يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير المباشر ل

15.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51756

⸱

يوليو 7, 2014

 ,  , 
1National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

هذا البروتوكول تفاصيل طريقة مبسطة تستخدم لإجراء التصوير الخلية الحية في سياق الدماغ اليرقات سليمة. النهج التصوير الخلية الحية لا تقدر بثمن لدراسة الخلايا الجذعية العصبية الانقسامات غير المتماثلة فضلا عن العمليات العصبية والتنموية الأخرى، كشف باستمرار الآليات التي تم تجاهلها سابقا.

الملخص

الخلايا الجذعية تقسيم غير متماثلة لتوليد خليتين ذرية غير متكافئة مع إمكانات مصير: الخلايا الجذعية تجديد الذات وخلية التفريق. نظرا أهميتها في التنمية والمرض، وفهم الآليات التي تحكم وكان انقسام الخلايا الجذعية غير المتماثلة منطقة قوية من الدراسة. لأنهم لين العريكة وراثيا والخضوع لجولات متتالية من الانقسام الخلوي عن مرة واحدة كل ساعة، والخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي ذبابة الفاكهة، أو neuroblasts، هي النماذج التي لا غنى عنها لدراسة انقسام الخلايا الجذعية. وتقع على بعد حوالي 100 الخلايا الجذعية العصبية بالقرب من سطح كل من اثنين من فصوص الدماغ اليرقات، مما يجعل هذا النظام نموذجا مفيدا بشكل خاص للدراسات المجهر التصوير الحي. في هذا العمل، نستعرض العديد من الأساليب المستخدمة على نطاق واسع لتصور انقسامات الخلايا الجذعية، ونتناول مزايا وعيوب تلك التقنيات التي توظف فصلها مقابل أنسجة الدماغ سليمة نسبيا. نحن أيضا لدينا simplif التفاصيلبروتوكول العبوات الناسفة المستخدمة لازدراع العقول كلها من يرقات العمر الثالث للتصوير الخلايا الحية والتطبيقات تحليل الثابتة.

المقدمة

الخلايا الجذعية الحفاظ على التوازن من التمايز والتجديد الذاتي لتوليد التنوع الخلوية خلال التنمية في وقت مبكر واستبدال الخلايا التالفة في أنسجة البالغين. تنظيم هذا التوازن يمنع كلا من الخسارة والتوسع المفرط للسكان الخلايا الجذعية، التي يمكن أن تؤدي إلى تدهور الأنسجة ضارة أو تكون الأورام.

Neuroblasts (مصلحة الدولة للاحصاء) هي الخلايا الجذعية العصبية درس على نطاق واسع للنظام العصبي المركزي ذبابة الفاكهة (الشكل 1A) أن النموذج الأول خلال المراحل الجنينية 1، 2. مصلحة الدولة للاحصاء الخضوع لدورات متكررة من انقسام الخلايا غير المتماثلة (ACD) لإنتاج خليتين الحظ غير متكافئ: الخلايا الجذعية تجديد الذات وخلية التفريق. ويسترشد ACD بواسطة centrosomes، والعضيات غير الغشائي التي تكون بمثابة مراكز أنيبيب-تنظيم معظم الخلايا 3. خلال الانقسام، NB centrosomes تنظيم وتوجيه الإنقسامية المغزل بين القطبين على طول القمي، القاعدية القطبيةمحور إيتي. على الانقسام لتقسيم NB، المحددات مصير قمية التي تحدد مصير الخلايا الجذعية، والمحددات التي تحدد مصير القاعدية التمايز، وفصل في الخلايا الوليدة غير متكافئة.

في الدماغ المركزي اليرقات، نوعين من مصلحة الدولة للاحصاء يمكن التمييز بين عددهم، والموقف، عامل النسخ التعبير، والنسب الخلية (الشكل 1A) و 4-6. النوع الأول مصلحة الدولة للاحصاء هي الأكثر وفرة، وحوالي 90 منهم ملء الجانبين الأمامي والخلفي من كل الفص البصري في الدماغ 7. هذه مصلحة الدولة للاحصاء التعبير عن عامل النسخ Asense (ASE)، ويتقاسمونها مميز في واحدة NB-تجديد الذات واحد أصغر خلية الأم العقدة (GMC؛ الشكل 1B). كل GMC يخضع لتقسيم محطة واحدة لتوليد الخلايا العصبية أو اثنين الدبقية (الشكل 1B). في المقابل، فإن مصلحة الدولة للاحصاء ثماني النوع الثاني التي تعيش في الجانب الخلفي من كل الفص البصري تفتقر عاصي التعبير 5. أنها تخضع ACDلإنتاج واحد NB-تجديد الذات واحدة السلف العصبية المتوسطة (الشرطة الوطنية العراقية).

