مقالة منهجية

النمذجة الخلايا النجمية إمراض في المختبر و في فيفو استخدام القشرية النجمية أو الخلايا الجذعية العصبية من الشرطي، الفئران المهندسة وراثيا

DOI:

10.3791/51763

⸱

أغسطس 12, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
يمكن استخدام

الخلايا النجمية من النوع البري الظاهري والخلايا الجذعية العصبية التي تم حصادها من الفئران المصممة باستخدام أليلات مسرطنة مشروطة ومحولة عن طريق إعادة التركيب الفيروسي بوساطة Cre لنمذجة التسبب في الورم النجمي في المختبر وفي الجسم الحي عن طريق الحقن التقويمي للخلايا المحولة في أدمغة زملاء القمامة المتخصصين في المناعة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نماذج الورم النجمي الحالية محدودة في قدرتها على تحديد أدوار الطفرات المسرطنة في أنواع معينة من خلايا الدماغ أثناء التسبب في المرض وفائدتها في تطوير الأدوية قبل السريرية. من أجل تصميم نظام نموذجي أفضل لهذه التطبيقات ، تم حصاد الخلايا النجمية القشرية من النوع البري الظاهري والخلايا الجذعية العصبية (NSC) من الفئران المشروطة المعدلة وراثيا (GEM) التي تؤوي مجموعات مختلفة من الأليلات المسرطنة المتلطخة وزراعتها في الثقافة. تم تحفيز إعادة التركيب الجيني في المختبر باستخدام إعادة التركيب بوساطة Cre ، مما أدى إلى التعبير عن الجينات المسرطنة المتحولة وحذف الجينات الكابتة للورم. تم تحديد العواقب المظهرية لهذه الطفرات من خلال قياس الانتشار والتحول والاستجابة للأدوية في المختبر. تم تطوير نماذج الطعم الخيفي لتقويم العظام ، حيث يتم حقن الخلايا المحولة بشكل تجسيمي في أدمغة زملاء القمامة المؤهلين في المناعة ، لتحديد دور الطفرات المسرطنة ونوع الخلية في تكوين الأورام في الجسم الحي. على عكس معظم الطعوم الخلابة لخط خلايا الورم الأرومي الدبقي البشري الراسخة ، فإن حقن الخلايا النجمية القشرية المحولة المشتقة من GEM في أدمغة زملاء القمامة المؤهلين في المناعة أنتج أورام نجمية ، بما في ذلك النوع الفرعي الأكثر عدوانية ، الورم الأرومي الدبقي ، الذي لخص السمات المميزة النسيجية المرضية للأورام النجمية البشرية ، بما في ذلك الغزو المنتشر لحمة الدماغ الطبيعية. تم استخدام التصوير الخيفي الحيوي للطعوم الخيفية من الخلايا النجمية المحولة المصممة للتعبير عن اللوسيفيراز لمراقبة نمو الورم في الجسم الحي بمرور الوقت. وبالتالي ، فإن نماذج الورم النجمي باستخدام الخلايا النجمية و NSC التي يتم حصادها من GEM مع الأليلات السرطانية المشروطة توفر نظاما متكاملا لدراسة علم الوراثة وبيولوجيا الخلية للتسبب في الورم النجمي في المختبر وفي الجسم الحي وقد تكون مفيدة في تطوير الأدوية قبل السريرية لهذه الأمراض المدمرة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrocytomas هي ورم في المخ الأولية الأكثر شيوعا وورم أرومي دبقي (GBM)، والصف الرابع نجمي، هو النوع الفرعي الأكثر شيوعا وعدوانية مع بقاء متوسط ​​من 12-15 شهرا 1،2. غزو ​​astrocytomas منتشر، خاصة GBM، يحول دون الاستئصال الجراحي الكامل، ويحد من فعالية العلاجات المساعدة، وحتما يؤدي إلى تكرار بعد العلاج 3. المرضى في البداية الحالي إما مع دي نوفو (الابتدائي) GBM أو مع انخفاض astrocytomas الدرجة التي يتقدم حتما إلى (الثانوي) GBM 4. GBM هو غير متجانس genomically وتميزت الطفرات يستبعد بعضها بعضا وتحدث المشارك في الجينات التي تتحكم في مسارات الإشارات الأساسية الثلاثة: مجموعة 1 / S (الميزانية العادية) حاجز دورة الخلية، مستقبلات التيروزين كيناز (RTK)، وTP53 مسالك 5-7. يتكون من أربعة أنواع فرعية GBM الجينومية مع ملامح التعبير المتميزة التي تشبه أنواع مختلفة من الخلايا في الدماغ، مما يشير إلى أن GBM هو نوع فرعي influالوسن بواسطة خلية منشئه 6،8،9. مطلوبة نماذج نجمي أفضل لتحديد دور مجموعات محددة من الطفرات في أنواع خلية معينة خلال نجمي المرضية. والاستفادة من هذه النماذج لأكثر كفاءة تطوير العقاقير قبل السريرية تساعد في نهاية المطاف تحسين نتائج المرضى. وتشمل النماذج الحالية نجمي إنشاء خطوط الخلايا البشرية، المريض المستمدة xenografts (PDX)، المعدلة وراثيا الخلايا النجمية الإنسان الطبيعية والخلايا الجذعية العصبية (NSC)، والفئران المعدلة وراثيا (GEM) 10-14. طورنا بديلا، GEM غير الجرثومية (nGEM) نموذج 15 باستخدام خلايا الدماغ الأساسية - الخلايا النجمية القشرية وNSC - تحصد من GEM بإيواء مجموعات مختلفة من الأليلات أنكجنيك floxed. وكان الهدف هو توليد نماذج نجمي مع الخلايا المحددة وراثيا التي يمكن وصفها ظاهريا سواء في المختبر وفي الجسم الحي، وربما استخدامها لتطوير العقاقير قبل السريرية في الاولالفئران مناعية الحكومية المختصة.

خطوط الخلايا البشرية أنشأ هي النموذج الأكثر شيوعا من ورم نجمي المرضية والاستجابة المخدرات في المختبر وفي الجسم الحي، وهي من الناحية الفنية على التوالي إلى الأمام، على نطاق واسع، وقد عرفت حركية وtumorigenicity على xenografting مثلي في الفئران العوز المناعي 10،11،16-18 . ومن عيوبها عدم القدرة على توليد خطوط الخلايا أنشئت من astrocytomas منخفض الدرجة، مما يحد من الدراسة فقط لastrocytomas عالية الجودة؛ عدم وجود خلايا محددة المنشأ؛ وجود تشوهات الجينية المعقدة، وغالبا مع التشكيلات الجينية التي تختلف بشكل ملحوظ من عينة المرضى الأصلي؛ والقابلية للالمظهرية والانجراف الوراثي خلال الثقافة التسلسلية في المصل 11،17،19-22. النتائج المظهرية للطفرات أنكجنيك الفردية في خطوط الخلايا GBM الإنسان المنشأة يمكن ملثمين من قبل العديد من التشوهات التي هي في الواقع الحاضر، والتي غالبا ما يحول دون elucidation من النتائج المباشرة الوراثي، النمط الظاهري.

