يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زراعة انواع معينة ايليجانس في ممحوضة السائل وسائل الإعلام وإنشاء المعدلة وراثيا الديدان عن طريق قصف Microparticle

17.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51796

⸱

أغسطس 2, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

في هذه المقالة

ملخص

عادة ما يزرع C. ايليجانس على لوحات أجار الصلبة أو السائلة في الثقافات المصنف مع E. القولونية. لمنع المنتجات الثانوية البكتيرية من التباس الدراسات السمية والغذائية، ونحن تستخدم وسيلة السائل ممحوضة، CeHR، لتنمو ومزامنة عدد كبير من الديدان لمجموعة من التطبيقات المصب.

الملخص

في هذا البروتوكول، ونحن تقديم المواد المطلوبة، وإجراءات لجعل C تعديلها. legans ه التعويد والاستنساخ وسائل الإعلام (mCeHR). بالإضافة إلى ذلك، فإن الخطوات لفضح والتأقلم C. ايليجانس نمت على E. وصفت وسائل الإعلام القولونية إلى ممحوضة السائل. أخيرا، والتجارب التي تستخدم المصب ممحوضة C. توضيح ايليجانس الفوائد من هذا الإجراء. القدرة على تحليل وتحديد C. وقد تجلى ايليجانس شرط المغذيات التي تنمو N2 البرية من نوع الديدان في وسائل الإعلام السائل ممحوضة مع اختلاف تركيزات الهيم. يمكن تكرارها هذا الإجراء مع المواد المغذية الأخرى لتحديد تركيز الأمثل للنمو الدودة والتنمية، أو لتحديد الآثار السمية للعلاجات الدوائية. وتم تحديد آثار تركيزات الهيم متنوعة على نمو البرية من نوع الديدان من خلال الملاحظة المجهرية النوعية وquantitating ركان عدد من الديدان التي نمت في كل تركيز الهيم. بالإضافة إلى ذلك، تأثير تركيزات المغذيات متنوعة يمكن أن يعاير من خلال الاستفادة من الديدان التي تعبر عن أجهزة استشعار الفلورسنت التي تستجيب للتغيرات في العناصر الغذائية من الفائدة. وعلاوة على ذلك، تم إنتاج عدد كبير من الديدان بسهولة لتوليد C. ايليجانس المعدلة وراثيا باستخدام microparticle القصف.

المقدمة

الديدان الخيطية التربة وانواع معينة ايليجانس، هو كائن نموذج قوي يستخدم في العديد من الدراسات من علم الوراثة لعلم السموم. نتيجة لحجمه 1 مم، الوقت جيل السريع لأربعة أيام، وسهولة زراعة، وأرقام ذرية كبيرة، وقد تم استخدام هذه الديدان الخيطية في عدد من شاشات الوراثية والدوائية 1، 2. الباحثون الاستفادة من هذه الدودة لتحديد الجزيئات ومسارات المحفوظة في نظم الفقاريات. وتشمل هذه المسارات إشارات موت الخلايا، ومسارات الشيخوخة والتمثيل الغذائي، والجهاز العصبي 3-6. بالإضافة إلى ذلك، شفافية C. ايليجانس يسمح لتوليد خطوط المعدلة وراثيا باستخدام بروتين فلوري للصحفيين، والتي يمكن تصور مباشرة لتحليل أنماط التعبير الجيني والبروتين التعريب.

في العديد من الدراسات ومثقف هذه الديدان الخيطية على سطح القائم على أجار الصلبة باستخدام الديدان الخيطية متوسطة النمو (NGM) لوحات أو في لترالثقافات iquid المصنف مع كولاي كمصدر للغذاء 7،8. ويمكن لهذه المصادر الغذائية البكتيرية نخلط الدراسات البيوكيميائية وعلم السموم مع تدخل من البكتيريا من المنتجات التي تؤثر على تفسير النتائج. من أجل تجنب هذه الآثار المركبة، C. ايليجانس يمكن تربيتها في وسائل الإعلام السائل ممحوضة أن يخلو من البكتيريا كمصدر للغذاء. باستخدام هذه الوسائط، ونحن مثقف بنجاح الملايين من الديدان متزامنة للغاية بالنسبة للعديد من المعايير C. ايليجانس البروتوكولات بما في ذلك تحليل ميكروأري الجينات ينظم بشكل مختلف في C. ايليجانس يتعرضون لتركيزات مختلفة الهيم، وإنتاج الديدان المعدلة وراثيا باستخدام القصف الجينات. ويعرف كيميائيا هذه الوسائط ومعدلة من وصفة الأصلي صاغها الدكتور اريك كليج 9. باستخدام هذه الوسائط mCeHR، حددنا الجينات المسؤولة عن الهيم التوازن بنجاح، ويشار إلى الجينات كما تستجيب الهيم (HRG ق) 10، التي من شأنها أنلم يكن ممكنا في ظل ظروف النمو العادية التي تستخدم لوحات أجار NGM المصنف مع E. القولونية.