الشرطة الوطنية العراقية، في المقابل، يقسم غير متماثلة 3-5 مرات. كل من هذه النتائج انقسامات في تجديد الشرطة الوطنية العراقية وإنتاج GMC واحدة 4. بشكل جماعي، وهوية NB محددة وترتيب الزمني للGMC الولادة يؤدي إلى تنوع مذهل من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي الكبار.

فهم بيولوجيا الخلايا التي ترتكز عليها NB ACD قد تحسنت إلى حد كبير من خلال استخدام تقنيات التصوير الخلية الحية. نشرت البروتوكولات المستخدمة من قبل الباحثين لمصلحة الدولة للاحصاء الصورة الحية تختلف على نطاق واسع. عموما، ومع ذلك، يمكن تجميع هذه الأساليب إلى فئتين عامة تتميز ما إذا كان غادر الدماغ سليمة اليرقات أو ميكانيكيا فصلها. كل التقنيات لها مزايا وعيوب متميزة اعتمادا على التطبيق الباحث.

تقارير مبكرة الكشف عن خلية الحية DIVI NBتنطوي بعض التوترات درجة التفكك دليل من الدماغ اليرقات. هذه البروتوكولات التفاصيل تلطيخ 8 أو 9 وبصرف النظر إغاظة الدماغ من أجل أن تنمو الثقافات الأولية على المدى القصير من مصلحة الدولة للاحصاء على coverslips الزجاج. لتحسين التصوير، وعادة ما تكون بالارض مصلحة الدولة للاحصاء مستديرة حول لل coverslips مع أي من الشرائح الزجاجية 8 أو 9 منصات الاغاروز. على الرغم من أن الخلايا بالارض تحسنت البصريات، وهذه التقنيات غالبا ما تؤدي إلى عيوب الإنقسامية NB، بما في ذلك الانحدار من ثلم الانقسام وعدم القدرة على تقسيم أكثر من مرة واحدة. لذلك، عادة ما تكون مناسبة البروتوكولات التي تشمل كلا من التفكك دليل والتشويه الجسدي من أنسجة المخ اليرقات فقط للغاية على المدى القصير (أي.، ودورة خلية واحدة أو أقل) التطبيقات. وبالمثل، وشبه السحق أو تسطيح العقول سليمة تماما بين الشرائح الزجاجية وcoverslips يحد من مرة واحدة قد تنفق التصوير عينة تعطى لفترة حوالي 30 دقيقة 10. على الرغم من هذا القيد، ثيتم استخدام النهج بنجاح ق 11-14.

الجهود التي بذلت مؤخرا لصورة حية فصلها مصلحة الدولة للاحصاء حد التشويه الجسدي من الخلايا المعزولة. هذه التقنيات هي مفيدة بشكل خاص للتطبيقات حيث أنه من الضروري للحفاظ على مزارع الخلايا لدورات انقسام الخلايا متعددة. على سبيل المثال، خلايا متناثرة من العقول فصلها يدويا قد تكون جزءا لا يتجزأ جزئيا في جلطة مصنوعة من خليط من الفيبرينوجين وثرومبين 15 للتصوير على المدى الطويل 16. بدلا من ذلك، قد تكون العقول explanted أول فصل كيميائيا مع كولاجيناز الانزيم، بجانب تعطل يدويا عن طريق مرور المتكررة من خلال طرف الماصة، ومطلي لاحقا على أطباق أسفل بولي-L-يسين المغلفة الزجاج 17 و 18. طلاء الزجاج مع الأطباق إما الفيبرينوجين أو بولي-L-يسين يعزز المرفق وطفيفة انتشار الخلايا المستديرة، تقديمهم أقرب إلى ساترة ممكن دون تحريف المادية الكبرى. في additiعلى، وهذه الأساليب تشمل زراعة مصلحة الدولة للاحصاء في المتوسطة التي قد يتم تبادلها بسهولة لتجارب اضطراب الدوائية 18. عموما، والطلاء مباشرة فرقت مصلحة الدولة للاحصاء يحسن البصريات التصوير دون التضحية قدرات التصوير على المدى الطويل. في الآونة الأخيرة، وبروتوكول اصفا زراعة على المدى الطويل من مصلحة الدولة للاحصاء تم فصلها تفصيلا 19.

ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يخلو من حدوده. وهناك العديد من المحاذير لمصلحة الدولة للاحصاء التصوير فصلها الحية. في مجال خلايا متناثرة، على سبيل المثال، فإنه من الصعب تحديد الأنساب NB محددة مكانيا التي يتم تنظيمها في الدماغ سليمة 1. وبالمثل، التمييز بين النوع الأول النوع الثاني مقابل مصلحة الدولة للاحصاء داخل الأنسجة فصلها هو أيضا تحديا دون التعبير عن استشفاف النسب أو الجينات المحورة سلالة محددة، مثل worniu-GAL4، asense-GAL80 20. على الرغم من أن هذه الجينات المحورة هي مفيدة جدا لبعض التطبيقات، فإنها لا تحد من الباحثين من تلك الجينات المحورة السابقينضغطت تحت سيطرة العنصر UAS محسن 21 وتتطلب خطط الجينية أكثر تعقيدا. الدراسات التي تهم التنمية المكانية أو الزمانية من مصلحة الدولة للاحصاء، وبالتالي، يتطلب التصوير في الجسم الحي في سياق الأنسجة سليمة.

علاوة على ذلك، من مصلحة الدولة للاحصاء الدراسات الجنينية فصلها تشير إلى أن الاتصال الجسدي من الخلايا المجاورة هو أمر حاسم لتوطين البيني من الأقطاب الرئيسية محددات 22، 23. تظهر هذه الدراسات معزولة تماما مصلحة الدولة للاحصاء لم يعد الحفاظ على محور المغزل الإنقسامية ثابتة. بدلا من ذلك، وعرض هذه الخلايا محور المغزل أكثر عشوائية وزوايا واسعة من الفصل بين براعم GMC المتعاقبة، وربما يرجع ذلك إلى فقدان قمية المواقع الجسيم المركزي 22. على الرغم من أن العلاقة بين مصلحة الدولة للاحصاء اليرقات والخلايا المجاورة لها لم تدرس على نطاق واسع، فإنه يجدر النظر أن اليرقات المكروية الخلايا الجذعية قد تؤثر على قطبية الخلية أو غيرهاالسلوكيات. للحفاظ على السياق الفسيولوجية للاليرقات مصلحة الدولة للاحصاء، ونحن ACD صورة من العقول كلها.

بالنظر إلى القيود المتأصلة المرتبطة التصوير فصلها مصلحة الدولة للاحصاء، وضعت لدينا مختبر وغيرها بروتوكولات لصورة جولات متعاقبة من NB ACD من العقول اليرقات كله. تقنيات لصورة أدمغة سليمة في كثير من الأحيان استبدال سطح جامدة من الزجاج على جانب واحد من الغرفة الثقافة مع غشاء مرن لمنع تشويه الأنسجة أو ضرر والسماح لتبادل الغازات. تنطوي على بعض الأساليب تصاعد العقول explanted في خليط من الحشرات متوسطة زراعة، ومصل، وحمض الأسكوربيك مع الهيئات الدهون معزولة عن اليرقات عشرة 24. تضاف الهيئات الدهون معزولة لأنها تفرز mitogen المعروف لتحفيز انقسام الخلايا NB 25. هذا البروتوكول يحافظ على سلامة الأنسجة لأكثر من 3 ساعة، وبالتالي، قابلة للتصوير طويلة الأجل 24، 26-28. في الآونة الأخيرة، وبروتوكول يصف خط الطولالتصوير ز الأجل من أدمغة يرقات سليمة في وجود حمض الأسكوربيك، ومصل، والهيئات الدهون وردت تفاصيلها 29. الأهم من ذلك، لأن الأنسجة لا يتم كشفها ولا يجمد، وهذا النهج هو أقل فائدة للتطبيقات حيث يتم تبادل زراعة المتوسطة (على سبيل المثال، ودراسات المخدرات، immunodepletion، الخ).

لدينا مختبر وتبسيط إعداد جبل كامل من العقول اليرقات الحية للتصوير طويلة الأجل 30، 31. والميزة الرئيسية لبروتوكول لدينا مقارنة مع الآخرين هو بساطته: ملاحظاتنا تشير لا مصل، حمض الأسكوربيك، الانسولين، ولا الأجسام الدهنية المضافة هي ضرورية لصورة جولات متعاقبة من NB ACD. على الرغم من أن المواد المضافة، مثل الانسولين، وكانت مفيدة للتصوير لفترات طويلة من الانقسامات الخلايا الجذعية والهجرة الجماعية 32 خلية في المبايض ذبابة الفاكهة 33، ويبدو أن الاستغناء عن NB ACD، كما يتكون لدينا المتوسطة التصوير من خليط بسيط من ستاndard الحشرات المتوسطة زراعة الخلايا تستكمل مع مضاد فطري للمضادات الحيوية لمنع التلوث. من خلال استخدام الأطباق ثقافة أسفل الغاز قابلة للاختراق أو الزجاج قابلة لإعادة الاستخدام، وكنا قادرين على الحفاظ على عدة جولات من المتعاقبة NB ACDs. يمكن بسهولة العينات explanted نفسه استخدامها لالمناعي وغيرها من الإجراءات مع الأنسجة الثابتة. في هذا البروتوكول، ونحن من التفصيل تشريح أدمغة يرقات سليمة، فضلا عن إعداد العقول لتحليل كل من الحية والثابتة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد المواد المطلوبة لازدراع الأمخاخ الثالث الطور اليرقات

