يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تعزيز الشمالية كشف طخة الأنواع RNA الصغيرة في الدروسوفيلاميلانوجاستر

22.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51814

⸱

أغسطس 21, 2014

 , 
1Département de Génomique Fonctionnelle et Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2Center for Life NanoScience, Istituto Italiano di Tecnologia

في هذه المقالة

ملخص

والهدف من هذا المنشور هو تصور ومناقشة الخطوات المنطوق لتعزيز بروتوكول الشمالية صمة عار على الحمض النووي الريبي المستخرج من الدروسوفيلاميلانوجاستر الأجنة والخلايا والأنسجة. هذا البروتوكول هو مفيدة بشكل خاص للكشف عن كفاءة الأنواع RNA الصغيرة.

الملخص

وقد شهدت العقود الأخيرة انفجار الفائدة العلمية حول آليات الرقابة التعبير الجيني على مستوى الحمض النووي الريبي. هذا الفرع من علم الأحياء الجزيئي واشتعل كثيرا اكتشاف الرنا غير المكودة باعتبارها من اللاعبين الرئيسيين في التنظيم بعد النسخي. وقد رافق هذا المنظور الثوري والناجمة عن تطوير تكنولوجيات قوية لالتنميط قصيرة الرنا التعبير، سواء على مستوى الإنتاجية العالية (التعرف على نطاق الجينوم) أو تحليل مرشح واحد (الدولة تراكم مستمر من أنواع محددة). وعلى الرغم من عدة دولة من بين الفن الاستراتيجيات المتاحة حاليا لجرعات أو تصور مثل هذه الجزيئات الفارين، يبقى لطخة الشمالية فحص النهج المؤهلين في مجال البيولوجيا الجزيئية لتقييم فوري ودقيق التعبير RNA. أنها تمثل خطوة أولى نحو تطبيق أكثر تطورا والتكنولوجيات مكلفة، وفي كثير من الحالات، يبقى وسيلة تفضيلية للحصول على أفكار بسهولةفي علم الأحياء الحمض النووي الريبي. نحن هنا نظرة عامة على بروتوكول كفاءة (المحسن الشمالية البقعة) للكشف عن الرنا الميكروية أعرب ضعيف (RNA التنظيمية أو الأنواع الصغيرة الأخرى) من الدروسوفيلاميلانوجاستر الأجنة كلها، تشريح أنسجة اليرقات / الكبار يدويا أو المختبر في الخلايا المستزرعة. مطلوب كمية محدودة جدا من الحمض النووي الريبي واستخدام مواد من تدفق خلايا معزولة الخلوي يمكن أن يكون التفكير أيضا.

المقدمة

شهدت RNA الكيمياء الحيوية تقدمات مذهلة في السنوات الماضية 1. وقد انفجر فهمنا من إمكانات RNA في السيطرة على التعبير الجيني من خلال تحديد قوية غير المكودة RIBO المنظمين 2، من خلال اكتشاف آليات جديدة على أساس RNA 3،4 التنظيمية وتوصيف أعمق من الأحداث آخر النسخي المعروف بالفعل 5. كل ذلك معا وقد سمحت هذه الدراسات البيولوجيا RNA لجعل المشهد بشكل كبير، وأصبح موضوع البحث الرئيسي في المشهد العلمي الحالي. على وجه الخصوص، خلال السنوات الأخيرة أننا نحصل على الشعور تأثير المتفشي من "عالم RNA" في بيولوجيا الأعصاب الجزيئية 6، واحدة من المجالات البحثية الأكثر ديناميكية في علوم الحياة الحديثة. في العقد الأخير من القرن الماضي، وقد أحدثت ثورة في السيناريو العلمي الشامل قبل اكتشاف تدخل الحمض النووي الريبي و7،8 من الرنا التنظيمية صغيرة 9،10مع إيلاء اهتمام خاص لالرنا الميكروية 11، عن التطور الطبيعي الرنا غير مكود صغيرة المتورطين في السيطرة على جميع الوظائف الخلوية ما يقرب من المنظمين عديد المظاهر واندماجي في التعبير الجيني.

بعد ما يقرب من 10 عاما ميرنا الاكتشاف الأولي في ايليجانس انواع معينة من أمبروس ومختبرات Ruvkun، وتحولت اهتماما متجددا إلى الميدان عندما تم تحديد أعداد كبيرة من miRNAs في ذبابة الفاكهة وفي الخلايا البشرية فضلا 12-15. منذ ذلك الحين، وذلك بفضل النهج المعدلة وراثيا تنوعا، وقفت ذبابة الفاكهة السوداء البطن بها باعتبارها السياق البيولوجي قيما للالخوض ميرنا الحيوي والنشاط. كشفت ذبابة الفاكهة miRNAs ظائف متميزة في عمليات الحشرات محددة أو الحفظ تطويريا، والتي تمتد من الشيخوخة وحتى التمثيل الغذائي، مما يشير إلى مسارات والسلوك، وبطبيعة الحال، تكوين الخلايا العصبية. على طول هذا الاتجاه، فإننا كشف مؤخرا وجود صلة رواية 16 في التعاون فضولrrelation التي تحدث بين الجينات سيد صناع التغيير العالمي / وأنسل من مسار RNA. عامل ذبابة النسخ GCM / الإنزلاق 17-19 يشكل نموذجا فريدا من المحددات مصير الخلية، والتي تملي الدبقية مقابل خيار مصير الخلايا العصبية في متعدد القدرات تطير السلائف العصبية 20. عام البحوث والعشرين طويلة حول هذا الموضوع وأكدت بشكل واضح وقوع مدخلات متعددة ومتداخلة من الجين تنظيم التعبير تتلاقى على صناع التغيير العالمي / أنسل 21-28 لتأسيس مستويات الحد الأدنى المطلوب لتحقيق التوازن بين نسبة الحساسة بين نظرائهم العصبية والدبقية خلال التطور العصبي.