يتم إنشاؤها من خلال PDX مرور تحت الجلد من خلايا ورم نجمي معزولة المريض في الفئران العوز المناعي أو من خلال ثقافتهم الكروية وغير ملتصقة في تعريفها، وخالية من مصل المتوسطة قبل الحقن مثلي في أدمغة الفئران العوز المناعي 12،23. PDX المحافظة أكثر دقة المشهد الجيني من astrocytomas الإنسان، ولكن على غرار خطوط الخلايا البشرية المنشأة، وأثر المظهري من الطفرات أنكجنيك الفردية يمكن ملثمين بسبب التعقيد الجيني على 19،24. لتحديد عواقب المظهرية للطفرات أنكجنيك محددة، لا سيما في استجابة لعلاجات جديدة، وكثيرا ما تستخدم الألواح من خطوط الخلايا البشرية أنشأ أو PDX لإنشاء الارتباطات الوراثي، النمط الظاهري، وتظهر التعميم، وتقليل احتمال حدوث آثار خط معين الخلية. بينما PDX ألخص بدقة بصمات النسيجية المرضية من astrocytomas الإنسان، المؤتمر الوطني العراقيluding الغزو، xenografts مثلي من خطوط الخلايا البشرية أنشئت عموما لا 21،23،25. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا النجمية الإنسان العادي ومجلس الأمن القومي تم هندستها وراثيا مع الطفرات أنكجنيك محددة لنموذج نجمي تكون الأورام في التجارب المختبرية والحية 13،14،26. هذه الخلايا تفتقر إلى التعقيد الجيني من خطوط الخلايا البشرية القائمة وPDX وألخص بدقة التشريح البشري نجمي، ولكن تتطلب xenografting في القوارض العوز المناعي في الجسم الحي. لأن كل نماذج الخلية البشرية تتطلب المضيفين لمنع القوارض العوز المناعي بوساطة المناعة رفض طعم أجنبي، فشلت هذه النماذج لتلخيص التفاعلات ورم سدى الأم لنظام مسانج وتفتقر إلى نظام المناعة سليمة، مما يحد من التحقيق قبل السريرية المستهدفة سدى والمناعة تغييري العلاجات 10،11.

GEM الفحص تصريح من عواقب المظهري من مجموعات محددة سلفا من مؤتة أنكجنيكستعقد تكون الأورام في الجسم الحي خلال موضعية. في حين GEM غير مشروط لديها طفرات في جميع أنحاء الأنسجة التنمية، GEM مشروط وfloxed الأليلات أنكجنيك التي تمكن استهداف الطفرات عن طريق تقييد إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية بوساطة لأنواع معينة من الخلايا من خلال استخدام نوع معين الخلية المروجين 10،11،15،18. وقد استخدمت مشروط نجمي GEM لتوضيح الأدوار الوظيفية للطفرات أنكجنيك في أنواع الخلايا متميزة داخل الدماغ سليمة 11. الأداة المساعدة قبل السريرية من gliomagenesis في الموقع باستخدام GEM مشروط محدودة بسبب عدد من العوامل بما في ذلك 1) عدم وجود القرين في المختبر، 2) صعوبة في توليد أفواج كبيرة من الفئران مع الأنماط الوراثية المعقدة، 3) كمون طويلة من ورم في تطوير الموقع ، 4) والاستوكاستك تطور الورم. لأنه في الوضع الطبيعي تكون الأورام يفتقر إلى نموذج المقابلة في المختبر، اختبار المخدرات في المختبر لا يمكن إجراء ثإيث التقليدية نماذج GEM المشروطة. على عكس أنواع أخرى من السرطان، ونادرا ما يسببها نماذج GEM مشروطة من astrocytomas بواسطة الطفرات أنكجنيك واحدة 11. ومن ثم يلزم تربية مخططات معقدة لتوليد GEM مشروط مع الطفرات أنكجنيك متعددة. وعلاوة على ذلك، يحدث نجمي بدء مع انتفاذ متغير بعد فترة كمون طويلة في هذه النماذج، في حين تقدم لastrocytomas عالية الجودة يحدث عادة في غير موحدة، الطريقة العشوائية ويعطي في نهاية المطاف إلى نشوء الأورام مع المناظر الطبيعية الجينية المعقدة وحركية النمو السريع 27، 28. وانتفاذ متغير وطبيعة العشوائية من تطور خبيث في نماذج GEM مشروطة يتطلب أن الفئران الفردية يتم فحص التصوير الشعاعي بواسطة لاكتشاف وجود وموقع astrocytomas الدرجة العالية قبل تسجيلهم في التجارب قبل السريرية المخدرات. أخذت معا، وهذه القيود تعوق توليد واختبار أفواج كبيرة من GEM مشروط المطلوبة للعلاقات العامةeclinical اختبار المخدرات.

نظام GEM-TVA تقييمات النتائج والكفاءات، الذي يستخدم فيروسات الطيور (تقييمات النتائج والكفاءات) ناقلات لنقل العدوى GEM هندسيا للتعبير عن مستقبلات الفيروسي (TVA) على أنواع معينة الخلية العصبية، وقد استخدمت على نطاق واسع لنموذج نجمي تكون الأورام 11. على النقيض من GEM مشروط، وهذا النظام يتيح نموذج إدخال الطفرات أنكجنيك متعددة في أنواع خلايا معينة دون الحاجة لخطط تربية المعقدة. ومع ذلك، يقتصر من قبل انتفاذ متغير، شرط لتقسيم الخلايا بنشاط لتحقيق التكامل الفيروسي، والإدراج عشوائي من الجينات المحورة في جينوم المضيف 29.