  1. وتعد الأدوات اللازمة لتسليخ مجهري.
    1. إقامة أداتين تشريح (مشرط وهوك) عن طريق وضع دبوس تشريح أول واحد في كل حامل دبوس. تأمين المسامير بإحكام باليد أو مع كماشة (الشكل 1C).
    2. استخدام زوج من ملقط القديمة لثني واحد دبوس تشريح إلى حوالي 120 درجة زاوية. القيام بذلك تحت المجهر تشريح للتأكد من أن النصف العلوي من دبوس شقة تقع عند عقد حامل دبوس في متناول اليد. وسوف تستخدم هذه الأداة كما مشرط لعقد لأسفل أو شريحة من خلال الأنسجة.
    3. استخدام زوج من ملقط القديمة لثني دبوس الثانية في هوك التي سيتم استخدامها لعقد وكشط بعيدا الأنسجة.
    4. تغطية كل أداة تشريح مع طرف ماصة لحماية الأدوات من التلف. مع الرعاية، ويمكن استخدام الأدوات بشكل جيد للتشريح إلى أجل غير مسمى. استبدال دبابيس التالفة أو المشوهة عند الضرورة.
  2. إعداد تشريح المتوسطة.
    1. في نسيج الثقافة هود، وتمييع تكملة للمضادات الحيوية مضاد فطري في شنايدر زراعة المتوسطة. دوامة وسائل الإعلام لدمج الملحق.
    2. إعداد عدة 5 مل aliquots من وسائل الإعلام تستكمل. تخزين جميع وسائل الإعلام في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
    3. تدفئة قسامة 5 مل من المتوسط ​​تستكمل إلى درجة حرارة الغرفة. رسم المتوسطة إلى 5 مل حقنة معقمة وعقيمة المسمار على 0.2 ميكرون تصفية حقنة.
  3. حدد اليرقات للتشريح. استخدام مسبار تشريح لتحديد يزحفون الثالث يرقات العمر الدماغ كما ستكون اسهل لتشريح. اختياري: إيداع اليرقات على لوحة آغار العنب.
    ملاحظة: عدم استخدام قوارير مزدحمة أكثر من اللازم أو زجاجات مع "الغذاء الرطب"، وهذه تميل إلى القوة الثانية أو الأولى يرقات العمر إلى الزحف للخروج قبل الأوان.
    ملاحظة: بعض الخلفيات الوراثية يستلزم استخدام يرقات الأصغر سنا. هذا لا يؤثر على البروتوكول، ولكن لا تجعل دissection أكثر صعوبة.

2. تشريح الجهاز العصبي المركزي

  1. على شريحة زجاجية واحدة، وخلق اثنين من 50 مل من وسائل الإعلام حمامات دافئة تشريح مفصولة حوالي 3 سم. وسوف تستخدم تجمع واحد للتشريح الإجمالي والأخرى المستخدمة للتشريح غرامة (الشكل 1C).
  2. نقل العديد من اليرقات إلى واحدة من قطرات سائل الإعلام.
  3. نقل ساترة مع اليرقات إلى مجهر تشريح. التكبير في بركة تحتوي على يرقات بحيث نهايات الأمامي والخلفي من اليرقات يمكن تمييز.
  4. استخدام أزواج من ملقط لفهم منتصف المنطقة من يرقة واحدة. أخذ الزوج الثاني من ملقط في اليد الأخرى وفهم يرقة بالقرب من نفس المنطقة. سحب اثنين من أزواج من ملقط بصرف النظر المسيل للدموع بلطف اليرقة في النصف. تكرار اثنين من الخطوات المذكورة أعلاه لجميع اليرقات على ساترة.
  5. التخلص من نصفين الخلفي من الجسم اليرقات قبل نقلهم إلى الأنسجة.
  6. التكبير في يرقة بحيث الmouthhooks الأمامي الإلكترونية هي واضحة للعيان. استخدام كل من أزواج من ملقط لخلق شق صغير، أو الدرجة الأولى، على طرفي نقيض من mouthhooks اليرقات بين الصدر الثالث والأول العصابات سنينة الأمامي.
  7. فهم mouthhooks مع ملقط في يد غير المهيمنة. استخدام ملقط في اليد الأخرى لقشر بلطف بعيدا بشرة في اتجاه الأمامي إلى الخلفي. تواصل قشر ببطء بعيدا بشرة حتى يتعرض الجهاز العصبي المركزي.
  8. عزل الجهاز العصبي المركزي عن باقي اليرقة التي تمزق الأنسجة مع ملقط. توخي الحذر عدم تعكير صفو النظام العصبي المركزي.
    خطوة حاسمة: لا الساحبة على الجهاز العصبي المركزي! تجاهل العينات التالفة مع تمزق الحبل البطني العصب (الشكل 2A) أو الفصوص البصرية المشوهة (أرقام 2B 2B و').
  9. تكرار اثنين من الخطوات المذكورة أعلاه لجميع اليرقات على ساترة. نقل الأنسجة explanted صحية للالثاني (نظيفة) مجموعة من المتوسطة على ساترة للمرحلة تشريح غرامة.
  10. استخدام أدوات تشريح دبوس لازالة الأنسجة الطرفية (على سبيل المثال، العين، الجناح، والساق أسطوانة) من الدماغ. حرك مشرط بين مطلوبة (الدماغ) والأنسجة غير المرغوب فيها، تعلق في النسيج الضام إلى ساترة. استخدام الخطاف لندف بلطف بعيدا الأنسجة غير المرغوب فيها أثناء الضغط في وقت واحد مشرط لساترة في حركات مثل المنشار.
  11. خطوة حاسمة: العمل ببطء وروية لإزالة كافة الأقراص من كل الدماغ. توخي الحذر عدم تعكير صفو التشكل الدماغ. والدماغ السليم لها الحبل البطني العصب سليمة ومتماثل، الفصوص البصرية الجولة (الشكل 2C).