اكتشفنا أن التنظيم عبر استهداف Dmel-miR279 يمثل مستوى الرقابة مزيد من المساهمة في مرحلة ما بعد النسخي صقل من صناع التغيير العالمي / أنسل التعبير 16. تحسينات منهجية محددة على الصعيد العالمي، ويتطلب هذه الخطوط البحثية: طول سنوات، عدة تقنيات وضعت أصلا لتحليل التقليديةتم تحويل الرنا itional لقياس الرنا صغيرة غير الترميز، مثل ما المقايسات حماية ريبونوكلياز، المصفوفات [كدنا] 29-31، في الوقت الحقيقي PCR أساليب 32-35 وتسلسل 36،37. على الجانب الآخر، إعادة تقويم المناهج الفنية عزز تقدمات مستمرة في هذا المجال.

شمال لطخة فحص (NB، أو هلام RNA فحص لطخة) يشكل المثال التمثيلي: يعمل إلى حد كبير على البيانات الشخصية تراكم RNA، لأنه يضمن كل من مستوى التعبير الكميات وكذلك تحديد الحجم. ومع ذلك، فإن حساسية الفقيرة الجوهرية للطريقة يحد عندما يكون ليتم تطبيقها على التعبير الجيني المستقبلون غرامة المنخفضة وفيرة، مثل الرنا قصيرة. والنتيجة الضارة هي شرط كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي مجموع، مما يجعل من الصعب تطبيقه على عينات بيولوجية محددة. لهذه الأسباب، NB المتغيرات المحددة للكشف الرنا صغيرة تم وضعها 38-40: نحن استغل لتحسين بروك NBedure 41 (ENB، وتعزيز الشمالية البقعة)، في حين توضيح التفاعل المذكور بين Dmel-miR279 وصناع التغيير العالمي / أنسل.

ويعتمد هذا الأسلوب على خطوة الكيميائية يشابك على أساس النشاط لمشتقات Carbodiimide [1 إيثيل-3- (3 dimethylaminopropyl) carbodiimide، EDC] لإصلاح الحمض النووي على دعامات صلبة. Carbodiimide هو رابط عبر تنوعا معروفة لتحفيز تشكيل السندات أميد بين الكربوكسيل أو مجموعات الفوسفات تنشيط والجماعات أمين 42. يمكن استغلال هذه الخاصية لالرنا صغيرة زوجين تساهميا عبر مجموعة أحادية فسفرته من 5'-الهيدروكسيل إلى الأمينية مجموعات على سطح الأغشية النايلون. التكوين مرفق الناتجة يزيد من سهولة الوصول للحمض النووي يجمد وبدوره، كفاءة التهجين التحقيق المستهدفة، مما يؤدي إلى تعزيز الكشف ملحوظا 43.

هذه التقنية تفترض relevanc معينةالإلكترونية في الدراسات الجزيئية ذبابة الفاكهة، التي وقوع فصول جديدة ومميزة من الرنا غير مكود صغيرة في الظهور 44. من بين هؤلاء، rasiRNAs 45،46 تشكل سلالة محددة من الرنا-التفاعل piwi (piRNAs 47)، والمشاركة في تسلسل محدد إسكات الجينات. تفاصيل منطوق هذه الطريقة يتم وصف كامل وتصور فيما بعد، نسبة إلى تحليل الرنا الميكروية Dmel-miR279 وDmel-miR286، وللمرة الأولى، من rasiRNA واحد، rasi4. نحن دفعت إلى التطرف هذه الطريقة، الأمر الذي سمح لنا الكشف عن أهداف أعرب سيئة من كميات ضئيلة من الحمض النووي الريبي (أقل من 1 ميكروغرام).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

مجموعة 1. عينة

  1. 2 فصل خلايا شبه ملتصقة شنايدر، (1-5 × 10 6 خلايا في المتوسط)، من قبل pipetting وحصادها بواسطة الطرد المركزي (100 x ج لمدة 1 دقيقة). في حالة في المختبر الخلايا الملتصقة مثقف، يعرض للتريبسين لهم في الظروف القياسية أو جمعها مباشرة من لوحات إلى كمية ملائمة من الحمض النووي الريبي استخراج كاشف، من خلال مساعدة من مكشطة الخلية.
  2. لجمع الجنين، وتنمو سلالات ذبابة الفاكهة في أقفاص الطيران والسماح الأجنة تتراكم على وضع البيض لوحات. مسح الأجنة من قبل الفرشاة في الماء المقطر (DH 2 O)، ونبذ الحطام تصفية غربال، وشطف واستعادة الأجنة في قارورة 48.
  3. كتقنية بديلة، تشريح الأنسجة / الأجهزة يدويا. عزل الخصيتين (نظام تفضيلي لتحليل بيرنا) من ذبابة الفاكهة البطن في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تحت stereomicroscope (20X التكبير)، وذلك باستخدام الإبر أو ملقط تشريح وفيماualized في سوليفان وآخرون 49.
  4. مدقة التجانس عينات بناء على الإدمان من 0.5 حجم استخراج الحمض النووي الريبي كاشف.

