عادة ما يزرع C. ايليجانس على لوحات أجار الصلبة أو السائلة في الثقافات المصنف مع E. القولونية. لمنع المنتجات الثانوية البكتيرية من التباس الدراسات السمية والغذائية، ونحن تستخدم وسيلة السائل ممحوضة، CeHR، لتنمو ومزامنة عدد كبير من الديدان لمجموعة من التطبيقات المصب.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
زراعة انواع معينة ايليجانس في ممحوضة السائل وسائل الإعلام وإنشاء المعدلة وراثيا الديدان عن طريق قصف Microparticle
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في هذا البروتوكول، ونحن تقديم المواد المطلوبة، وإجراءات لجعل C تعديلها. legans ه التعويد والاستنساخ وسائل الإعلام (mCeHR). بالإضافة إلى ذلك، فإن الخطوات لفضح والتأقلم C. ايليجانس نمت على E. وصفت وسائل الإعلام القولونية إلى ممحوضة السائل. أخيرا، والتجارب التي تستخدم المصب ممحوضة C. توضيح ايليجانس الفوائد من هذا الإجراء. القدرة على تحليل وتحديد C. وقد تجلى ايليجانس شرط المغذيات التي تنمو N2 البرية من نوع الديدان في وسائل الإعلام السائل ممحوضة مع اختلاف تركيزات الهيم. يمكن تكرارها هذا الإجراء مع المواد المغذية الأخرى لتحديد تركيز الأمثل للنمو الدودة والتنمية، أو لتحديد الآثار السمية للعلاجات الدوائية. وتم تحديد آثار تركيزات الهيم متنوعة على نمو البرية من نوع الديدان من خلال الملاحظة المجهرية النوعية وquantitating ركان عدد من الديدان التي نمت في كل تركيز الهيم. بالإضافة إلى ذلك، تأثير تركيزات المغذيات متنوعة يمكن أن يعاير من خلال الاستفادة من الديدان التي تعبر عن أجهزة استشعار الفلورسنت التي تستجيب للتغيرات في العناصر الغذائية من الفائدة. وعلاوة على ذلك، تم إنتاج عدد كبير من الديدان بسهولة لتوليد C. ايليجانس المعدلة وراثيا باستخدام microparticle القصف.
المقدمة
الديدان الخيطية التربة وانواع معينة ايليجانس، هو كائن نموذج قوي يستخدم في العديد من الدراسات من علم الوراثة لعلم السموم. نتيجة لحجمه 1 مم، الوقت جيل السريع لأربعة أيام، وسهولة زراعة، وأرقام ذرية كبيرة، وقد تم استخدام هذه الديدان الخيطية في عدد من شاشات الوراثية والدوائية 1، 2. الباحثون الاستفادة من هذه الدودة لتحديد الجزيئات ومسارات المحفوظة في نظم الفقاريات. وتشمل هذه المسارات إشارات موت الخلايا، ومسارات الشيخوخة والتمثيل الغذائي، والجهاز العصبي 3-6. بالإضافة إلى ذلك، شفافية C. ايليجانس يسمح لتوليد خطوط المعدلة وراثيا باستخدام بروتين فلوري للصحفيين، والتي يمكن تصور مباشرة لتحليل أنماط ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. سلالات دودة
- الحصول C. ايليجانس wildtype سلالات بريستول N2 من مركز علم الوراثة انواع معينة (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) والمحافظة عليها على لوحات NGM المصنف مع E. كولاي سلالة OP50 7. ملاحظة: الدودة المعدلة وراثيا سلالات IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) المستخدمة تم إنشاؤها كما هو موضح سابقا 11. يمكن طلب IQ6011 من مؤلف كتاب المقابلة.