غير الجرثومية GEM (nGEM) النماذج، التي تستخدم الخلايا تحصد من GEM، أصبحت ذات أهمية متزايدة لأنها التغلب على الكثير من أوجه القصور في أنظمة أخرى نموذج 15. دور الشروع في نوع من الخلايا والطفرات التي تحدث المشارك في نجمي المرضية من الصعب ردعالألغام باستخدام أنشئت خطوط الخلايا GBM الإنسان أو PDX لأنها مستمدة من الأورام في نهاية المرحلة التي تراكمت الطفرات الوراثية واسعة في أنواع الخلايا غير محددة أثناء تطور الخبيث. في المقابل، جميع الصفوف من astrocytomas يمكن نمذجة باستخدام nGEM عن طريق إحداث طفرات جينية محددة داخل أنواع محددة تنقية خلايا الدماغ 11،30. وهكذا، فإن تأثير الطفرات الجينية المحددة ونوع من الخلايا على الظواهر الخلوية والجزيئية يمكن تحديدها في المختبر وفي الجسم الحي. على غرار خطوط الخلايا GBM الإنسان المعمول بها، الأولي في المختبر اختبار المخدرات باستخدام nGEM يمكن استخدامها لتحديد أولويات العقاقير في الجسم الحي اختبار باستخدام الخلايا نفسها. تكون الأورام في الجسم الحي ومن ثم يمكن تحديد بواسطة allografting خلايا nGEM orthotopically في أدمغة تتزاحم مسانج المناعة المختصة 30. ولهذه النماذج طعم خيفي مثلي تسمح في الجسم الحي اختبار ليس فقط من التقليدية السامة للخلايا لالثانية المستهدفة العلاجات، ولكن المناعة تغييري والعلاجات المستهدفة سدى كذلك. أخيرا، يمكن تحديد دور المكروية على بدء الورم والتقدم من خلال مقارنة النتائج بين nGEM ونماذج GEM التقليدية باستخدام نفس الطفرات في أنواع الخلايا نفسها.

نحن وغيرنا قد وضعت نجمي nGEM باستخدام الخلايا الأولية - الخلايا النجمية، مجلس الأمن القومي، أو خلايا دبقية قليلة التغصن السلائف (OPC) - GEM تحصد من 30-34. كان المبرر وراء تطوير نجمي nGEM لخلق نموذج لتحديد عواقب المظهرية للطفرات أنكجنيك في أنواع معينة من الخلايا التي يمكن استخدامها لاختبار المخدرات قبل السريرية في المختبر والمجراة على الحيوانات في مأمن الحكومية المختصة. نحن حصاد الخلايا النجمية WT ظاهريا القشرية وNSC من غير لجنة المساواة العرقية، معربا، GEM مشروط الحفاظ على> 94٪ C57 / BL6 الخلفية مع مسار floxed RB - RB1 loxP / loxP، أو TgGZT121 - وfloxed RTK / RAS / مسار PI3K - NF1 loxP / loxP، KRAS G12D، PTEN loxP / loxP - الجينات في توليفات مختلفة 35-39. نحن الناجم عن إعادة التركيب الوراثي في المختبر باستخدام ناقلات الفيروسة الغدانية ترميز لجنة المساواة العرقية recombinase. لأن المحاصيل نجمية القشرية تحتوي على خليط من أنواع الخلايا، استخدمنا ناقلات Ad5GFAPCre أو الجينات المحورة أنكجنيك المهيمنة، مثل TgGZT 121 طردوا من المروج GFAP البشري، لإثراء لGFAP + الخلايا النجمية القشرية في هذه الثقافات. حددنا عواقب المظهري من G 1 / S (م ع)، MAPK، والطفرات في الخلايا النجمية مسار PI3K القشرية ومجلس الأمن القومي في المختبر وفي الجسم الحي. MAPK وPI3K تنشيط مسار G1 / S-المعيبة النجمية تحاكي جزيئيا GBM البشري proneural، وعند حقن مثلي، والأورام التي تشكلت في مكان محدد مسبقا مع حركية النمو موحدة، الإختفاء قصيرة، والنسيجيةبصمات القاعدة على الإنسان GBM 30. الرصد الطولي للنمو الورم في الجسم الحي الإيدز قبل السريرية لاختبار المخدرات من خلال تطبيع الأفواج العلاج والتحليل الكمي من نمو الورم في الاستجابة للعلاج 40. نحن مصممون حركية نمو الورم عن طريق التصوير تلألؤ بيولوجي الطولي للفئران حقنت وسيفيراز يعبرون عن الخلايا النجمية القشرية. ولذلك، الخلايا النجمية القشرية وNSC المستمدة من GEM مشروط توفر نظام نموذجي لين العريكة للتعريف عواقب وظيفية من الطفرات المرتبطة نجمي ونظام نموذج محتمل لتطوير العقاقير قبل السريرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتمت الموافقة على جميع الدراسات على الحيوانات من جامعة نورث كارولينا المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. التثقيف القشرية النجمية من الفئران حديثي الولادة