في هذا البروتوكول وصفنا الإجراء لإدخال وصيانة C. ايليجانس نمت على E. كولاي إلى mCeHR ممحوضة واستخدام هذه الطريقة للحصول على عدد كبير من الديدان المعدلة وراثيا لإنتاج C. خطوط ايليجانس باستخدام microparticle القصف. كما أننا الدراسات الحالية التي تظهر جدوى استخدام وسائل الإعلام ممحوضة لتحديد الاحتياجات الغذائية للC. ايليجانس باستخدام الهيم كمثال على ذلك. تظهر هذه الدراسات أن استخدام وسائل الإعلام mCeHR يسمح للنمو السريع في عدد كبير من C. ايليجانس للعديد من التطبيقات المستخدمة من قبل الباحثين المصب دودة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. سلالات دودة

  1. الحصول C. ايليجانس wildtype سلالات بريستول N2 من مركز علم الوراثة انواع معينة (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) والمحافظة عليها على لوحات NGM المصنف مع E. كولاي سلالة OP50 7. ملاحظة: الدودة المعدلة وراثيا سلالات IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) المستخدمة تم إنشاؤها كما هو موضح سابقا 11. يمكن طلب IQ6011 من مؤلف كتاب المقابلة.

2. إعداد التعديل C. ايليجانس إسكان والاستنساخ متوسطة (mCeHR)

إعداد وسائل الاعلام mCeHR السائل كما هو موضح أدناه 12. هذه الوسائط السائل ممحوضة يسمح الديدان في النمو دون أي مصادر غذائية إضافية. تنفيذ جميع التلاعبات السائل وسائل الإعلام ممحوضة والديدان ممحوضة باستخدام ظروف معقمة بشكل صارم مثل غطاء تدفق الصفحي.

  1. الحصول على الحليب المبستر الخالي من الدهون جدا من متجر البقالة. استخدام الموالية المبردةالقناة وليس المنتج درجة حرارة الغرفة. قبل استخدامها في mCeHR المتوسطة، خط الحليب على الدماغ القلب تسريب (بهي) أجار لوحات واحتضان لمدة 3 أيام في 30 درجة مئوية و 37 درجة مئوية للتحقق من العقم. نقل الحليب إلى 50 مل أنابيب معقمة وتخزينها في -80 درجة مئوية
  2. إعداد كل عنصر من العناصر التالية والجمع في النظام والمبالغ الممنوحة لتحضير 1 لتر من mCeHR (الجدول 1A): 10 مل من حمض ثنائي القاعدة 2 مم الكولين السيترات، 10 مل من الفيتامينات وعامل النمو مزيج (انظر الوصفة في الجدول 1B)، 10 مل من 2.4 ملي ميو اينوزيتول، 10 مل من 2 ملي كلوريد همين، 250 مل من الماء منزوع الأيونات. تطبيق الشفط والتصفية من خلال وحدة مرشح 0.22 ميكرون.
  3. إضافة 20 مل من مزيج الحمض النووي (وصفة في الجدول 1C)، 100 مل من مزيج المعادن (وصفة في الجدول 1D)، و 20 مل من 170 ملغ / مل ألبومين اللبن حلامة، 20 مل من الأحماض الأمينية الأساسية، و 10 مل من غير الأمينية الأساسية الأحماض، 20 مل من 450 ملي KH 2 PO 4،50 مل من 1.45 M مد الجلوكوز، 10 مل من 1 M HEPES، ملح الصوديوم، 250 مل من الماء منزوع الأيونات.
  4. تطبيق شفط لتصفية تعقيم المكونات. إزالة عامل التصفية وإضافة 1 مل من 5 ملغ / مل الكولسترول. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني للسائل الإعلام ما يقرب من 6-6.5. ملاحظة: يمكن تخزين هذا الحل في -80 درجة مئوية لمدة سنة واحدة.
  5. إضافة 20٪ (ت / ت) فائقة المبستر الحليب الخالي من الدسم العضوية إلى متوسطة mCeHR قبل الاستخدام. استخدام تقنية معقمة بدقة (على سبيل المثال في غطاء تدفق الصفحي) عند فتح وaliquoting الحليب. تخزين وسائل الاعلام في 4 درجات مئوية.

