي يمكن استخدامها لتطبيق التجارب اللاحقة. بالإضافة إلى ذلك، هذه البروتوكولات يمكن تطبيقها على أي نبات المضيف سوس، ولكن أثبتت تحديدا في حالة A. thaliana.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
1. صيانة العنكبوت سوس السكان
ملاحظة: يتم تربيتها العث العنكبوت في كاليفورنيا الفاصوليا الحمراء (فاصيلوس الشائع).
2. جمع الكبار أنثى العث
3. مصنع الإصابة مع العث
ملاحظة: بمجرد أن تعافى العث الإناث البالغين، ويمكن استخدامها لغزو النبات. هناك 2 الأساليب المستخدمة لتصيب النباتات التجريبية مع العث الإناث الكبار: أ) باستخدام فرشاة غرامة (القسم بروتوكول 3.1) وب) باستخدام مضخة فراغ أو خط (القسم بروتوكول 3.2).
4. تسجيل وتقييم الأضرار النباتية
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
باستخدام 20-30 نباتات الفول المصابة، يمكن للمرء أن جمع حوالي 2،000 العث الكبار الإناث باستخدام المناخل. الوقت اللازم لتصيب النباتات مع 10 20 العث في النبات ما يقرب من 15 دقيقة في حالة استخدام فرشاة لنقل العث. وتظهر مجموعات من أساليب جمع والتطبيق في الشكل 2.
هذا البروتوكول يولد نتائج استنساخه من الضرر النبات، مما يدل على أن العث التي يتم جمعها من الحالة الفسيولوجية مماثلة ومناسبة للدراسات النبات ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
هذا الفيديو يوضح البروتوكولات المستخدمة لعزل وتصيب النباتات مع أعداد كبيرة من العث الإناث البالغات. على الرغم من أننا قدم هذا البروتوكول باستخدام A. thaliana، ويمكن استخدامها لأي النبات العنكبوت نظام التفاعل سوس ويجري حاليا تطبيقه بنجاح أيضا على نباتات الطماطم والعنب (كرمة العنب الاوروبي). غلة بروتوكول النتائج استنساخه، مشيرا إلى أن العث التي يتم جمعها من الحالة الفسيولوجية للمقارنة (الشكل 3).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم تمويل هذا المشروع من قبل حكومة كندا من خلال Genome Canada ومعهد أونتاريو لعلم الجينوم (OGI-046) ، وصندوق أونتاريو للأبحاث - القيادة العالمية في علم الجينوم وعلوم الحياة GL2-01-035 (إلى MG و V.G.). T.V.L. هو زميل ما بعد الدكتوراه في صندوق البحث العلمي فلاندرز (FWO).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| المواد النباتية: | |||
| الفاصوليا الحمراء في كاليفورنيا | ستوكس ، ثورولد ، أونتاريو ، كندا | عمرها أسبوعان ، موبوءة جيدا بعث العنكبوت قبل 2 أو 3 أيام من الاستخدام. يمكن استخدام أصناف أخرى من Phaseolus vulgaris< / em>. | |
| المواد الكيميائية: | |||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1٪ لتبسيط نقل |
| مياه | في درجة حرارة الغرفة ، تؤثر الصدمات الحرارية والباردة على معدل بقاء العث وأدائه | ||
| مواد ومعدات أخرى: | |||
| صينية | |||
| بلاستيكية مجموعة مقصات | |||
| 2 لتر أكواب | |||
| مناشف | |||
| مجموعات من المناخل | المصنعة في المنزل | تتوفر تعليمات مفصلة | |
| فرشاة | |||
| ماصات | |||
| أطراف | ماصة 0.2 و 1 مل | ||
| 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي | |||
| مضخة | مضخة من نوع حوض السمك مع تدفق الهواء المقلوب. يمكن استخدام خط الفراغ. انخفاض الضغط المطلوب هو حوالي 2-4 رطل لكل بوصة مربعة | ||
| ضوئي مجسم | |||
| Epson | V30 | أي ماسح ضوئي مسطح يسمح بالدرجة اللازمة من التحكم في جودة المسح. نستخدم Epson V30 لتجاربنا. | |
| الكمبيوتر | الذي يعمل بنظام Windows أو OS X PC المتوافق مع أجهزة الماسح الضوئي وبرامج Adobe Photoshop. | ||
| برنامج Adobe Photoshop | Adobe Systems Inc. ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | المختلفة | أي إصدار مع أداة Histogram المدرجة. |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.