  1. إعداد
    1. جعدة 2-3 أنسجة مهمة حساسة ووضع في الجزء السفلي من قارورة تحتوي على 70٪ من الإيثانول. وضع تشريح مقص، ملقط منحني و 2 أزواج من ملقط الصغرى على التوالي في هذه القارورة. وتستخدم الأنسجة لتجنب الانحناء ملقط الصغيرة.
    2. إضافة 1 مل من HBSS الى 60 ملم طبق زراعة الأنسجة. إعداد طبق منفصل لكل حيوان والحفاظ على الأطباق على الجليد.
    3. تخدير الحيوانات في اللوائح المؤسسية.
    4. الحارة 7 مل من DMEM مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين، الستربتومايسين (DMEM كاملة) لكل حيوان في 37 ° C حمام الماء. ملاحظة: للحصول على 5 الفئران، وسوف تتخذ الخطوات 1.1.1-1.1.4 ~ 15 دقيقة.
  2. الأنسجة الحصاد
    1. التضحية الماوس حديثي الولادة (اليوم 1-3) في institutiاللوائح اونال.
    2. إزالة مقص تشريح من الإيثانول، والسماح لهم بالتنقيط الجافة، وجعل سهمي قطع في الجلد فوق الجمجمة من الحبل الشوكي إلى الأنف.
    3. اجراء خفض في الجمجمة على طول الدرز السهمي، بدءا من الحبل الشوكي وتوسيع الماضي بصيلات الشم. العناية للحفاظ على نصائح مقص بالقرب من السطح الداخلي للجمجمة لتقليل الضرر أنسجة المخ.
    4. باستخدام ملقط المنحني، قشر بلطف كل من نصف الكرة الجمجمة أفقيا بعيدا عن الدماغ.
    5. باستخدام ملقط الصغرى على التوالي، قرصة بلطف بعيدا الجزء الظهري من كل نصف الكرة القشرية ووضعه في طبق زراعة الأنسجة التي تحتوي على HBSS. الحرص على تجنب المخيخ والبصلة الشمية. لا تأخذ أي نوع من الأنسجة تحت الجسم الثفني.
    6. باستخدام مجهر تشريح و 2 أزواج من ملقط الصغيرة، وإزالة بلطف السحايا من كل نصف الكرة القشرية. العودة طبق زراعة الأنسجة لالجليد حتى بداية homogenizatio الأنسجةن.
    7. كرر الخطوات من 1.2.1 خلال 1.2.6 لكل حيوان إضافي. ملاحظة: للحصول على 5 الفئران، وسوف تتخذ الخطوات 1.2.1-1.2.7 ~ 30 دقيقة.
  3. الأنسجة التجانس
    1. باستخدام شفرة حلاقة نظيفة، الزهر ناعما نصفي الكرة الأرضية القشرية ونقل إلى لوحة نسيج الثقافة هود.
    2. نقل الأنسجة إلى مكعبات العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي. غسل لوحة مع 1 مل من الجليد الباردة HBSS ونقل إلى أنبوب يحتوي على الأنسجة.
    3. الانتظار حتى يستقر الأنسجة إلى أسفل الأنبوب، ثم إزالة الزائد بعناية HBSS باستخدام ماصة.
    4. إضافة 2 مل من درجة حرارة الغرفة التربسين / EDTA. ماصة ~ 10X مع ماصة 1 مل لمواصلة تنأى الخلايا.
    5. احتضان تعليق الخلية عند 37 درجة مئوية لمدة 15 - 20 دقيقة. مزيج بعناية من قبل انعكاس كل 5 دقائق.
    6. إضافة 3 مل من DMEM الكامل لكبح التربسين. ماصة ~ 10X مع ماصة 1 مل لخلط الحل.
    7. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    8. إزالةطاف مع ماصة 1 مل. لا نضح المتوسطة لأن بيليه قد تكون فضفاضة.
    9. Resuspend وبيليه في 4 مل من 37 درجة مئوية استكمال DMEM. نقل تعليق خلية إلى 75 سم المسمار أعلى قارورة زراعة الأنسجة. ملاحظة: للحصول على 5 الفئران، وسوف تتخذ الخطوات 1.3.1-1.3.9 ~ 50 دقيقة.
    10. حوالي 16 ساعة بعد الحصاد نجمية، وغسل القارورة مع 4 مل من 37 درجة مئوية HBSS، ثم يضاف 4 مل من 37 درجة مئوية استكمال DMEM. الحفاظ على الخلايا النجمية القشرية عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. ملاحظة: الخطوة غسل مهمة لإزالة الخلايا غير ملتصقة والحطام من الطبق الثقافة.
    11. عندما تكون الثقافة هي ~ 95٪ متموجة، يهز ليلا 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، إزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على خلايا منفصلة، ​​ثم غسل القارورة مع 4 مل من 37 درجة مئوية HBSS. إضافة 4 مل من 37 درجة مئوية استكمال DMEM والحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لإثراء الثقافات لالنجمية القشرية، وتلويث الخلايا الدبقية الصغيرة وخلايا دبقية قليلة التغصن السلف تنفصل مع هذا الإجراء ويتم إزالتها من الثقافة 41.
    12. كرر الخطوات 1.3.1-1.3.11 لكل حيوان.
  4. تحريض بالتعديل الوراثي
    1. 24 ساعة بعد الانتهاء من خطوة 1.3.11، استبدل المتوسطة مع 2 مل من 37 درجة مئوية استكمال DMEM. إضافة 1 مل من 37 ° C SCM تحتوي على 1 ميكرولتر من> 10 10 PFU / مل من Ad5CMVCre أو Ad5GFAPCre. احتضان لمدة 6 ساعة عند 32 درجة مئوية في 5٪ CO 2 .CAUTION: احتياطات السلامة عند التعامل مع استخدام BSL2 اتش المؤتلف.
    2. إزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس وإضافة 37 ° C DMEM كاملة دون الفيروس إلى الخلايا النجمية القشرية. تنبيه: احتياطات السلامة عند التعامل مع استخدام BSL2 الفيروسات الغدية المؤتلف وتجاهل وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس في أنظمة المؤسسية. ملاحظة: للحصول على 5 الثقافات نجمية، الخطوات من 1.4.1 - 1.4.3 سيستغرق ~ 15 دقيقة باستثناء حضانة 6 ساعة.
    3. توسيع الثقافات نجمية القشرية لفيالتجارب المختبرية وتوصيف الجسم الحي. ملاحظة: تحديد وجود الطفرات التالية إعادة التركيب من قبل لجنة المساواة العرقية-PCR مع الاشعال محددة لجين معاد أو immunoblots إما البروتين تحور معين أو إشارات لها عواقب. الوقت اللازم لتحقيق الاستقرار المظهري الثقافات نجمية القشرية بعد إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية سوف تعتمد على الطفرات المستخدمة ويجب أن تحدد تجريبيا (الشكل 2).