3. إعداد C. ايليجانس للثقافة في ممحوضة mCeHR السائل متوسطة

  1. تنمو الديدان على عشرة 60 ملم لوحات NGM حتى هناك العديد من الديدان حامل والحد الأدنى من OP50 E. القولونية على لوحات.
  2. إزالة الديدان من كل لوحة من قبل الشطف مع 5 مل من العازلة M9 (وصفة في الجدول 1F)، والجمع بين في أنبوب 50 مل المخروطية.
  3. السماح للديدان لياليettle من خلال ترك أنبوب للوقوف لمدة 5 إلى 10 دقيقة ثم إزالة بعناية طاف يحتوي على E. القولونية.
  4. كرر الخطوات من 3.2 و 3.3 2X لإزالة أكبر قدر من البكتيريا المتبقية ممكن قبل مواصلة الإجراء.
  5. resuspend والديدان في 0.1 N كلوريد الصوديوم في وحدة تخزين متعددة من ثلاثة، على سبيل المثال 1.5 مل، 3 مل أو 6 مل فيه الديدان الفردية يمكن أن ينظر في الأنبوب.
  6. تبييض الديدان بإضافة 5 N هيدروكسيد الصوديوم و 5٪ هيبوكلوريت الصوديوم (مبيض) حل في نسبة 01:02:06 إلى تعليق دودة. على سبيل المثال، 1 مل 5 N هيدروكسيد الصوديوم: 2 مل 5٪ هيبوكلوريت الصوديوم: 6 مل من تعليق دودة. مزيج من هيدروكسيد الصوديوم والتبييض قبل إضافة إلى تعليق دودة.
  7. دوامة الحل بقوة حتى يتم حل الديدان وحامل البيض فقط مرئية داخل تعليق (حوالي 5 إلى 10 دقيقة). رصد عملية باستخدام المجهر النقيض من المرحلة مع الهدف 10X.
  8. بعد الديدان قد حلت تماما، بيليه على الفورالبيض في 800 x ج لمدة 45 ثانية في 4 درجات مئوية. إزالة طاف بيليه وشطف مرتين مع 10 مل من الماء المعقم بواسطة الطرد المركزي بيليه في 800 x ج لمدة 45 ثانية في 4 درجات مئوية.
  9. بعد التبييض، ونقل بيليه البيض إلى 25 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة تحتوي على 10 مل من وسائل الإعلام mCeHR تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل التتراسيكلين. تنفيذ هذا الإجراء باستخدام تقنيات العقيمة. إذا رغبت في ذلك، إضافة المضادات الحيوية إضافية، بما في ذلك 250 ميكروغرام / مل حمض الناليديكسيك، لمنع نمو البكتيريا في الثقافات السائل ممحوضة.
  10. احتضان الثقافات السائل عند 20 درجة مئوية في حاضنة تهتز في حوالي 70 دورة في الدقيقة.
  11. تحقق الديدان يوميا لاحظ مرحلة من مراحل التنمية ومعدل النمو.
    ملاحظة: سوف تنمو الديدان في البداية ببطء وتتطلب من 7 إلى 10 يوما لتصبح حامل. لكن، وكما التأقلم الديدان إلى الوسط السائل ووقت توليد تنخفض إلى حوالي 4 أيام لwildtype (N2) الديدان.
  12. بعد الديدان ديك ديفيمتخطى إلى مرحلة حامل السائل في وسائل الإعلام، ونقل الثقافة الدودة إلى أنبوب مخروطي الشكل وبيليه في 800 x ج الديدان لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية باستخدام الدوار الدلو المتأرجح.
  13. إزالة طاف وبلطف resuspend الكرية دودة في حجم مساو من 0.1 M كلوريد الصوديوم. على سبيل المثال، استخدم 10 مل من كلوريد الصوديوم 0.1 M للديدان تربيتها في 10 مل من mCeHR. السماح للديدان لتسوية لمدة 5 دقائق على الجليد.
  14. تنفيذ الإجراء التبييض كما هو موضح أعلاه في الخطوات 3،5-3،8، والسماح الديدان أن تنمو لجيل الثاني في وسائل الإعلام السائل ممحوضة. إذا لزم الأمر، إضافة المضادات الحيوية مرة أخرى لتثبيط نمو البكتيريا.
  15. نسمح مرة أخرى لتصبح الديدان حامل ثم بيليه و resuspend الديدان في 0.1 M كلوريد الصوديوم كما هو موضح في الخطوات 3.12 و3.13، ثم تبييض مرة أخرى كما هو موضح في الخطوات 3،5-3،8، لإنتاج السكان متزامنة. تنمو الديدان اليرقات L1 في وسائل الإعلام دون المضادات الحيوية السائلة من الآن فصاعدا.