2. استخراج الحمض النووي الريبي / تحليل

  1. التعليمات التالية الصانعين أداء عزل الحمض النووي الريبي من خلال الكواشف التجارية. تنبيه! كلاء استخراج الحمض النووي الريبي وعادة ما تكون سامة وكاوية. بدلا من ذلك، وتطبيق البروتوكول استنادا K-بروتين لRNA العزلة 50، على النحو التالي:
    1. تمييع العينات في 400 ميكرولتر من وقف ميكس واحتضان في RT لمدة 15 دقيقة.
    2. استعادة مكونات ذواب بالماء بواسطة الفينول القياسية: الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي الاستخراج والكلوروفورم والإيثانول (ETOH) هطول / الغسيل. الهواء الجاف العينات و resuspend في diethylpyrocarbonate (DEPC) المعالجة بالإثير المقطر المزدوج (دد) H 2 O.
  2. تقييم تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق الأشعة فوق البنفسجية القياس الطيفي. أيضا ضمان نقاء RNA عالية، على مقربة من 2.0 والسفلىإد على و260/280 قراءة.
  3. تحقق من إعداد RNA على تغيير طبيعة هلام الاغاروز على النحو التالي:
    1. في كوب نظيف، حل 1.2 غرام من الاغاروز في 82 مل من DEPC-DDH 2 O، مع التحريك المستمر. تغلي حتى يذوب تماما.
    2. يسمح الحل هلام ليبرد. عندما تصل درجة الحرارة 60 درجة مئوية إضافة 10 مل من حمض 10X 4 morpholinepropanesulfonic (اجتماعات الأطراف) عازلة ل1X التركيز النهائي (FC)، و 8 مل من الفورمالديهايد بنسبة 37٪ إلى 3٪ FC. تنبيه! الفورمالديهايد هو مادة مسرطنة.
    3. صب جل في خلية الكهربائي الأفقية. السماح للهلام ليصلب تحت غطاء محرك السيارة لا يقل عن 1 ساعة. بعد التصلب، غمر جل في اجتماعات الأطراف 1X.
    4. قسامة 2 ميكروغرام من عينة الحمض النووي الريبي و 1 ميكروغرام من سلم (استخدام علامة RNA عند المرجوة تقييم دقيق). إضافة 3 مجلدات من الاغاروز صبغ تحميل (ALD) إلى RNA وسلم. الحرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وبارد فورا على الجليد. CAUTION! محتويات ALD (بروميد إيثيديوم والفورماميد، انظر المواد) هي المغير وتآكل، على التوالي.
    5. تحميل العينات وتشغيل هلام في 50 فولت لمدة 1 ساعة مع إعادة التدوير عازلة في بعض الأحيان. التحقق من نمط RNA التجزئة التي تصور الأشعة فوق البنفسجية هلام أو التصوير. الاعتراف العصابات المنفصلة الموافق 28S 18S وrRNAs وtRNAs (انظر الشكل 1).
  4. المضي قدما إلى شمال الفحص أو متجر RNA في -80 درجة مئوية.

3. تغيير طبيعة الأكريلاميد إعداد جل

  1. استخدام جهاز صغير الرأسي الكهربي لهذه الخطوة التجزئة (حجم اللوحة حوالي 8 سم × 9 سم، وسمك المشط 0.75 ملم).
  2. تجميع النظارات نظيفة معا في إطار الصب.
  3. تحضير 10 مل من 10٪ مادة الأكريلاميد / مكرر الأكريلاميد (19: 1) حل في اجتماعات الأطراف 1X، 7 M اليوريا. مباشرة قبل صب، إضافة 100 ميكرولتر من بيرسلفات الأمونيوم 10٪ و 10 ميكرولتر من TEMED وتخلط بسرعة الحل. تنبيهالأكريلاميد! هو أعصاب ومسرطنة.
  4. صب جل بين لوحات الزجاج وإدراج مشط جيدا بعناية لتجنب الفقاعات. السماح للهلام تتبلمر في RT لمدة 45 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. بدلا من ذلك، تخزين هلام O / N، ملفوفة في أوراق الترشيح غارقة في المياه ومختومة في التفاف ساران.