3. تصاعد الأمخاخ Explanted للتصوير مباشر

  1. عكس صحن الثقافة الغاز نفاذية 50 مم مع الفيلم واضحة مواجهة (الشكل 2D). كساد حقنة لإيداع قطرة صغيرة (حوالي 30 ميكرولتر) من المتوسط ​​على رانه وسط الطبق.
  2. نقل أدمغة معزولة، واحدة في كل مرة، إلى تراجع المتوسط ​​على الطبق. استخدام أداة ربط لتلقط الدماغ تحت الفص البصري. بدلا من ذلك، استخدام ملقط لفهم محاور إسقاط من الحبل البطني العصب.
  3. جمع 5-10 العقول في قطرة من المتوسط. سوف يغرق أدمغة باستخدام أدوات تشريح أدمغة دبوس لدفع الفرد إلى أسفل قطرة من المتوسطة وكثير منهم محاصرين في الغضروف المفصلي (الشكل 2E).
  4. توجيه العقول باستخدام أدوات تشريح دبوس لمحاذاة العقول تبعا لمصلحة الدولة للاحصاء ليمكن تصوير (الشكل 3A). لصورة مصلحة الدولة للاحصاء الظهرية، ووضع الحبل البطني العصب أسفل (على طول الغشاء). لصورة مصلحة الدولة للاحصاء-anterio بطني، ضع أدمغة مع الحبل البطني العصب تواجه التصاعدي (بعيدا عن غشاء). محاذاة العقول بحيث كل الحبال البطني العصب تشير في نفس الاتجاه داخل الطائرة س ص.
  5. استخدام حقنة أو نقل البلاستيك عipette لوضع 4 الهالوكربون (HC) قطرات النفط (حوالي 30 ميكرولتر لكل منهما) على الغشاء نفاذية الغاز. يجب أن يكون حجم كل قطرة من النفط تعادل بعضها البعض، وإلى تراجع المتوسط. الفضاء قطرات من الزيت لتتوافق مع أربع زوايا ساترة تتمحور حول تراجع زراعة المتوسطة. كاملة مرة واحدة، فإن قطرات خمسة (أربعة قطرات من زيت وقطرة واحدة من المتوسطة في الوسط) تشبه أوجه خمسة على النمط الغربي الزهر (الشكل 3B).
  6. خفض و# 1.5 مم 22 ساترة على التجميع بحيث يضرب جميع قطرات 5 في نفس الوقت. الحفاظ على الضغط حتى عبر عينات يقلل من احتمال أنها سوف تتعطل. انتظر حوالي 3 دقائق كما النفط والمتوسطة تفريق تحت وطأة ساترة. وهناك شكل مثل وسائل الإعلام عبر تشكيل (أرقام 3C و 3D).
  7. خطوة حاسمة: اخفض ساترة على سطح العقول عن طريق إزالة وسائل الاعلام الزائد باستخدام ورقة الفتيل الأنسجة (فيقوإعادة 3C). تفعل هذا في حين يراقب العينة تحت نطاق تشريح. كما تتم إزالة وسائل الإعلام، فإن خفض ساترة. توقف مرة واحدة ساترة تلامس العقول. لا الإفراط في الفتيل وهذا سوف يسبب تشويه نسيج الدماغ أو انفجارات.
  8. إذا الظهرية التصوير مصلحة الدولة للاحصاء (الشكل 3E)، والانتقال إلى الخطوة 3.9. إذا التصوير anterio بطني مصلحة الدولة للاحصاء، يجب أن يتم نقل ساترة قليلا (عن طريق بايعاز بلطف مع ملقط) في الاتجاه من النصائح الحبل البطني العصب. هذا يتسبب في الدماغ لتدوير، والذي يجلب فصوص المخ على اتصال مباشر مع ساترة لتسهيل التصوير (الشكل 3F).
  9. ختم الغرفة من خلال تطويق ساترة مع كميات صغيرة من النفط الهالوكربون (الشكل 3D). فائض المعروض النفطي من ناز ساترة ينبغي التقليل ونشف بعيدا مع الأنسجة.