4. مزامنة الديدان من السائلثقافة

  1. بيليه و resuspend الديدان في 0.1 M كلوريد الصوديوم كما هو موضح أعلاه في الخطوات 3.12 و3.13. التبييض كما هو موضح أعلاه في الخطوات 3،5-3،8.
  2. resuspend الكرية البيض في 10 مل من العازلة M9 والسماح لليرقات أن يفقس O / N عند 20 درجة مئوية على منصة دوارة شاكر. ملاحظة: سوف يفقس البيض إلى يرقات L1، ولكن لن تتطور أبعد من ذلك، مزامنة الديدان في مرحلة L1.
  3. للحفاظ على الديدان وثقافة فرعية، بيليه L1 اليرقات في 800 x ج لمدة 5 دقائق، ثم resuspend واليرقات في 10 مل من mCeHR ونقل إلى 25 سم 2 القارورة. السماح للديدان أن ينمو بمعدل 20 درجة مئوية على منصة دوارة. الحفاظ على الكثافة القصوى من / 3،000 الديدان مل / سم 2 لضمان التغذية الكافية للديدان.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، لا يطلب من المضادات الحيوية للحفاظ على الظروف ممحوضة عندما تتم الإجراءات خارج باستخدام تقنيات معقمة في غطاء تدفق الصفحي. يجب فحص الديدان اليومية لرصد النمو.

5. الحرةزينغ وذوبان الثقافات الديدان لممحوضة متوسطة

  1. تجميد ممحوضة الثقافات دودة أو غير متزامن متزامنة اليرقات L1 في النيتروجين السائل. الديدان بيليه في 800 x ج لمدة 5 دقائق ثم resuspend في S العازلة (6.45 ملي KHPO 4، 43.55 ملي KHPO 4، 146.25 ملي مول كلوريد الصوديوم) باستخدام 0.5 مل لكل قارورة. إضافة حجم مساو من S العازلة مع 30٪ ت / ت الجلسرين إلى كل قارورة ونقل الديدان إلى -80 ° C قبل التخزين على المدى الطويل في السائل N 2. تجميد ما يقرب من 1 × 10 6 الديدان لكل مل في كل قنينة.
  2. ذوبان الجليد الديدان التي يحتضنها قارورة عند 37 درجة مئوية لمدة حوالي 2 دقيقة حتى يتم ذاب كلها تقريبا من الجليد. في غطاء تدفق الصفحي، ونقل الديدان إلى قارورة معقمة تحتوي على mCeHR ووضعها في 20 درجة مئوية.

6. تحديد تأثير هيمن التركيز على النمو والتكاثر في mCeHR

  1. استخدام وسائل الإعلام mCeHR ممحوضة لفحص النمو تعتمد المغذيات من C. ايليجانس. لتحديد تأثير سو تركيز هيمن على نمو دودة والتنمية، واستخدام متزامنة الديدان N2 ممحوضة أو سلالات أخرى من الفائدة. مزامنة اليرقات L1 كما هو موضح أعلاه في القسم 4.
  2. في اليوم التالي، بيليه والاعتماد متزامنة اليرقات L1 وتمييع إلى 1 دودة في ميكرولتر من وسائل الإعلام ممحوضة. جعل 10 ملي كلوريد همين في 0.3 M NH 4 OH وضبط درجة الحموضة إلى 8 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز.
  3. إضافة 800 ميكرولتر من وسائل الإعلام mCeHR إلى 24 لوحة جيدا. إضافة 100 الديدان إلى كل بئر في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام. إضافة كلوريد هيمن على كل بئر في تركيزات تتراوح من 0 ميكرومتر، ميكرومتر 1.5 ميكرومتر إلى 1،000 في ثلاث نسخ. التأكد من أن جميع الآبار تحتوي على نفس التركيز من 0.3 M NH 4 OH. معلق بلطف الديدان قبل pipetting للضمان أن 100 L1 اليرقات تضاف إلى كل بئر.
  4. دراسة الديدان اليومية ونلاحظ النمو في كل التركيز في كل بئر. حساب عدد من الديدان بعد 9 أيام من الحضانة ورسم عدد من الديدان / مل المقابلة لكل الهيمتركيز (الشكل 1).