2. زراعة الخلايا الجذعية العصبية من الفئران حديثي الولادة

  1. إعداد
    1. قبل البدء في تشريح، وإعداد 4 مل من محلول الهضم في الدماغ عن طريق إضافة 3.1 ملغ و 1.3 ملغ غراء السيستين إلى 4 مل تفارق المتوسطة - 98 ملي نا 2 SO 4، 30 ملم K 2 SO 4، 5.8 ملم MgCl 2، 0.25 مم CaCl 2 ، 1 ملم HEPES (من 1 M HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4 الأسهم) 20 ملي الجلوكوز، 0.001٪ الفينول الأحمر، و0.125 ملي هيدروكسيد الصوديوم. إضافة غراءوالسيستين إلى المتوسطة التفكك سوف تتحول الصفراء الحل.
    2. احتضان في 37 ° C حمام الماء لمدة 15 دقيقة. مزيج دوريا من قبل انقلاب.
    3. إضافة 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم قطرة من الحكمة حتى يعود الهضم حل لإضاءة اللون الأحمر.
    4. في ثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة، وتصفية العقيمة الحل الهضم باستخدام فلتر حقنة (0.22 ميكرون حجم المسام). يبقي الحل الهضم على الجليد.
    5. تحضير 50 ​​مل من الخلايا الجذعية المتوسطة (SCM) عن طريق خلط 44.5 مل NSC بصل متوسطة، 5 مل NSC ملحق، 0.5 مل البنسلين، الستربتومايسين، 50 ميكرولتر 0.2٪ الهيبارين، 10 ميكرولتر 100 ميكروغرام / مل EGF، و 10 ميكرولتر 100 ميكروغرام / مل bFGF. SCM غير مستقر لمدة 1 أسبوع عند تخزينها في 4 درجات مئوية.
    6. إعداد كامل HBSS (cHBSS) عن طريق خلط 50 مل من 10X HBSS، 1.25 مل 1 M HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.4)، 15 مل 1 M D-الجلوكوز، 5 مل 100 مم CaCl 2، 5 مل 100 ملي MgSO 4، و 2 مل 1 M NaHCO 3. جلب الحجم الإجمالي إلى 500 مل مع DDH 2 O.
    7. تصفية تعقيم cHBSS الطرافةهكتار 0.2 ميكرون حجم المسام مرشح وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    8. جعدة 2-3 أنسجة مهمة حساسة ووضع في الجزء السفلي من قارورة تحتوي على 70٪ من الإيثانول. وضع تشريح مقص، ملقط منحنية، و 2 أزواج من ملقط الصغرى على التوالي في هذه القارورة. وتستخدم الأنسجة لتجنب الانحناء ملقط الصغيرة. ملاحظة: للحصول على 5 الفئران، وسوف تتخذ الخطوات 2.1.1-2.1.8 ~ 45 دقيقة.
  2. الأنسجة الحصاد
    1. تضحية حديثي الولادة (اليوم 1-3) في الفئران اللوائح المؤسسية.
    2. إزالة مقص تشريح من الايثانول 70٪، والسماح لهم لبالتنقيط الجاف، واجراء خفض السهمي في الجلد فوق الجمجمة من الحبل الشوكي إلى الأنف.
    3. اجراء خفض في الجمجمة على طول الدرز السهمي، بدءا من الحبل الشوكي وتوسيع الماضي بصيلات الشم. العناية للحفاظ على نصائح مقص بالقرب من السطح الداخلي للجمجمة لتقليل الضرر أنسجة المخ.
    4. باستخدام ملقط المنحني، قشر بلطف كل من نصف الكرة الجمجمة أفقيا بعيدا عنالدماغ.
    5. بلطف إزالة المخ بأكمله ومكان في cHBSS الجليد الباردة.
    6. باستخدام مجهر تشريح، وإزالة بعناية السحايا من الدماغ مع أدوات تشريح غرامة.
    7. وضع الدماغ على سطحه السفلي وإزالة المخيخ / الدماغ المؤخر والبصلة الشمية / القشرة الأمامية مع العمودي (الاكليلية) يقطع مع مشرط حجم 11.
    8. تدوير الدماغ المتبقية بنسبة 90 درجة وضعه على الجزء الذيلية، وبالتالي توليد رأي الاكليلية من الدماغ. تحديد موقع البطينات الجانبية.
    9. قطع قسم تكعيبي تحتوي على منطقة subventricular (SVZ).
    10. نقل SVZ التي تحتوي على الأنسجة إلى 60 ملم الأنسجة صحن الثقافة مع الثلج النقي cHBSS البرد وأنسجة اللحم المفروم مع حجم 11 مشرط.
    11. نقل الأنسجة المفروم إلى العقيمة أنبوب 15 مل. وضع أنبوب على الجليد.
    12. غسل طبق بتري مع cHBSS البرد 1-2 مل الجليد. نقل محلول الغسيل إلى أنبوب يحتوي على الأنسجة.
    13. كرر الخطوات 2.2.1-2.2.12 مع neonata إضافيةل الفئران إذا لزم الأمر. نقل كل 15 مل أنابيب لنسيج الثقافة هود للفترة المتبقية من البروتوكول. ملاحظة: للحصول على 5 الفئران، والخطوات 2.2.1 - 2.2.13 سيستغرق ~ 45 دقيقة.
  3. الأنسجة التجانس
    1. وضع حل الهضم (المعد في الخطوة 2.1.1) في 37 ° C حمام الماء لمدة 5 دقائق. أيضا، دافئة SCM 2 مل في الدماغ في 37 ° C حمام الماء.
    2. إزالة بعناية طاف من الأنسجة المفروم مع ماصة 1 مل. لا نضح.
    3. إضافة 2 مل 37 ° C حل الهضم لكل 15 مل أنبوب وتخلط بعناية من قبل انقلاب.
    4. احتضان في 37 ° C حمام الماء لمدة 15 دقيقة. مزيج من قبل انعكاس كل 5 دقائق.
    5. إضافة 2 مل أخرى من 37 درجة مئوية حل لكل أنبوب الهضم وكرر الخطوة 2.3.4.
    6. تسمح للخلايا لتستقر في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية، ثم إزالة طاف من هضم الأنسجة باستخدام ماصة 1 مل.
    7. إضافة 2 مل من 10 ميكرومتر E-64 المخفف في cHBSS وتخلط بعناية من قبل انقلاب.
    8. احتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    9. تسمح للخلايا لتستقر في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية، ثم إزالة طاف من الأنسجة هضمها.
    10. إضافة 1 مل من 37 ° C cHBSS والتجانس مع ماصة 1 مل (~ 20 السكتات الدماغية). تجنب حقن فقاعات الهواء خلال تجانس الأنسجة.
    11. تمرير جناسة الأنسجة من خلال 40 ميكرون حجم المسام خلية مصفاة، ثم شطف مصفاة مع 5 مل من 37 درجة مئوية cHBSS.
    12. أجهزة الطرد المركزي لجناسة الأنسجة في 125 x ج لمدة 5 دقائق.
    13. إزالة 95٪ من طاف مع ماصة 1 مل من دون إزعاج بيليه الخلية. بيليه الخلايا و resuspend بعناية في 200 ميكرولتر 37 ° C SCM مع ماصة غيض 200 ميكرولتر.
    14. إضافة 1.8 مل 37 ° C SCM ونقل تعليق خلية إلى بئر العقيمة 6 لوحة جيدا. ملاحظة: للحصول على 5 الفئران، وسوف تتخذ الخطوات 2.3.1-2.3.14 ~ 75 دقيقة.
  4. ثقافة العصبية الخلايا الجذعية
    1. تجديد المتوسطة بعد 3 أيام، وذلك بإضافة 2 مل 37 °C SCM.
    2. بعد 7 أيام، ونقل neurospheres إلى أنبوب 15 مل، والسماح للneurospheres تسوية عن طريق الجاذبية ل> 5 دقائق.
    3. إزالة طاف وإضافة 2 مل 37 ° C SCM.
    4. نقل neurospheres لبئر جديد من لوحة 6 جيدا.
    5. إضافة 2 مل من 37 درجة مئوية SCM كل 3-4 أيام، وتغيير المتوسطة تماما كل 7 أيام.
    6. إذا neurospheres و> 100 ميكرون في القطر، وفصل بعناية مع الخلايا الجذعية حل التفكك وreplate مجلس الأمن القومي في كثافة الخلية المطلوبة.
  5. تحريض بالتعديل الوراثي
    1. إضافة 1 مل من 37 ° C SCM تحتوي على 1 ميكرولتر من> 10 10 PFU / مل من Ad5CMVCre أو Ad5GFAPCre إلى 2 مل من المجلس الأعلى للقضاء حاليا على الخلايا. تنبيه: احتياطات السلامة عند التعامل مع استخدام BSL2 اتش المؤتلف.
    2. احتضان لمدة 6 ساعة عند 32 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
    3. نقل SCM مع neurospheres في أنبوب 15 مل وترك مجالات تسوية عن طريق الجاذبية لمدة 5 دقائق.
    4. إزالة طاف أولا مع ماصة 1 مل، ثم مع ماصة 200 ميكرولتر. تنبيه: احتياطات السلامة عند التعامل مع استخدام BSL2 الفيروسات الغدية المؤتلف وتجاهل وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس في أنظمة المؤسسية.
    5. إضافة 2 مل من 37 درجة مئوية SCM دون الفيروس إلى مجلس الأمن القومي، ثم نقل إلى لوحة 6 جيدا. ملاحظة: للحصول على 5 الثقافات مجلس الأمن القومي، الخطوات 2.5.1-2.5.5 سيستغرق ~ 15 دقيقة باستثناء حضانة 6 ساعة.
    6. في اليوم التالي، كرر الخطوات من 2.5.1-2.5.5، تليها neurosphere الركض عند الضرورة. ويمكن الآن توسيع مجالات لمدة 2-3 الممرات في المختبر قبل توصيف وحقن مثلي في أدمغة فئران في الجسم الحي. ملاحظة: تحديد وجود الطفرات التالية إعادة التركيب من قبل لجنة المساواة العرقية-PCR مع الاشعال محددة لجين معاد أو immunoblots إما البروتين تحور معين أو إشارات لها عواقب. الوقت اللازم لتحقيق الاستقرار المظهري الثقافات NSC بعد إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية-سيعتمدعلى الطفرات المستخدمة ويجب أن تحدد تجريبيا (الشكلان 2 و 3).