إعداد 4. عينة

  1. قسامة 0،5 حتي 20 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع لكل عينة. إذا تجاوز حجم 3-4 ميكرولتر، فراغ تجف العينة.
  2. لتحديد حجم، تشغيل قسامة (20-30 من القانون الجنائي) من رديولبلد انخفاض المدى سلم بالتوازي مع العينات، كعلامة (انظر القسم 4.3 و 4.4 لإعداد). التعامل معها بالتوازي مع العينات، كما هو موضح في الخطوة 4.5.
  3. سلم: إعداد رد الفعل إلى الأمام الفوسفات باستخدام 0.1 ميكروغرام من 10 نقطة أساس في خطوة وسلم. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ووقف رد الفعل بإضافة حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) إلى 20 ملي FC.
  4. تنقية بواسطة ETOH هطول / الغسيل، والهواء الجاف وResuspend في DDH 2 O (حوالي 100 ميكرولتر). تنبيه! 32 P هي مصدر المشع.
  5. لكل عينة إضافة حجم مساو من صبغة زرقاء الأكريلاميد (ABD). تفسد عن طريق التسخين عند 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وبارد على الجليد حتى تحميل. تنبيه! الفورماميد (المحتوى في ABD) هو تآكل.

5. الكهربي تجزئة

  1. إزالة لوحات الزجاج من الدعم الصب وبشكل صحيح تجميعها في الخلية الكهربائي. ملء الغرفة الداخلية والخارجية على حد سواء مع كافية العازلة تشغيل (RB).
  2. بلطف إزالة مشط وقبل تشغيل هلام في 200 V لمدة 10 دقيقة. قبل عينات التحميل ويغسل الودائع اليوريا من الآبار بواسطة التدفق بعض RB من خلال حقنة.
  3. نصائح لاستخدام مسطحة بعناية تراصف عينات من الخطوة 4.5 في الجزء السفلي من كل بئر. تحقق الأنود والكاثود اتصالات لتجنب تشغيل مقلوب. بعد تدخل عينات هلام في 100 فولت لمدة 5 دقائق، طncrease الجهد إلى 200 V.
  4. لطول التجزئة من حوالي 7 سم، وشوط 45 دقيقة لمدة كافية. تجنب برموفينول الأزرق (صبغة تتبع في ABD) لتجاوز هلام.
  5. تصور على هلام في الرنا طويلة مجزأة بواسطة إيثيديوم بروميد (EtBr) تلطيخ، باعتباره خطوة اختيارية:
    1. قطع بعيدا 2 سم من أعلى الجل وشطف لفترة وجيزة شريحة في DDH 2 O.
    2. احتضان شريحة هلام في RT لمدة 15 دقيقة مع طيف التسكع في RB، EtBr 0.5 ميكروغرام / مل FC.
    3. يزيل اللون هلام لمدة 15 دقيقة في RB، تصور rRNAs طويلة من الأشعة فوق البنفسجية هلام أو التصوير. تحقق لتحميل RNA والجودة (انظر الشكل 1، لوحة 7). تنبيه! إيثيديوم بروميد هو المغير.
  6. وفي الوقت نفسه المضي قدما النشاف الجزء السفلي من هلام تحتوي على أنواع RNA الصغيرة.

6. جل التنشيف

  1. قطع 6 قطع من الورق النشاف لتناسب مساحة النشاف ويعادل قطعة من unchargeد النايلون الغشاء. بلل ورقة ورقة، وغشاء 2 منصات النشاف في RB. تأكد من نقع تماما منصات طريق الضغط عليها مرارا وتكرارا في RB.
  2. إزالة هلام من الجهاز وفتح النظارات بواسطة متوسط ​​ملعقة. استخدام قطع نظيفة لإزالة الآبار. وضع ورقة هتما الرطب على هلام ورفعه بلطف صعودا.
  3. وضع غشاء النايلون على وجه خال من هلام. علامة الزاوية لتوجيه مرشح وفقا لنموذج تحميل. استكمال "ساندويتش" (3 قطع الورق كل جانب). لفة قضيب من البلاستيك على سطح وصمة عار، لإزالة أي فقاعات الهواء الممكنة.
  4. وضع وصمة عار بين اثنين من منصات النشاف ثم في الكاسيت النشاف. تجميع الكاسيت في وحدة النشاف، وملء الغرفة مع RB والتحقق من التوجه الصحيح (غشاء النايلون يجب أن تبقى بين جل ومحطة ايجابية).
  5. نقل في 20 V لمدة 20 دقيقة. ملاحظة: لضمان ظروف متجانسة، وبعد 10 دقيقة فتح وحدة النشاف وصدوير في اتجاه شطيرة من 180 درجة قبل إتمام عملية التحويل.

7. غشاء يشابك

  1. إعداد 6 مل من الحل يشابك الطازجة (XLS). تشبع 10 سم × 10 سم (أكبر من الغشاء النايلون) قطعة من الورق النشاف مع XLS. تنبيه! حمض الهيدروكلوريك (أحد مكونات XLS) غير ضارة للغاية.
  2. تفكيك صمة عار ووضع غشاء على ورقة الترشيح 3MM الرطب. ملاحظة: يجب أن RNA لا يكون على اتصال مباشر مع ورقة المشبعة. وضع مرشح ورقة بين لوحين من الزجاج والتفاف في ساران التفاف.
  3. تسخين الغشاء عند 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة، تليها DDH 2 O الغسيل. تخزين في -20 درجة مئوية أو الشروع في التهجين.