7. تأثير هيمن التركيز على الاستشعار هيم الديدان

  1. احتضان متزامنة L1 الديدان استشعار الهيم (Phrg-1 :: GFP) في mCeHR تحتوي على 4 ميكرومتر، ميكرومتر 8، 10 ميكرومتر و 20 ميكرومتر هيمن.
  2. الصورة الديدان باستخدام مضان المجهري متحد البؤر، 48 ساعة آخر الحضانة (الشكل 2).

8. الاستفادة mCeHR لتوليد المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق قصف Microparticle

ملاحظة: الإجراء لتوليد وتنفيذ microparticle القصف باستخدام UNC-119 (ED3) الديدان نمت في mCeHR ويرد في الشكل 3 13.

  1. إعداد دودة
    1. نقل ما يقرب من 1 × 10 6 متزامنة UNC-119 (ED3) الديدان في 90 مل من وسائل الإعلام mCeHR في 175 سم 2 قارورة أسبوع واحد قبل القصف. السماح للديدان أن ينمو بمعدل 20 درجة مئوية سغ يهز منصة في ~ 70 دورة في الدقيقة (الشكل 3-1).
      ملاحظة: بعد أسبوع واحد، وينبغي أن تكون كثافة دودة أكبر بكثير مع العديد من الكبار الديدان حامل. وسوف تكون هناك حاجة حوالي 3 × 10 7 الديدان لmicroparticle القصف.
    2. البرد JM109 E. المصنفة القولونية 10 سم لوحات NGM على الجليد.
    3. نقل الديدان ممحوضة إلى أنبوبين 50 مل المخروطية والطرد المركزي الديدان في 800 x ج لمدة 2 دقيقة. نضح طاف و resuspend الديدان في كل أنبوب في 50 مل من العازلة M9 (الشكل 3-2).
    4. السماح للالديدان البالغة لتكوير عن طريق الجاذبية لمدة 10 إلى 15 دقيقة على الجليد.
      ملاحظة: يجب أن يحتوي على 2 مل بيليه الآن> 90٪ الديدان البالغة. يجب أن يكون هذا بيليه 2 مل ما يقرب من 5 × 10 6 الديدان ويكفي لأحد القصف microparticle.
    5. معطف كامل سطح JM109 المبردة المصنفة NGM وحة مع بيليه 2 مل من الديدان. تسمح السائل لاستيعابها تماما ثم يترك لوحةلمدة 30 دقيقة على الجليد قبل الشروع (الشكل 3-3).
  2. إعداد جزيئات الذهب
    1. تزن 30 ملغ من جزيئات الذهب في أنبوب microcentrifuge siliconized. إضافة 1 مل 70٪ من الإيثانول ودوامة أنبوب لمدة 5 دقائق.
    2. السماح للأنبوب على الجلوس لمدة 15 دقيقة، ثم الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 ثانية لتكوير جزيئات الذهب. إزالة طاف باستخدام طرف ماصة عن طريق لمس بعناية تلميح إلى الجانب المعاكس من أنبوب إلى جزيئات الذهب.
    3. غسل جزيئات الذهب مع 1 مل من الماء المعقم، دوامة لمدة 1 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في الأنبوب 6،000 x ج لمدة 10 ثانية. كرر الخطوة غسل مرتين، ثم resuspend وجزيئات الذهب في 0.5 مل من 50٪ معقمة الجلسرين.
      ملاحظة: إن تركيز النهائي من جزيئات الذهب يكون 60 ملغ / مل ويمكن تخزينه ل1-2 أشهر في 4 درجات مئوية.
  3. تحضير مزيج الجسيمات الحمض النووي الذهب
    1. الجمع بين 10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد المطلوب مع 10 و# 956؛ غرام من البلازميد الانقاذ UNC-119 في siliconized 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. إضافة 50 ميكرولتر من المياه DI و 100 ميكرولتر من معلق كذلك حل الجسيمات الذهب ثم دوامة لمدة 1 دقيقة.