3. مثلي من حقن الخلايا في الدماغ معاد للمستلم Iimmunocompetent الفئران

  1. إعداد 5٪ ميثيل السليلوز
    1. حل 5 ز 15 من القانون الجنائي السليلوز الميثيل في الماء منزوع الأيونات إلى الحجم النهائي من 50 مل في زجاجة 100 مل المسمار الغطاء. إضافة مسحوق ببطء مع التحريك في 4 درجات مئوية لمنع تراكمها. ويمكن ان يستغرق فترة تصل الى 24 ساعة من اثارة في 4 درجات مئوية لجميع السليلوز الميثيل لدخول الحل.
    2. تزن الزجاجة وتسجيل الوزن.
    3. الأوتوكلاف 5٪ الحل السليلوز الميثيل. تعقيمها مرة واحدة، فإن السليلوز الميثيل تصبح مادة هلامية نصف صلب.
    4. تزن الزجاجة وحساب الوزن المفقود خلال التعقيم.
    5. جو معقم و مطهر بإضافة 1 مل من الماء المعقم لكل غرام من الوزن المفقود.
    6. وضع على الجليد وإضافة 50 مل من الجليد الباردة 2X DMEM.
    7. مزيج بين عشية وضحاها باستخدام محرك مغناطيسي في 4 درجات مئوية. استخدام تقنية معقمة لتقسيم 5٪ الحل السليلوز الميثيل إلى 20 مل مأخوذة. مخزن aliquots في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر أو حتى انتهاء صلاحية 2X DMEM. ملاحظة: إعداد 5٪ ميثيل السليلوز الحل في الخطوات 3.1.1-3.1.7 سيستغرق ~ 2.5 أيام.
  2. إعداد القشرية النجمية للحقن
    1. الخلايا النجمية القشرية الحصاد عندما ~ 90٪ متموجة.
    2. لموسم الحصاد، نضح DMEM كاملة وغسل الأطباق مع حجم مساو من 37 ° C HBSS.
    3. إضافة التربسين يكفي لتغطية لوحة. إمالة بلطف والاستفادة من لوحة حتى تبدأ الخلايا لفصل.
    4. تعطيل التربسين مع حجم مساو من 37 درجة مئوية استكمال DMEM.
    5. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل وغسل لوحة مع نفس الحجم من 37 ° C DMEM الكامل المستخدمة في 3.2.4.
    6. نقل وسائل الإعلام لغسل الأنبوب الذي يحتوي الخلايا. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 3 دقائق.
    7. نضح قخلايا upernatant وresuspend في 1 مل من 37 درجة مئوية استكمال DMEM.
    8. عد تعليق خلية باستخدام عدادة الكريات أو العداد الخلية المناسبة أخرى لتحديد عدد الخلايا / ميكرولتر.
    9. نقل العدد المطلوب من الخلايا إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 3 دقائق.
    10. خلايا resuspend في 800 ميكرولتر من 37 درجة مئوية استكمال DMEM. تحديد حجم الكرية خلية (الحجم الكلي للتعليق الخلية - 800 ميكرولتر). ملاحظة: من الضروري لتحقيق تركيز خلية دقيق للحقن. وبالتالي، لا بد من تحديد حجم الكرية خلية في هذه الخطوة من أجل حساب حجم 5٪ السليلوز الميثيل لإضافة في الخطوة 3.2.12.
    11. نقل الخلايا إلى العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge ثم الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 3 دقائق.
    12. نضح طاف من بيليه الخلايا و resuspend الخلايا النجمية القشرية في حجم مناسب من 5٪ السليلوز الميثيل الجليد الباردة (المطلوب السعة الإجمالية - حجمبيليه خلية) للحصول على العدد المطلوب من خلية / ميكرولتر.
    13. وضع الخلايا على الجليد حتى الحقن.
    14. وضع الزجاج حقنة 250 ميكرولتر إلى تكرار مستضد الصيدلي ثم وضع إبرة حادة 18 G على حقنة.
    15. سحب المكبس ببطء مع الإبرة في نجمية تعليق القشرية. سيكون هناك فقاعة الهواء فوق الخلايا التي يجب إزالتها، منذ فقاعات الهواء وضغط ويقلل من حجم حقن فعلا في الدماغ.
    16. عقد رأس الإبرة فقط فوق نجمية تعليق القشرية ودفع المكبس بسرعة. سوف فقاعة الهواء يتحرك أسرع من تعليق خلية وسيتم طرد معظمهم.
    17. تتم إزالة كرر الخطوة حتى 3.2.16 جميع فقاعات الهواء من الإبرة.
    18. ملء الحقنة إلى حوالي ~ 200 ميكرولتر، ثم اضغط الإبرة صعودا وسحب المكبس مرة أخرى حتى يتوقف. يمكن إزالة فقاعات الهواء قليلا من خلال عقد إبرة غيض تصل بسرعة ودفع المكبس في حوالي 50 ميكرولتر ثم تنسحب ببطء إلى طاقتها.
    19. إبقاء طرف تستقيم وكرر الخطوة 3.2.18 4-5x.
    20. تجاهل إبرة قياس 18 وتناسب إبرة 27 G على حقنة.
    21. اضغط على الزر الموجود على موزع المستضد حتى يتم طرد السوائل من الإبرة. ملاحظة: للحصول على 1 نجمية خط الخلية، الخطوات 3.2.1-3.2.21 سيستغرق ~ 60 دقيقة.
  3. إعداد مجلس الأمن القومي للحقن
    1. عندما neurospheres و> 100 ميكرون في القطر، ونقل إلى 15 مل أنابيب والسماح للneurospheres تسوية عن طريق الجاذبية ل> 5 دقائق.
    2. إزالة طاف ويفرق بين neurospheres مع التفكك كاشف طيف، مثل الخلايا الجذعية حل التفكك أو accutase وفقا لتعليمات الجهة الصانعة أو 0.05٪ مع التربسين-EDTA كما هو موضح 42.
    3. تمنع الكواشف التفكك وفقا لتعليمات الشركة المصنعة دون تعريض الأمن القومي للمصل. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
    4. نضح طاف، ثم resuspend الخلايا في 1 مل من 37 ° C cHBSS لتوليد تعليق خلية واحدة.
    5. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو العداد الخلية المناسبة أخرى لتحديد عدد الخلايا / ميكرولتر.
    6. نقل العدد المطلوب من مجلس الأمن القومي إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