2. إعداد التعديل C. ايليجانس إسكان والاستنساخ متوسطة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
زراعة C. ايليجانس في ممحوضة المساعدات المتوسطة السائل في تحديد العناصر الغذائية التي يتطلبها الديدان، ودون تدخل من المركبات الثانوية التي تنتجها E. القولونية. الديدان Wildtype N2 تأقلم على وسائل الاعلام mCeHR ضمن ثلاثة أجيال وتظهر نمو مماثلة لالديدان نمت على لوحات NGM البكتيرية. في الواقع، هذه الديدان أصبحت حامل في غضون 4 أيام بالمقارنة مع 3.5 أيام للديدان نمت على البكتيريا OP50.
واعتبر احد الاس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا البروتوكول نقدم ممحوضة mCeHR سائل الإعلام السائل تعديل يسمح السريع C. الجيل ايليجانس مع إنتاج عدد كبير من الديدان. ويبين هذا الإعلام العديد من المزايا كما تزرع الديدان دون تلويث E. كولاي أو مشتقات البكتيرية ويمكن استغلالها في الدراسات الغذائية والسمية. استخدام E. كولاي أو البكتيريا الأخرى في مثل هذه الدراسات لديها العديد من السلبيات. على سبيل المثال، يمكن للنمو البكتيريا تغيير في ظل ظروف مختلفة والبكتيريا قد استقلاب الجزيئات التي يجري يعا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن عدم وجود مصالح أو تضارب في المصالح المالية المتنافسة.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للHealthGrants DK85035 وDK074797 (IH).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| MgCl2• 6H2O | Sigma | M-2393 | |
| سترات الصوديوم | Sigma | S-4641 | |
| سترات البوتاسيوم أحادي الهيدرات | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2< / sub>&# 8226; 2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2• 4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2• 6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2• 2H2< / sub>O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 - أحادي الفوسفات ، ملح الصوديوم | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 - فوسفات | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2 '- و 3' - أحادي الفوسفات | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 - فوسفات ، ملح ثنائي الصوديوم | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | سيجما | T0376 | |
| N-أسيتيل جلوكوزامين | سيجما | A3286 | |
| DL-ألانين | فيشر | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| البيوتين | سيجما | B-4639 | |
| سيانوكوبالامين (B-12) | سيجما | V-2876 | |
| فوليونات (Ca) | سيجما | F-7878 | |
| نياسين | سيجما | N-0761 | |
| نياسيناميد | سيجما | N-3376 | |
| بانتيثين | سيجما | P-2125 | |
| بانتوثينات (Ca) | سيجما | P-6292 | |
| حمض البرويل جلوتاميك (حمض الفوليك) | ACRCS | 21663-0100 | |
| بيريدوكسال 5'-فوسفات | سيجما | P-3657 | |
| بيريدوكسامين 2HCl | سيجما | P-9158 | |
| بيريدوكسين هيدروكلوريك | سيجما | P-6280 | |
| ريبوفلافين 5-PO4< / sub> (Na) | سيجما | R-7774 | |
| الثيامين حمض الهيدروكلوريك | سيجما | T-1270 | |
| DL-6،8-حمض الثيوكتيك | سيجما | T-1395 | |
| KH2PO4 | سيجما | P-5379 | |
| الكولين ثنائي حمض سيترات | سيجما | C-2004 | |
| ميو-الإينوزيتول | سيجما | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin Hydrolysate الأنزيمي | Sigma | L-9010 | |
| ضخ القلب في | الدماغ BD | 211065 | |
| هيمين كلوريد | فرونتير Scientific | H651-9 | |
| HEPES ، ملح الصوديوم | Sigma | H-3784 | |
| الكوليسترول | جي تي بيكر | F676-05 | |
| MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM محلول الأحماض الأمينية | Invitrogen | 11130-051 | |
| ملح الصوديوم حمض Nalidixic | Sigma | N4382 | |
| التتراسيكلين هيدروكلوريد | MP الطب الحيوي | 2194542 | |
| نظام التوصيل الحيوي | BioRad | 165-2257 | |
| جزيئات الذهب (مسحوق الاتحاد الافريقي) | فيرو أنظمة المواد الإلكترونية | 6420 2504 ، JZP01010KM | |
| أو | |||
| جزيئات الذهب 1.0 & م | BioRad | 165-2263 |
المراجع
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