    2. إضافة 150 ميكرولتر من 2.5 M و CaCl 2 ودوامة الحل مرة أخرى لمدة 1 دقيقة. لهذا الحل، إضافة 60 ميكرولتر من 0.1 M سبيرمدين ودوامة لمدة 3 إلى 5 دقائق.
    3. نبض الطرد المركزي الحل في 6،000 x ج لمدة 10 ثانية، وإزالة طاف وإضافة 300 ميكرولتر من الايثانول 70٪. دوامة جيدا لمدة 1 دقيقة، الطرد المركزي نبض في 6،000 x ج، وإزالة طاف و resuspend في 170 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. دوامة بقوة الحل لمدة 5 إلى 10 دقائق ثم نبض الطرد المركزي وإزالة طاف.
  4. القصف (الشكل 3-3)
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذا البروتوكول بها مع نظام التسليم الجسيمات المحدد في جدول المواد / المعدات. اتبع الإرشادات للصك تسليم الجسيمات المتاحة.
      <لى> ضع ورقة من المناديل الورقية إلى 15 سم لوحة. باستخدام الملقط، وتراجع سبعة macrocarriers بشكل فردي في الإيثانول بنسبة 100٪ ويضعونها على الأنسجة لتجف.
    1. تماما تنظيف غرفة biolistic، حامل macrocarrier، ولوحة الهدف مع الايثانول 70٪. نظيفة والأوتوكلاف شاشات التوقف قبل كل إجراء القصف.
    2. تحميل macrocarrriers في حامل باستخدام الملقط والصحافة في حامل باستخدام أداة جلوس.
    3. موزعة بالتساوي 20 ميكرولتر من الحمض النووي المغلفة جزيئات الذهب في وسط كل macrocarrier ومن ثم السماح الحل حتى يجف تماما.
    4. تنظيف شطري المفرق الضغط مع الإيثانول والتجمع مع الإيثانول تنظيف الأقراص تمزق. المسمار المفرق الضغط تجميعها والأقراص تمزق في غرفة القصف.
    5. تجميع شاشة التوقف تعقيمها مع حامل macrocarrier ووضع الجهاز إلى الرف المعادن المطلوبة وقفل في مكان.
    6. إدراج هذه السن الدنيا تجميعهاجهاز ocarrier في غرفة biolistic في الفتحة المخصصة تحت ضغط مقسم ومقسم تتلاءم مع الضغط.
    7. الشريط لوحة NGM مفتوحة مع الديدان على لوحة الهدف الجرف وإغلاق باب الغرفة.
    8. لقصف الديدان، وضبط الضغط إلى أن هناك حاجة لكسر الأقراص تمزق. بدوره على فراغ إلى 28 بوصة من الزئبق الضغط، ثم اضغط على زر اطلاق النار حتى تمزق الأقراص.
    9. الافراج عن فراغ وإزالة لوحة NGM من الجهاز. غسل الديدان من لوحة توزيع والعشرين في 10 سم لوحات NGM المصنف مع JM109 E. القولونية (الشكل 3-4).
    10. تسمح الديدان أن تنمو لمدة 10 إلى 14 يوما عند 25 درجة مئوية وتجويع لوحات. سوف الديدان انقاذهم من الخلل UNC-119 لها الحركة الطبيعية، ويمكن تحديدها في هذا الوقت. اختيار لا يقل عن 10 "wildtype" الديدان من لوحات منفصلة لمزيد من التحليل وهذه تمثل خطوط المعدلة وراثيا المستقلة (الارقام ..ه 3-5).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

زراعة C. ايليجانس في ممحوضة المساعدات المتوسطة السائل في تحديد العناصر الغذائية التي يتطلبها الديدان، ودون تدخل من المركبات الثانوية التي تنتجها E. القولونية. الديدان Wildtype N2 تأقلم على وسائل الاعلام mCeHR ضمن ثلاثة أجيال وتظهر نمو مماثلة لالديدان نمت على لوحات NGM البكتيرية. في الواقع، هذه الديدان أصبحت حامل في غضون 4 أيام بالمقارنة مع 3.5 أيام للديدان نمت على البكتيريا OP50.