8. غشاء Prehybridization

  1. إذا كان قد تم التحقق RNA تحميل (خطوة اختيارية 5.5) فانتقل مباشرة إلى التهجين. أو آخر، وقطع بعيدا 1 سم من أعلى إلى مرشح النايلون، لتجنب التحقيق عبر hybridizatioنانوثانية إلى الرنا طويلة مجزأة.
  2. سخن 10 مل من التهجين الحل (HS) عند 37 درجة مئوية. تفسد 1 ملغ من سمك السلمون الحيوانات المنوية عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وبارد على الجليد وإضافة إلى HS.
  3. احتضان مرشح في HS في 37C لمدة 1 ساعة على الأقل، في ظل التناوب في فرن التهجين. تأكد من أن الجانب RNA للمرشح يواجه HS.

9. التحقيق التجميعي

  1. إنشاء رد فعل الفوسفات إلى الأمام في 10 بمول من قليل النوكليوتيد العقاقير معين، كما هو موضح في 4.3.
  2. إضافة 5 مجلدات من تريس، EDTA-كلوريد الصوديوم (TEN) العازلة للتفاعل وتنقية التمهيدي المسمى من النيوكليوتيدات الفردية من هلام الإقصاء اللوني على أعمدة G-25 باستخدام Sephadex (أو أيضا ETOH هطول). النشاط التحقيق يمكن تقييمها من قبل السائل التلألؤ عداد.

10. غشاء التهجين

  1. استبدال HS استنفدت الطازجة مع 10 مل قسامة (أعدت واستكملت كما هو موضح أعلاه). تسخين التحقيق في95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وبارد على الجليد وإضافة إلى HS الرواية. احتضان مرشح في 37 ° C ON.

11. غشاء الغسل

  1. استرداد حل التهجين وتخزينها في -20 درجة مئوية في مربع التدريع النشاط الإشعاعي.
  2. شطف التصفية في غسل العازلة (WB)، وأغسلها جيدا لمدة 10 دقيقة في RT.
  3. استخدام كاشف جيجر مولر لفحص النشاط الإشعاعي المتبقية في زوايا التصفية. عندما الانبعاثات خلفية حوالي 5 من القانون الجنائي، انتقل إلى غشاء المعرض.

12. كشف الإشارة

  1. فضح تصفية على أفلام تصوير الإشعاع الذاتي أو على شاشة تصوير الجزيئي ON. الكشف عن إشارات عن طريق تجهيز الفوتوغرافية أو التحويل الرقمي.
  2. تحليل كثافة الفرقة بواسطة برنامج مخصص الكمي (يماغيج أو Optiquant).

13. غشاء تجريد

  1. لإزالة الإشارات الأولية، غمر الغشاء في 500 مل من الغليان حل تجريد، ثم في احتضان RT لمدة 1 دقيقة. الشروع في رواية (قبل) التهجين أو تخزين مرشح في -20 درجة مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باتباع الإجراء الشامل وصفها في نص وتمثيل تخطيطي في الشكل 1، قمنا بتقييم التعبير الرنا صغيرة من عينات الحمض النووي الريبي معقدة من أصول مختلفة. في التجربة المعروضة في الشكل 1، تم عزل الحمض النووي الريبي من 2 خلايا ذبابة الفاكهة شنايدر عن طريق استخراج بروتين K، للتأكد من سلامة (خطوة اختيارية: تغيير طبيعة الاغاروز هلام تجزئة) وتحميلها في الضعف. وقد نشف والنصف من الجل على غشاء ومحايد كيميائيا عبر ربطها EDC. تم نقل النصف الثاني على مرشح النايل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

على الرغم من تقديرنا للالمحنك المتشابكة من خلالها RNA ينظم تكوين الخلايا العصبية في تزايد مستمر، والآثار الميكانيكية للcircuitries القائم على RNA العصبي التي تؤثر بيولوجيا الخلايا الجذعية، وتمايز الخلايا العصبية / التكامل الوظيفي، وتطوير الأمراض العصبية والسرطان لا تزال غير مستكشفة. صيانة هذه الشبكات من خلال الممالك يجعل إمكانات النظم الوراثية كما الدروسوفيلاميلانوجاستر مفيدة لكشف مسارات الخلوية غير مستكشفة، والتي تعتبر غير مكود الرنا القصير وعوامل النسخ كلاعبين الجزيئي ك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسانتيه آخرون ميديكال للبحوث، والمركز الوطني للبحوث العلمية، وجامعة دي ستراسبورغ، دخلت المستشفى دي ستراسبورغ، وجمعية صب لا SUR LE بحوث السرطان، والمعهد الوطني للسرطان، الوكالة الوطنية للبحوث ومنطقة الألزاس.