4. تصوير لايف وسط الدماغ Neuroblasts

ملاحظة: للحصول على هذا العمل، الغزل القرص نيكون الكسوف تيتم استخدام المجهر متحد البؤر (المجهر المقلوب) للتصوير حي؛ تفاصيل الإعداد لدينا وقد نشرت سابقا 31. بدلا من ذلك، يمكن تصوير العينة باستخدام نظام تستقيم.

  1. إضافة قطرة من زيت الغمر إلى ساترة فقط فوق العقول التي شنت. وهذا سوف يساعد توسيط الهدف مباشرة فوق العينة.
  2. خطوة حاسمة: الحفاظ على العقول في درجة حرارة ثابتة من 25 درجة مئوية مع حاضنة المرحلة. وضع بلطف العينة التي شنت في حاضنة المرحلة، وتغطي الغرفة مع غطائه.
  3. تحديد مصلحة الدولة للاحصاء المركزي الدماغ باستخدام الضوء تنتقل من خلال التركيز على الخلايا الجولة الكبيرة التي تتواجد في المناطق الوسطى وسطي من الفص البصري؛ لا تستخدم برنامج التحصين الموسع ومضان. هذا يصبح أسهل مع الممارسة. من المهم جدا لفضح عينة لأقل قدر من ضوء ممكن. لا تضيعوا الوقت أدمغة التصوير التي تضررت.
  4. مرة واحدة في المكان، واتخاذ التعرض سريعة باستخدام متحد البؤر لتحديد الموقع المناسب والعمق. الحد من عمق ميكرومتر إلى 10-15 الأولى. ضبط حسب الحاجة، وتأخذ صورة اختبار آخر.
    1. خطوة اختيارية: جمع فيلم الاختبار من الحبل البطني العصب لضمان عدم وجود الانجراف س ص. إذا تم الكشف عن الانحراف، الانتظار 15-30 دقيقة للعينة لتسوية. إذا لم يستقر الانجراف في 30 دقيقة، وإعداد نموذج جديد. يمكن عادة الانجراف كبرى أن ترجع إلى إضافة الزيت الزائد، أو حجم غير متساوية من زيت قطرات أثناء التركيب.
  5. للقضاء على الانحراف المحوري (ض العائمة) استخدام جهاز التلقائي المستمر التركيز يستخدم الصمام بالأشعة تحت الحمراء. بدلا من ذلك، يدويا تصحيح البؤري.
  6. مرة واحدة يتم تحديد NB من الفائدة، والمضي قدما مع نظام التصوير. كما هو الحال مع جميع التصوير الخلية الحية، وكمية من ضوء الليزر، وقت التعرض، وكاميرا binning، التكبير الهدف، الوقت و / أو ض خطوة فاصلة ويجب علينا جميعا أن يكون الأمثل تجريبيا لإجراء تجربة معينة للإجابة على السؤال في متناول اليد. الهدف هو تقليل السد ضوءفي حين لا يزال في سن جمع بيانات مفيدة. انظر المناقشة لإرشادات إضافية.
    1. صورة وحدة التخزين بالكامل من خلال جمع NB 12-14 الصور متباعدة من قبل 1 ميكرون في محور ض. ضبط دقة الوقت لالتقاط دورات خلية واحدة أو متعددة من نفس NB. كمبدأ توجيهي عام، استخدم 10-30 ثانية لفترات واحد التصوير دورة الخلية و1-3 دقيقة فترات لدورات متعددة الخلايا.
  7. خطوة حاسمة: تأكد من أن العينة هو صحي عن طريق رصد مدة الانقسام. إذا الانقسام يحتاج إلى أكثر من 15 دقيقة، والانتقال إلى الدماغ أخرى. والدماغ السليم تظهر العديد من مصلحة الدولة للاحصاء في نفس مجال الرؤية تمر عدة جولات من الانقسام. لاحظ أن كل دورة الخلية أطول من سابقتها قليلا بسبب وقوع اضرار طفيفة.
  8. مرة واحدة التصوير اكتمال تفكيك غرفة الحضانة، وتجاهل كل شيء ولكن الأطباق زراعة الغاز نفاذية. شطف سطح الطبق الثقافة مع الايثانول 95٪ والقضاء جيدا بمنديل. كرر مرتين أخريين.