واعتبر احد الاس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول نقدم ممحوضة mCeHR سائل الإعلام السائل تعديل يسمح السريع C. الجيل ايليجانس مع إنتاج عدد كبير من الديدان. ويبين هذا الإعلام العديد من المزايا كما تزرع الديدان دون تلويث E. كولاي أو مشتقات البكتيرية ويمكن استغلالها في الدراسات الغذائية والسمية. استخدام E. كولاي أو البكتيريا الأخرى في مثل هذه الدراسات لديها العديد من السلبيات. على سبيل المثال، يمكن للنمو البكتيريا تغيير في ظل ظروف مختلفة والبكتيريا قد استقلاب الجزيئات التي يجري يعا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب تعلن عدم وجود مصالح أو تضارب في المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للHealthGrants DK85035 وDK074797 (IH).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
MgCl2• 6H2OSigmaM-2393
سترات الصوديومSigmaS-4641
سترات البوتاسيوم أحادي الهيدراتSigmaP-1722
CuCl2< / sub>&# 8226; 2H2OFisherC455-500
MnCl2• 4H2OFisherM87-100
ZnCl2SigmaZ-0152
Fe(NH4)2(SO4)2• 6H2OSigmaF-1018
CaCl2• 2H2< / sub>OFisherC70-500
Adenosine 5 - أحادي الفوسفات ، ملح الصوديومSigmaA-1752
Cytidine 5 - فوسفاتSigmaC-1006
Guanosine 2 '- و 3' - أحادي الفوسفاتSigmaG-8002
Uridine 5 - فوسفات ، ملح ثنائي الصوديومSigmaU-6375
ThymineسيجماT0376
N-أسيتيل جلوكوزامينسيجماA3286
DL-ألانينفيشرS25648 
p-Aminobenzoic AcidSigmaA-9878
البيوتينسيجماB-4639
سيانوكوبالامين (B-12)سيجماV-2876
فوليونات (Ca)سيجماF-7878
نياسينسيجماN-0761
نياسيناميدسيجماN-3376
بانتيثينسيجماP-2125
بانتوثينات (Ca)سيجماP-6292
حمض البرويل جلوتاميك (حمض الفوليك)ACRCS21663-0100
بيريدوكسال 5'-فوسفاتسيجماP-3657
بيريدوكسامين 2HClسيجماP-9158
بيريدوكسين هيدروكلوريكسيجماP-6280
ريبوفلافين 5-PO4< / sub> (Na)سيجماR-7774
الثيامين حمض الهيدروكلوريكسيجماT-1270
DL-6،8-حمض الثيوكتيكسيجماT-1395
KH2PO4سيجماP-5379
الكولين ثنائي حمض سيتراتسيجماC-2004
ميو-الإينوزيتولسيجماI-5125
D-GlucoseSigmaG-7520
Lactalbumin Hydrolysate الأنزيميSigmaL-9010
ضخ القلب فيالدماغ BD211065
هيمين كلوريدفرونتير ScientificH651-9
HEPES ، ملح الصوديومSigmaH-3784
الكوليسترولجي تي بيكرF676-05
MEM الأحماض الأمينية غير الأساسيةInvitrogen11140-076
MEM محلول الأحماض الأمينيةInvitrogen11130-051
ملح الصوديوم حمض NalidixicSigmaN4382
التتراسيكلين هيدروكلوريدMP الطب الحيوي2194542
نظام التوصيل الحيويBioRad165-2257
جزيئات الذهب (مسحوق الاتحاد الافريقي)    فيرو أنظمة المواد الإلكترونية6420 2504 ، JZP01010KM
أو
جزيئات الذهب 1.0 & مBioRad  165-2263

المراجع

  1. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  2. Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
  3. Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
  4. Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
  5. Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
  6. Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109(2011).
  7. Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
  8. Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
  9. Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
  10. Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044(2010).
  11. Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
  12. Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
  13. Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
  14. Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
  15. Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19(2003).
  16. Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
  17. White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
  18. Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
  19. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  20. Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40(2004).
  21. Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

زراعة *C. elegans*وسط M-C-E-H-Rتركيز الهيمالمتطلبات الغذائيةالتقنية المعقمةتزامُن الديدانالمستشعرات الفلورية
زراعة انواع معينة ايليجانس في ممحوضة السائل وسائل الإعلام وإنشاء المعدلة وراثيا الديدان عن طريق قصف Microparticle
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.