وقد تم دعم بيترو انيف من قبل مؤسسة بحوث صب لا ميديكال. حاليا، فهو حاصل على الزمالة ISTITUTO ايطالي TECNOLOGIA (IIT). معتمدة تكاليف النشر من قبل الشبكة Neurex (TriNeuron - برنامج INTERREG الرابع الراين العليا)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
التكوين النهائي / اسمكتالوج الشركة(مخزون)التعليقات
المتطلبات العامة
جهاز الطرد المركزي ، 5418Eppendorf5418 000.017
مزيل التلوث ، RNase AwaySigma-Aldrich83931يوضع على الزجاج / الأواني البلاستيكية ، امسح واشطف
مثبط RNase ، DEPCSigma-AldrichD5758خطير //// 1609-47-8
إعداد
عينة مجهر ستيريو, M60Leica 
1X PBS Buffer
137 ملي كلوريد الصوديومسيجما-ألدريتشS30147647-14-5   
2.7 ملي مولار KClسيجما ألدريتشP95417447-40-7   ؛
10 ملي متر Na2HPO4Sigma-AldrichS32647558-79-4 
1.8 ملي متر KH2PO4Sigma-AldrichP97917778-77-0 
استخراج / تحليل RNA
مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية THERMOScientificNanodrop 2000
Gel Imager ، ChemiDoc XRS +Biorad170-8265
Electrophoreses الأفقي ، كاشفBioRad170-4487EDU
حياةكاشف TRIzol15596026خطرة
PCA (25:24:1), 1:1 للاستخراجSigma-Aldrich77617136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 للاستخراجSigma-AldrichC243267-66-3   
EtOH, 2.5 vol. لهطول الأمطار ، 70٪ لغسلSigma-Aldrich5984464-17-5 
جين حاكم 1 كيلو بايت سلم الحمض النوويالحراري العلميSM0311
توقف ميكس
300 ملي مولار NaOAc ، درجة الحموضة 5.5Sigma-AldrichS2889127-09-3
1x RSB Solution
2٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)Sigma-Aldrich71736لا تبرد SDS أبدا لتجنب هطول الأمطار //// 151-21-3
2 مجم / مل Proteinase KRoche Applied Science0-3115828001EC 3.4.21.64 9
10X Reticulocylyte Standard Buffer (RSB)
100 mM Tris-Cl ، درجة الحموضة 7.4Sigma-AldrichT59411185-53-1   
100 ملي كلوريد الصوديومسيجما-ألدريتشS30147647-14-5   
30 ملي مولار MgCl2< / sub>Sigma-AldrichM82667786-30-3
طبيعة جل
1.2٪ AgaroseSigma-AldrichA9539دع الجل يتجمد لمدة 1 ساعة على الأقل // 9012-36-2
10X MOPS Buffer
0.2 M MOPS ملح الصوديوم ، درجة الحموضة 7Sigma-AldrichM9381لا تخلط بين ملح الصوديوم MOPS مع ملح الصوديوم MOPS MOPS //// 71119-22-7
صبغة تحميل
1x MOPS عازلة
3٪ فورمالديهايدسيجما ألدريتشF8775خطير //// 50-00-0
50٪ فورماميدسيجما ألدريتش47670خطير //// 75-12-7
بروميد الإيثيديوم (EtBr) 30 & mu ؛ جم / ملسيجما ألدريتشE1510خطير //// 1239-45-8
بروموفينول أزرق   ؛سيجما ألدريتشB0126115-39-9 
تجزئة الحمض النووي الريبي
الصغيرة نصائح تحميل هلام مسطحةتقنيات الحياةLC1002
Savant SpeedVac مكثفحراري علمي   ؛DNA120
الرحلان الكهربائي العمودي ، خلية رباعية البروتينية المصغرة   ؛Biorad165-8000
أكريلاميد
10٪ أكريلاميد / ثنائي أكريلاميد (19: 1)سيجما ألدريتشA3449خطر. دع الجل يتبلمر لمدة 45 دقيقة قبل الاستخدام
1x TBE Buffer (أو 1x MOPS Buffer)
7 M اليورياSigma-AldrichU650457-13-6
0.1٪ بيرسلفات الأمونيومSigma-Aldrich2155897727-54-0 
0.1٪ TEMEDSigma-AldrichT9281110-18-9
سلم الحمض النووي الجيني منخفض المدى للغاية (خطوة 10 نقطة أساس)تسمية Thermo ScientificSM12110.1 & ز ، كما هو موضح في تفاعل "وضع العلامات على المسبار"
Acrylamide Blue Dye   ؛
50٪ فورماميدسيجما ألدريتش47670خطير //// 75-12-7