5. إعداد العقل للالمناعي

  1. جمع 20 أو أكثر explanted العقول في أنبوب 1.5 مل تحتوي على ما يقرب من 0.2 مل من المتوسط ​​تستكمل.
  2. إزالة المتوسطة من أنبوب وشطف أدمغة مرة واحدة مع 0.5 مل PBSTx (الفوسفات مخزنة المالحة، PBS، مع 0.3٪ تريتون X-100). دعونا العقول تستقر في قاع الأنبوب بين كل تبادل السائل. يتم استخدام تريتون X-100 المنظفات لpermeabilize الأنسجة. الشطف وعادة ما يستغرق أقل من 30 ثانية؛ ببساطة إزالة PBSTx مرة واحدة وقد استقر العقول إلى أسفل الأنبوب.
  3. استبدال الحل مع 0.5 مل من 9٪ الإلكترون المجهري الصف بارافورمالدهيد مخففة في PBSTx. احتضان مع الإيماءة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. التخلص من تثبيتي وفقا للوائح النفايات الخطرة.
  5. غسل العينات مع 0.5 مل PBSTx لمدة 15 دقيقة. كرر الخطوة غسل مع PBSTx الطازجة مرتين أخريين.
  6. استبدال الحل مع 0.5 مل PBT (PBS، 1 ٪ الأبقار مصل الزلال (BSA)، و 0.1٪ توين 20). احتضان مع الإيماءة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. هذه الخطوة كتل الربط غير محدد من الأجسام المضادة للأنسجة.
  7. استبدال الحل مع 0.5 مل الأجسام المضادة الأولية مخففة في PBT تستكمل مع 4٪ مصل الماعز العادي (خ ع). احتضان مع الإيماءة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  8. تجاهل أو حفظ الأجسام المضادة الأولية مخففة.
  9. غسل العينات مع 0.5 مل PBT لمدة 15 دقيقة. كرر الخطوة غسل مع PBT الطازجة مرتين أخريين.
  10. استبدال الحل مع 0.5 مل من تعديل PBT (PBS، 2٪ BSA، 0.1٪ توين 20، و 4٪ خ ع). احتضان مع الإيماءة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  11. استبدال الحل مع 0.5 مل المخفف الضد الثانوية في PBT المعدلة. احتضان مع الإيماءة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  12. استبدال الحل مع 0.5 مل PBST (PBS مع 0.1٪ توين 20). احتضان مع الإيماءة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر الخطوة غسل مع PBST الطازجة مرتين أخريين.

"jove_title"> 6. تصاعد عينات للالمناعي

  1. نقل بعناية عينات بمثابة قطرة على شريحة زجاجية، وتقييد هبوط نحو يسار وسط الشريحة.
  2. إضافة إلى انخفاض كبير (حوالي 2 سم في القطر) من تصاعد المتوسطة (على سبيل المثال، Aqua-Poly/Mount) إلى وسط الشريحة. تجنب تجمع من PBST التي هي نحو اليسار.
  3. استخدام ملقط لنقل أدمغة من تجمع إلى تجمع PBST من تصاعد المتوسطة. مضيفا تصاعد المتوسطة مباشرة على الجزء العلوي من العقول قد يعطل ميولهم ويجب تجنبها.
  4. تحت المجهر الخفيفة، وترتيب العينات في المتوسطة المتزايدة مع الجانب الذي سيتم تصويره مواجهة.
  5. مع الشريحة تحت المجهر الضوئي، وانخفاض ببطء الزجاج ساترة # 1.5 على أعلى من العينات. خطوة اختيارية: طرد فقاعات الهواء طفيفة عن طريق دفع برفق على ساترة.
  6. تسمح المتوسطة المتزايدة للبلمرة لعدة ساعات، أو بين عشية وضحاها، من خلال الكذب الشرائح المسطحة، وخفيفةالمحمية في درجة حرارة الغرفة.
  7. الشرائح ويمكن تصويرها في اليوم التالي، أو تخزينها قبل التصوير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد أوضحت التصوير الحي عددا من الآليات التي تنظم NB ACD. قبل الحصول على الصور، فمن الضروري لتحديد ظروف التصوير المثلى. فمن الضروري لتحقيق التوازن في معدل التقاط الإطار مع مدة التصوير الخلية الحية. لتحليل الخلوية الجميلة، على سبيل المثال، زيادة الزمانية وربما تكون هناك حاجة القرار البصرية. عندما تصور دورة الخلية NB واحد (الشكل 4A)، ويمكن زيادة المعدل الذي يتم التقاط الصور دون إدخال photodamage. عادة، يمكن رصد الأحداث انقسام الخلايا واحد في حوالي 10-30 فترات زمنية ث...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