    7. الخلايا resuspend في 800 ميكرولتر من 37 درجة مئوية HBSS. تحديد حجم الكرية خلية (الحجم الكلي للتعليق الخلية - 800 ميكرولتر). ملاحظة: من الضروري لتحقيق تركيز خلية دقيق للحقن. وبالتالي، لا بد من تحديد حجم الكرية خلية في هذه الخطوة من أجل حساب حجم 5٪ السليلوز الميثيل لإضافة في الخطوة 3.3.9.
    8. نقل الخلايا إلى العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge ثم الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
    9. نضح طاف والانتهاء من إعداد الخلايا لحقن مثلي كما في 3.2.12-3.2.21. ملاحظة: للحصول على 1 NSC خط الخلية، الخطوات 3.3.1-3.3.9 سيستغرق ~ 60 دقيقة.
  4. إعداد الماوس للحقن
    1. تخدير الحيوان المتلقي عن طريق الحقن IP من 250 ملغ / كغ آفيرتين (2،2،2 ثلاثي بروم إيثانول) أو 100 ملغم / كغم من الكيتامين بالإضافة إلى 10 ملغ / كغ زيلازين، في المبادئ التوجيهية IACUC المؤسسية. ملاحظة: المستغلة هي الفئران في 3-6 أشهر من العمر والمضيفين طعم خيفي هنا. الفئران في أعمار مختلفة يمكن استخدامها للتحقيق في تأثير microenvironmental من العمر الدماغ التنموي على تكون الأورام.
    2. حلق فروة الرأس على موقع شق مع كليبرز أو مقص.
    3. تعقيم موقع الجراحة مع 3 مسحات بالتناوب من الايثانول 70٪ وبيتادين.
    4. تطبيق مرهم للعين للعيون لمنع أي ضرر بسبب فقدان طرفة المنعكس.
    5. تقييم عمق التخدير بواسطة دواسة انسحاب (قرصة أخمص قدميه) المنعكس. ملاحظة: للحصول على 5 الفئران، وسوف تتخذ الخطوات 3.4.1-3.4.5 ~ 15 دقيقة.
  5. زرع مثلي
    1. تأمين الحيوان في إطار التجسيمي.
    2. ماكالبريد شق فوق الدرز السهمي حوالي 0.5 سنتيمترا بين الأذنين والعينين.
    3. تحديد موقع على تقاطع الغرز الاكليلية والسهمي (Bregma)، وكذلك تقاطع الغرز اللامي والسهمي (لامدا). ضمان Bregma وامدا هي في نفس المستوى الأفقي.
    4. نعلق حقنة تحتوي على تعليق خلية وتكرار المستضد موزع إلى الإطار التجسيمي على رأسه. جلب رأس الإبرة 27 G في اتصال مع Bregma. هذا هو الأصل الذي سيتم استخدامه للتلاعب من ثلاثة إحداثيات الأبعاد.
    5. رفع الإبرة قليلا قبالة سطح الجمجمة والتحرك 2 مم الجانبية و1 مم منقاري من Bregma.
    6. خفض الإبرة بعناية من خلال الجمجمة لفي الوجهة 4 ملم بطني من Bregma. ملاحظة: نحن تستخدم هذه الإحداثيات المجسم لاستهداف العقد القاعدية. يمكن استخدام الإحداثيات المجسم مختلفة للتحقيق في تأثير microenvironmental المختلفةمناطق المخ على تكون الأورام.
    7. حقن 5 ميكرولتر من تعليق الخلية من خلال تفعيل مستضد موزع التكرار مرة واحدة. ترك الإبرة في مكانها لمدة 2 دقيقة للسماح للتوازن الضغط داخل الجمجمة.
    8. سحب الإبرة ببطء على مدى فترة من 30 ثانية. استخدام مسحة القطن لممارسة الضغط على أي نزيف قد تحدث.
    9. تقريب حواف الجرح وإغلاق الجرح باستخدام لاصق الأنسجة. إدارة 20 ميكرولتر من يدوكائين تحت الجلد في موقع شق. ملاحظة: للحصول على 5 الفئران، وسوف تتخذ الخطوات 3.5.1-3.5.9 ~ 50 دقيقة. وافق UNC IACUC استخدام بعد العملية الجراحية لتخدير موضعي فقط. يوصى بالتشاور مع IACUC المؤسسي المحلي بشأن متطلبات استخدام مسكن بعد العملية الجراحية بعد هذا الإجراء.
  6. رعاية ما بعد الجراحة
    1. وضع الحيوانات في، قفص دافئ نظيف للتعافي. لا ينبغي أن توضع الحيوانات مباشرة إلى الفراش، كما قد تحدث تطلع عرضي.
    2. مراقبةالحيوانات لاستئناف السلوك العادي مثل الاستمالة، وتناول الطعام، والتغوط. ملاحظة: استئناف السلوك العادي يمكن أن ~ 60 دقيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتطوير نظام نموذج nGEM مع الخلايا النجمية القشرية وNSC تحصد من حديثي الولادة GEM إيواء floxed الأليلات أنكجنيك الشرطية التي يمكن وصفها ظاهريا في المختبر وفي الجسم الحي (الشكل 1). من أجل التحقيق في عواقب الطفرات أنكجنيك تحديدا في الخلايا النجمية القشرية في المختبر، فمن الأهمية بمكان لإثراء الأولى للالنجمية. الحصاد نجمية القشرية تحتوي على خليط من الخلايا الدبقية الصغيرة، النجمية، الخلايا قليلة التغصن، OPC، والخلايا العصبية، ولكن يمكن أن الطرق ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الأكثر أهمية لضمان حصاد والثقافة من الخلايا النجمية القشرية هي 1) السليم لاستئصال القشرة دون أخذ الأنسجة تحت الجسم الثفني، 2) لإزالة السحايا، 3) لفصل الخلايا تماما، و4) لإثراء لGFAP + الخلايا النجمية. على الرغم من أن كنا الميكانيكية (الهز) وراثي (تقييد إعادة التركيب الجيني مع ناقلات Ad5GFAPCre أو الاستفادة من تحويل التحوير المهيمن (TgGZT 121) تحت سيطرة المروج GFAP) أساليب لإثراء لGFAP + الخلايا النجمية، وقد استخدمت تقنيات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRM هو باحث سريري في Damon Runyon-Genentech. تم دعم هذا العمل ، جزئيا ، من خلال المنح المقدمة إلى CRM من مؤسسة Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09) ، ووزارة الدفاع (W81XWH-09-2-0042) ، وصندوق أبحاث السرطان بجامعة نورث كارولينا (UCRF). يود المؤلفون أن يشكروا دانيال روث على المساعدة في تربية الفئران. يرغب المؤلفون أيضا في شكر هانا تشاي وكارتر ماكورميك وديمي كانوتاس وستيفاني جيليت وسوزانا كروم على زراعة الأنسجة والمساعدة في التألق المناعي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