بروموفينول أزرقسيجما ألدريتشB0126115-39-9   ؛
تشغيل المخزن المؤقت (RB)
1x MOPS Buffer 
RB البديل: 1x TBE Buffer
1x TBE Buffer
5X TBE
445 mM Tris-baseSigma-AldrichT150377-86-1 
445 ملي مولار حمض البوريكسيجما ألدريتشB790110043-35-3
20 ملي متر EDTAسيجما-ألدريتشEDS60-00-4   
تلطيخ الجل
بروميد الإيثيديوم 0.5 مو ؛ جم / ملSigma-AldrichE1510خطير //// 1239-45-8
1x RBStain لمدة 15 دقيقة مع EtBr ، قم بإزالته لمدة 15 دقيقة بدون EtBr
BLOTTING
3MM Whatman paperSigma-AldrichZ270849
غشاء نايلون محايد ، Hybond NXGE Healthcare Life ScienceRPN203Tحساسة
محلول التشابك (XLS)
1٪ 1-methylimidazole (v / v)Sigma-Aldrich336092قم دائما بإعداد كمية جديدة من XLS //// 616-47-7
12.5 ملي مولار هيدروكلوريكسيجما ألدريتشH1758خطير //// 7647-01-0
3.1٪ EDC (ث / v)سيجما ألدريتش345025952-53-8   ؛  
(PRE) -
عداد التلألؤ السائل التهجين   ؛بيكمانLS 6500
منوي سمك السلمون المقطوع ، 0.1 مجم / مل   ؛Life TechnologiesAM9680
rasi4 مسبار5 'CGGUGUUCGACAGUUCUCUCGGG -3'5s-rRNA
مسبار5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'Dmel-miR279
مسبار5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'Dmel-miR286
مسبار5'- AGCACGAGTTCGGTCTAGTCA-3'Purification
Kit ، Illustra MicroSpin G-25 ColumnsGE Healthcare Life Science27-5325-01
(Pre) - حل التهجين (HS) 0.5
٪ SDSSigma-Aldrich71736151-21-3 
5x Denhardt's Solution
20X SSPE
3.6 M NaClSigma-AldrichS30147647-14-5   
0.2 م فوسفات الصوديومسيجما ألدريتش3424837601-54-9   ؛  
20 ملي مولار EDTA (درجة الحموضة 8.0)Sigma-AldrichEDS  60-00-4   
50x Denhardt's Solution
1٪ Ficoll 400 (w / v)Sigma-AldrichF263726873-85-8
1٪ PolyvinylpyrrolidoneSigma-AldrichPVP409003-39-8
1٪ BSASigma-AldrichA79069048-46-8   
1X TEN Buffer
10 mM Tris-Cl (درجة الحموضة 8.0)Sigma-AldrichT150377-86-1 
100 ملي كلوريد الصوديومسيجما-ألدريتشS30147647-14-5   
1 ملي مولار EDTA (درجة الحموضة 8.0)Sigma-AldrichEDS60-00-4   
وضع العلامات
0.4 & mu ؛ م قليل النوكليوتيد
1.5 & ل Ci/μ ل [&جاما;-32P] ATPPerkin ElmerNEG002Aخطير //// 51963-61-2
1x T4 Polynucleotide Kinase BufferBiolabsB0201
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μ لBiolabsM0201EC 2.7.1.78<
Geiger Mueller DetectorsCanberra IndustriesMCB2 / CPS & ndash ؛ EM77021
عازلة الغسيل (WB) ، 2x SSPE
مخازن
0.2x SSPE
2x SSPE ، 0.5٪ SDS
0.2x SSPE ، 0.5٪ SDS
كشف الإشارة
نظام PharosFX PlusBiorad170-9460
الصورة Jمتوفرة
الكمية واحدةالأشعة السينية Biorad
، BioMax XARSigma-AldrichF5888مطور حساس للضوء
لأفلام الأشعةالسينية Sigma-AldrichP7042
Fixer لأفلام الأشعة السينيةSigma-AldrichP7167
STRIPPING
محلول
10 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك الرقم الهيدروجيني 8.8سيجما ألدريتشT150377-86-1   ؛
5 مللي متر EDTASigma-AldrichEDS60-00-4   
0.1٪ SDSSigma-Aldrich71736أضف SDS بعد الغليان لتجنب الرغوة //// 151-21-3
استخراج الحمض النووي الريبي Mini-Sub Cell GT ، تقنيات تغيير الاغاروزالاغاروز جل تغيير طبيعةمحلول للضوء < td colspan = "4" > تشابك مضاد للإحساس مضاد للإحساس مضاد للإحساس مضاد للإحساس على المسبارtd colspan = "4" > WASHغسيل صارمةمجانا أفلام تجريد

المراجع

  1. The RNA World. Gesteland, R. F., Cech, T. R., Atkins, J. F. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2006).
  2. Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. Long non-coding RNAs: insights into functions. Nat Rev Genet. 10, 155-159 (2009).
  3. Salmena, L., Poliseno, L., Tay, Y., Kats, L., Pandolfi, P. P. A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language? Cell. 146, 353-358 (2011).
  4. Cesana, M., et al. A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA. Cell. 147, 358-369 (2011).
  5. Orphanides, G., Reinberg, D. A unified theory of gene expression. Cell. 108, 439-451 (2002).
  6. Mehler, M. F., Mattick, J. S. Noncoding RNAs and RNA editing in brain development, functional diversification, and neurological disease. Physiol Rev. 87, 799-823 (2007).
  7. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M., Kostas, S., Driver, S., Mello, C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  8. Hamilton, A., Baulcombe, D. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, (1993).
  10. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  11. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).
  12. Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408, 86-89 (2000).
  13. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science. 294, 853-858 (2001).
  14. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 858-862 (2001).
  15. Lee, R. C., Ambros, V. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 862-864 (2001).
  16. Laneve, P., et al. The Gcm/Glide molecular and cellular pathway: new actors and new lineages. Dev Biol. 375, 65-78 (2013).
  17. Hosoya, T., Takizawa, K., Nitta, K., Hotta, Y. Glial cells missing: a binary switch between neuronal and glial determination in Drosophila. Cell. 82, 1025-1036 (1995).
  18. Jones, B. W., Fetter, R. D., Tear, G., Goodman, C. S. Glial cells missing: a genetic switch that controls glial versus neuronal fate. Cell. 82, 1013-1023 (1995).
  19. Vincent, S., Vonesch, J. L., Giangrande, A. Glide directs glial fate commitment and cell fate switch between neurons and glia. Developement. 122, 131-139 (1996).
  20. Cattenoz, P. B., Giangrande, A. Lineage specification in the fly nervous system and evolutionary implications. Cell Cycle. 12, 2753-2759 (2013).
  21. Jones, B. W., Abeysekera, M., Galinska, J., Jolicoeur, E. M. Transcriptional control of glial and blood cell development in Drosophila: cis-regulatory elements of glial cells missing. Dev Biol. 266, 374-387 (2004).
  22. Ragone, G., et al. Transcriptional regulation of glial cell specification. Dev Biol. 255, 138-150 (2003).
  23. Akiyama-Oda, Y., Hosoya, T., Hotta, Y. Asymmetric cell division of thoracic neuroblast 6-4 to bifurcate glial and neuronal lineage in Drosophila. Development. 126, 1967-1974 (1999).
  24. Bernardoni, R., Kammerer, M., Vonesch, J. L., Giangrande, A. Gliogenesis depends on glide/gcm through asymmetric division of neuroglioblasts. Dev Biol. 216, 265-275 (1999).
  25. Ragone, G., Bernardoni, R., Giangrande, A. A novel mode of asymmetric division identifies the fly neuroglioblast 6-4T. Dev Biol. 235, 74-85 (2001).
  26. Soustelle, L., Roy, N., Ragone, G., Giangrande, A. Control of gcm RNA stability is necessary for proper glial cell fate acquisition. Mol Cell Neurosci. 37, 657-662 (2008).
  27. Akiyama, Y., Hosoya, T., Poole, A. M., Hotta, Y. The gcm-motif: a novel DNA-binding motif conserved in Drosophila and mammals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 25, 14912-14916 (1996).
  28. Miller, A. A., Bernardoni, R., Giangrande, A. Positive autoregulation of the glial promoting factor glide/gcm. EMBO J. 17, 6316-6326 (1998).
  29. Krichevsky, A. M., King, K. S., Donahue, C. P., Khrapko, K., Kosik, K. S. A microRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain development. RNA. 9, 1274-1281 (2003).
  30. Liu, C. G., et al. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9740-9744 (2004).
  31. Yin, J. Q., Zhao, R. C., Morris, K. V. Profiling microRNA expression with microarrays. Trends Biotechnol. 26, 70-76 (2008).
  32. Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32, E43(2004).
  33. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).
  34. Shi, R., Chiang, V. L. Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR. Biotechniques. 39, 519-525 (2005).
  35. Raymond, C. K., Roberts, B. S., Garrett-Engele, P., Lim, L. P., Johnson, J. M. Simple quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA. 11, 1737-1744 (2005).
  36. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  37. Linsen, S. E., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nat Methods. 6, 474-476 (2009).
  38. Valoczi, A., et al. Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res. 32, e175(2004).
  39. Varallyay, E., Burgyan, J., Havelda, Z. Detection of microRNAs by Northern blot analyses using LNA probes. Methods. 43, 140-145 (2007).
  40. Kim, S. W., et al. A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs. Nucleic Acids Res. 38, e98(2010).
  41. Pall, G. S., Hamilton, A. J. Improved northern blot method for enhanced detection of small RNA. Nat Protoc. 3, 1077-1084 (2008).
  42. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , 2nd, Academic Press, Inc. (2008).
  43. Pall, G. S., Codony-Servat, C., Byrne, J., Ritchie, L., Hamilton, A. Carbodiimide-mediated cross-linking of RNA to nylon membranes improves the detection of siRNA, miRNA and piRNA by northern blot. Nucleic Acids Res. 35, e60(2007).
  44. Guzzardo, P. M., Muerdter, F., Hannon, G. J. The piRNA pathway in flies: highlights and future directions. Curr Opin Genet Dev. 23, 44-52 (2013).
  45. Aravin, A. A., et al. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr. Biol. 11, 1017-1027 (2001).
  46. Vagin, V. V., et al. A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science. 313, 320-324 (2006).
  47. Brennecke, J., et al. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell. 128, 1089-1103 (2007).
  48. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  49. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. J. Vis. Exp. (51), e2641(2011).
  50. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  51. Alwine, J. C., Kemp, D. J., Stark, G. R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridisation with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5350-5354 (1977).
  52. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495, 384-388 (2013).
  53. Flores-Jasso, C. F., Salomon, W. E., Zamore, P. D. Rapid and specific purification of Argonaute-small RNA complexes from crude cell lysates. RNA. 19, 271-279 (2013).
  54. Specchia, V., et al. Hsp90 prevents phenotypic variation by suppressing the mutagenic activity of transposons. Nature. 463, 662-665 (2010).
  55. Várallyay, E., Burgyán, J., Havelda, Z. MicroRNA detection by northern blotting using locked nucleic acid probes. Nat Protoc. 3, 190-196 (2008).
  56. Koscianska, E., Starega-Roslan, J., Czubala, K., Krzyzosiak, W. J. High-resolution northern blot for a reliable analysis of microRNAs and their precursors. ScientificWorldJournal. 11, 102-117 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الكشف عن الحمض النووي الريبوزي (RNA)الفصل الكهربائي بهلام الأكريلاميداستخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA)تهجين المسبارالكشف بالتصوير الشعاعي الذاتيعزل الحمض النووي الريبوزي (RNA)نقل الهلام
تعزيز الشمالية كشف طخة الأنواع RNA الصغيرة في الدروسوفيلاميلانوجاستر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.