التصوير الخلية الحية هو نهج لا تقدر بثمن تستخدم لدراسة الآليات التي تنظم ACD من الخلايا الجذعية، وتمايز الخلايا الأنساب، والتشكل من أنسجة معقدة. على الرغم من أن المجموعات البحثية قد استخدمت تاريخيا مجموعة متنوعة من التقنيات لتصور NB ACD، هذه النهج يمكن تصنيفها بصفة عامة إلى فئتين التي تختلف في المقام الأول فيما يتعلق ما إذا كان يتم ترك أنسجة المخ سليمة أو فصلها.

فصل التصوير مصلحة الدولة للاحصاء مزاياه. لأحد، وفصل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل قسم الأبحاث جماعية في المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI (1ZIAHL006126) والطبية الحيوية زمالة ما بعد الدكتوراه Lenfant منحت لDAL.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق زراعة الأنسجة Lumox 50 × 12 ممSarstedt94.6077.410طبق ثقافة قابل لإعادة الاستخدام مع قاعدة فيلم شفافة بصريا ونفاذة للغاز.
شنايدر S2 متوسطInvitrogen21720-024
Gibco Antibiotic-Antimicotic (100x)Invitrogen15240-062مكمل يحتوي على البنسلين (10,000 U / ml) ، ستربتومايسين (10,000 &# 956; جم / مل) ، والأمفوتريسين ب (25 &# 956 ؛ g / ml) التي تضاف إلى وسائط S2 الخاصة ب Schneider لمنع التلوث البكتيري والفطري.
أغطية زجاجية ، # 1.5 22 × 22 ممفيشر ساينتفيك12-541-B
زيت هالوكربون 700سيجما-ألدريتشH8898زيت خامل عالي اللزوجة واضح وعديم اللون.
زوج من حاملات الدبوس المطلية بالنيكل ، بطول 17 سمأدوات العلوم الدقيقة26018-17
زوج من Dumont # 5 FulpsFine ScienceTools 11252-20
إبرة / مسبار بمقبض بلاستيكيمرشح حقنة فيشر Scientific08-965-A
، 0.22 & # 956 ؛ م حجم المسامفيشر Scientific09-719A
حقنة ، 5 ملBD Biosciences309646
ماصة نقل البلاستيكفيشر ScientificS30467-1
بارافورمالدهيد ، 32٪المجهر الإلكترونيEM 15714تنبيه: الفورمالديهايد سام ؛ يجب التعامل معه في غطاء الدخان. اتبع إرشادات MSDS للتعامل الآمن.
DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole ، dihydrochloride)InvitrogenD1306صبغة تصنف الحمض النووي وتثيرها الأشعة فوق البنفسجية.
تشريح علوم من الدرجة

المراجع

  1. Truman, J. W., Bate, M. Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).
  2. Doe, C. Q. Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system. Development. 116, 855-863 (1992).
  3. Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate. Chromosome research. 21, 271-286 (2013).
  4. Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development. Neural development. 3, 5 (2008).
  5. Bowman, S. K., et al. The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila. Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).
  6. Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).
  7. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  8. Savoian, M. S., Rieder, C. L. Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts. Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).
  9. Fleming, S. L., Rieder, C. L. Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro. Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).
  10. Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex. Current biology. 15, 856-861 (2005).
  11. Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
  12. Lucas, E. P., Raff, J. W. Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin. J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).
  13. Basto, R., et al. Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies. Cell. 133, 1032-1042 (2008).
  14. Conduit, P. T., Raff, J. W. Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).
  15. Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome research. 6, 533-549 (1998).
  16. Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).
  17. Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat. Commun. 2, 243 (2011).
  18. Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).
  19. Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages. PLoS One. 8, (2013).
  20. Neumuller, R. A., et al. Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi. Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).
  21. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  22. Siegrist, S. E., Doe, C. Q. Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts. Development. 133, 529-536 (2006).
  23. Broadus, J., Doe, C. Q. Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).
  24. Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).
  25. Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
  26. Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).
  27. Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).
  28. Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).
  29. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).
  30. Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting. J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).
  31. Lerit, D. A., Rusan, N. M. PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells. J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).
  32. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
  33. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
  34. Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).
  35. Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis. J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).
  36. Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication. Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).
  37. Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila. Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).
  38. Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares. J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الأرومات العصبية في ذبابة الفاكهة (Drosophila)انقسام الخلايا الجذعيةالمجهر البؤريتشريح الدماغالانقسام غير المتماثلالتثبيت الكامل للعينةالتصوير على المحور زد (Z-axis)التصوير بفاصل زمنيطبق نفاذ للغازات
التصوير المباشر ل
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.