يمكن أيضا شراء محلول الملح

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Invitrogen11995065DMEM من موردين آخرين بما في ذلك GIBCOSigma و Cellgro
Fetal Bovine Serum و RegularCellgro35-010-CV
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140122
مقص تشريح حاد مدببFisher Scientific08-395
ملقط إبهام الغضروف ، منحنيفيشر سيانتيفيك1631
Miltex 17-301 نمط 1 ملقط نمط المجوهرات ، غرامة ، 4Miltex17-301
إيثانول (200 برهان)Decon Labs2710
شفرات الحلاقةVWR55411-050
محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS) (1x) ، سائلInvitrogen14175-095
TrypLE Express (1x) ، Phenol RedInvitrogen12605-010حلول التربسين الأخرى مناسبة أيضا للخلايا النجمية القشرية وطبق
الثقافة ، 60 × 15 ممتوماس سينتيفيك9380H77
15 مل أنابيبBD Biosciences352096
50 مل أنابيبBD Biosciences352070
مخزون الفيروسات الغديةنقل الجينات Vector Core ، U. IowaAd5CMVCreStore في 5 & micro ؛ ل aliquots عند -80 درجة مئوية & C. خطرة. استخدم احتياطات السلامة Bsl2
كبريتات الصوديوم (Na2SO4) سيجما ألدريتش238597
كبريتات البوتاسيوم (K2< / sub>SO4< / sub>)Sigma-Aldrich221325
كلوريد المغنيسيوم (MgCl2< / sub>)Sigma-AldrichM8266
كلوريد الكالسيوم (CaCl2< / sub>)Sigma-Aldrich746495
ملحالبوتاسيوم HEPESسيجما ألدريتشH0527
D- (+)- الجلوكوزسيجما ألدريتشG8270   ؛
فينول ريدسيجما-ألدريتشP3532
هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)سيجما ألدريتشS5881
غراءورثينجتونLS003127
L-Cysteine-HClSigma-AldrichC1276
مرشح حقنة (0.22 & micro; حجم المسام م)MilliporeSLGP033NS
مجموعة انتشار Neurocult ، تقنيات الخلايا الجذعية للفأر5702تحتوي هذه المجموعة على مكمل NeuroCult NSC Basal Medium و NeuroCult NSC اللازم لثقافة NSC
0.2٪ محلول الهيبارينStemcell Technologies7980
EGF & nbsp ؛InvitrogenPMG8041
bFGF المتوازن InvitrogenPHG0261
Hanks (HBSS) (10x)Invitrogen14185-052
كبريتات المغنيسيوم (MgSO4< / sub>) بيكربوناتالصوديوم Sigma-AldrichM7506
(NaHCO3< / sub>)Sigma-AldrichS5761
E-64Sigma-AldrichE3132اصنع مخزون 10 ملي مولار DMSO ، مخزن في -20 درجة ؛ C
6 آبار ألواحفيشر Scientific07-200-83
مصفاة خلية (40 & micro; حجم المسام م)Corning352340
محلول تفكك الخلايا الجذعيةتقنيات الخلايا الجذعية5707بدلا من ذلك ، استخدم محاليل إنزيم لطيفة مثل Accutase
Methyl cellulose 15 cPSigma-AldrichM7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2xMilliporeSLM-202-Bلصنع محلول ميثيل السليلوز بنسبة 5
٪ 1.7 مل كبس كاب أنبوب الطرد المركزيالدقيق Corning3620
حقنة هاميلتون ، 250 & ل LT لا إبرةفيشر Scientific14-815-92
PB600-1 موزع مستضدهاميلتون& nbsp ؛ 83700
يمكن التخلص منها 18 جرام إبرفيشر ScientificNC9015638
27 ga 1/2 "إبرة طرف لورفيشر Scientific14-826-48
2،2،2-Tribromoethanol (Avertin)Sigma-AldrichT48402
BetadineFisher ScientificNC9386574
Puralube مرهم البصرياتفيشر ScientificNC9689910
موديل 900 إطار تجسيميKopf Instruments
VETBONDFisher ScientificNC9259532 لاصق الأنسجة 
ليدوكائين ShopMedVetRXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)PromegaG3580
Anti-Sox2MilliporeAB5603
الأرنب متعدد النسيلة المضاد للبريطان الليفي الحمضي (GFAP) DakoZ0334 
IVIS KineticPerkinElmerل in vivo < / em> التصوير
D-Luciferin - K + الملح الركيزة المضيئة بيولوجياPerkinElmer122796ل in vivo< / em> تصوير التلألؤ
البيولوجي EdU ImagingKit InvitrogenC10340
MSCV Luciferase PGK-hygroAddgene18782

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, suppl 5 1-49 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
  4. Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
  5. Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), Cancer Genome Atlas Research Network. 1061-1068 (2008).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
  9. Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
  10. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  11. Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
  14. Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
  15. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  16. Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
  17. Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
  18. Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
  19. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  20. Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
  21. Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
  22. Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
  23. Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
  24. Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
  25. Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
  26. Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
  27. Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
  28. Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
  29. Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
  30. Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
  31. Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
  32. McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
  33. Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
  34. Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
  35. Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. van, Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
  36. Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
  37. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  38. Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
  39. Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
  40. Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  42. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  43. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  44. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  45. Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522(2011).
  46. Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638(2009).
  47. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
  48. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  49. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  50. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
  51. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
  52. Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
  53. Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
  54. Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
  55. Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
  56. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة