يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل Metabolomic من دماغ الفئران بواسطة عالية الدقة النووية الرنين المغناطيسي الطيفي مقتطفات من الأنسجة

14.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51829

⸱

سبتمبر 21, 2014

 ,  , 
1Centre de Résonance Magnétique Biologique et Médicale, UMR 7339 CNRS, Faculté de Médecine, Aix-Marseille Université, 2Centre de Recherches en Oncologie Biologique et Oncopharmacologie, UMR 911 INSERM, Faculté de Médecine, Aix-Marseille Université

في هذه المقالة

ملخص

تتغير الكيمياء العصبية لدماغ الثدييات في العديد من الأمراض العصبية والجهازية. يمكن الحصول على الملامح المميزة للمستقلبات الدماغية بكفاءة بناء على المستخلصات الخام لأنسجة المخ. تحقيقا لهذه الغاية ، يتم استخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي عالي الدقة ، مما يتيح التحليل الكمي التفصيلي لتركيزات المستقلب (التمثيل الغذائي).

الملخص

منذ فترة طويلة استخدمت دراسات التعبير الجيني على مستويات الحمض النووي الريبي والبروتين لاستكشاف العمليات البيولوجية الكامنة وراء المرض. في الآونة الأخيرة ، تم استكمال علم الجينوم والبروتينات بتحليل كمي شامل لمجموعة المستقلب الموجودة في النظم البيولوجية. تسعى هذه الإستراتيجية ، التي تسمى التمثيل الغذائي ، إلى توفير توصيف عالمي لمكمل الجزيء الصغير المشارك في عملية التمثيل الغذائي. بينما يحدد الجينوم والبروتين المهام التي يمكن للخلايا القيام بها ، فإن الأيض هو جزء من النمط الظاهري الفعلي. من بين الطرق المستخدمة حاليا في علم الأيض ، تعتبر تقنيات التحليل الطيفي ذات أهمية خاصة لأنها تسمح للمرء بتحليل عدد كبير من المستقلبات في وقت واحد دون اختيار مسبق لمسارات كيميائية حيوية محددة ، مما يتيح نهجا واسعا غير متحيز. هنا ، يتم تقديم بروتوكول تجريبي محسن لتحليل التمثيل الغذائي عن طريق التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي عالي الدقة ، وهي الطريقة المفضلة للقياس الكمي الفعال لمستقلبات الأنسجة. نقاط القوة المهمة لهذه الطريقة هي (أنا) استخدام المستخلصات الخام ، دون الحاجة إلى تنقية العينة و / أو مستقلبات المستقلبات المنفصلة. (2) الطبيعة الكمية جوهريا للرنين المغناطيسي النووي ، مما يسمح بتحديد كمية جميع المستقلبات الممثلة بطيف الرنين المغناطيسي النووي بمركب مرجعي واحد فقط ؛ و (3) الطبيعة غير المدمرة للرنين المغناطيسي النووي التي تتيح الاستخدام المتكرر لنفس العينة لقياسات متعددة. النطاق الديناميكي لتركيزات المستقلب التي يمكن تغطيتها كبير بسبب الاستجابة الخطية لإشارات الرنين المغناطيسي النووي ، على الرغم من أن المستقلبات التي تحدث بتركيزات منخفضة للغاية قد يكون من الصعب اكتشافها. بالنسبة للمركبات الأقل وفرة ، قد تكون طريقة قياس الطيف الكتلي عالية الحساسية مفيدة على الرغم من أن هذه التقنية تتطلب إجراءات إعداد عينات وقياس كمية أكثر تعقيدا من التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي. نقدم هنا بروتوكول الرنين المغناطيسي النووي المعدل لتحليل دماغ الفئران. ومع ذلك ، يمكن تطبيق نفس البروتوكول على الأنسجة الأخرى مع تعديلات طفيفة.

المقدمة

وقد استخدمت نماذج الفئران على نطاق واسع في أبحاث الدماغ 1. وقد تم التحقيق الارتباط الوراثي، النمط الظاهري في الماوس والفئران العقول من خلال دراسة التعبير الجيني في الحمض النووي الريبي و / أو مستويات البروتين من جهة، والظواهر المورفولوجية والوظيفية، الكهربية و / أو السلوكية على الآخرين 2-6. ومع ذلك، لنفهم تماما الآليات التي تربط بين النمط الظاهري إلى التركيب الوراثي، لا بد من التحقيق في الأحداث الجزيئية المصب التعبير بروتين، مثال. عملية التمثيل الغذائي للركائز البيوكيميائية التي تعمل على الانزيمات 7. هذا الشرط أدى، على مدى 10 إلى 15 سنة الماضية، إلى نهضة أبحاث الأيض في العديد من فروع علم الأحياء 8،9. بينما غالبا ما تركز الدراسات الأيضية الكلاسيكية على تفاصيل مسارات محددة، ويهدف النهج الجديد metabolomic نحو تحقيق شامل للوضع العالمي الأيض الأنسجة قيد النظر.واحد نتيجة لهذا المفهوم هو حاجة واضحة لالأدوات التحليلية التي تقلل من التحيز نحو مسارات و / أو فئات معينة من المركبات الأيضية. ومع ذلك، يستند مقايسة البيوكيميائية الكلاسيكية على تفاعل كيميائي معين من تحليلها محددة التي تحتاج إلى أن تكون محددة قبل إجراء الفحص. على النقيض من ذلك، تعتمد التقنيات الطيفية مثل الرنين المغناطيسي النووي (NMR) مطياف ومطياف الكتلة (MS) (ط) على وجه الخصوص الجزيئية (المادية) الخصائص من المركبات الكيميائية الحيوية، كل منها يؤدي إلى واحد أو عدة إشارات متميزة في الطيف الكشف في سياق تجربة واحدة؛ و (ثانيا) كشف عدد كبير من مركبات مختلفة في التجربة.

وهكذا، كل الطيف يحتوي على معلومات مشتركة من مجموعة كاملة من نواتج الأيض. لهذا السبب، الطرق الطيفية هي الأدوات المناسبة لالايض، كما لا يحتاج إلى اختيار قبل أن تتخذ بشأن طبيعة الحليلة المراد قياسها 8 . ونتيجة لذلك، هذه التقنيات بشكل طبيعي تصلح لدراسات استكشافية لأنها تسهل كثيرا الكشف عن التغيرات الأيضية غير متوقعة.

على الرغم من أن التحليل الطيفي NMR MS ويمكن أن تستخدم بالتبادل لتحليل العديد من نواتج الأيض، كل طريقة يمتلك مزايا وعيوب التي تم استعراضها مؤخرا 10 محددة. باختصار، يمكن عادة NMR الطيفي أن يؤديها من استخراج النفط الخام و لا يتطلب الفصل الكروماتوغرافي لمركبات العينة قبل التحليل. على النقيض من ذلك، تعمل بالغاز أو MS اللوني السائل (GC أو LC) فصل، باستثناء معينة التطورات الأخيرة مثل التصوير الطيف الكتلي. في بعض الحالات الخاصة مثل تحليل السكريات، قد تصبح فصل LC ضرورة لNMR الطيفي كذلك، لأن خطوط صدى من السكريات المختلفة تتداخل بشكل كبير في بروتون (H 1) NMR الأطياف. ومع ذلك، 1 H NMR الطيفي دون مركز حقوق الإنسانيبقى الفصل omatographic الأكثر شعبية، تقريبا التطبيقية عالميا طريقة NMR metabolomic. عموما، وإعداد العينات هو أكثر تستغرق وقتا طويلا ومعقدا لMS مما هو عليه لNMR الطيفي. مشاكل خطيرة بسبب الآثار مصفوفة هي أقل شيوعا بكثير في NMR الطيفي في MS من حيث أنها قد تؤدي إلى إشارات الموهنة كبير. ويمكن تحقيق المستقلب الكميات إما الأسلوب. ومع ذلك، هناك حاجة إلى مركبات متعددة لمعيار MS بسبب الاختلافات في الآثار مصفوفة والكفاءة التأين بين نواتج الأيض. على النقيض من ذلك، هناك حاجة إلى معيار واحد فقط لكل عينة للتحليل الطيفي NMR لأنه في ظل الظروف القياس المناسبة، والأسلوب الأخير هو جوهريا بفضل الكمية لاستجابة NMR الخطية بدقة نواة لوحظ. والعيب الرئيسي هو من NMR لها حساسية منخفضة نسبيا. MS، ولا سيما LC-MS، هو أكثر حساسية من NMR عدة أوامر من حجمها؛ لهذا السبب، MS هو أن يفضل على NMR للتحليل المركبات التي تحدث في تركيزات منخفضة للغاية. من ناحية أخرى، فإن الطبيعة غير تدميري التجربة NMR هي ميزة واضحة على MS. بهذه الطريقة، NMR يمكن القيام بها مرارا وتكرارا على نفس العينة، على سبيل المثال، لمختلف نوى-NMR النشطة مثل 1 H، الفوسفور-31 (31 P)، الكربون 13 (C 13)، الفلور-19 (19 F) الخ، كما لا يتم استهلاك المواد بواسطة NMR خلافا لقياسات MS.

كلا NMR وMS يمكن استخدامها في أوضاع مختلفة، كل واحد يجري الأمثل للكشف عن مركبات ذات خصائص كيميائية معينة. على سبيل المثال، 31 P NMR غالبا ما يكون أكثر ملاءمة من 1 H NMR لتحليل المركبات فسفرته بتركيز معتدل، على الرغم من نواتج الأيض تقريبا كل فسفرته تحتوي أيضا على بروتونات. ومع ذلك، قد يكون غامضا من 1 إشارات H NMR بحلول 1 H NMR إشارات من المركبات الأخرى، غير فسفرته، في حين أن الأخيرةبالطبع لا تسبب إشارات خلفية في 31 P NMR الأطياف. في الوضع التمثيلي، 19 F تحليل NMR هو أن المفضل للمركبات المفلورة، على سبيل المثال، والمخدرات المفلورة (لا توجد اشارات الخلفية من نواتج الأيض الذاتية)، في حين أن حالة خاصة من 13 C NMR ذات أهمية على وجه الحصر تقريبا إذا كان مصير 13 ج السلائف الأيضية الخارجية المسمى يحتاج إلى أن يتبع، بسبب وفرة الطبيعية منخفضة للغاية من النظير 13 C (حوالي 1٪). العديد من الطيف الجماعية تعمل إما في وضع الأيونات السالبة أو وضع ايون ايجابية. ولذلك، فمن المهم أن نعرف قبل تحليل ما إذا كانت أيونات التي يتعين مراعاتها واتهم سلبا أو إيجابا. نركز هنا على بروتوكول للتحليل metabolome أنسجة المخ بنسبة 1 H و 31 P NMR الطيفي لأن هذا الأسلوب ينتج عدد كبير من تركيزات المستقلب مهمة بتكلفة منخفضة من حيث (ط) الوقت اللازم لإعداد عينة لالثانية (ب) الجهد المطلوب لالمستقلب الكميات. جميع التجارب يمكن القيام بها باستخدام معدات مختبر الكيمياء الرطبة القياسية ومنشأة NMR الطيفي عالية الدقة. يتم وصف متطلبات إضافية في القسم بروتوكول أدناه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: الحيوان الأخلاق بيان
وجاءت الدراسات على الحيوانات على الفئران المبادئ التوجيهية صالحة في فرنسا، وتمت الموافقة من قبل اللجنة المحلية الأخلاق (# 40.04، جامعة إيكس مرسيليا مدرسة الطبية، مارسيليا، فرنسا).

1. حصاد وتجميد الدماغ الجرذ

  1. إعداد المواد المطلوبة: النيتروجين السائل (N 2liq.) في ديوار التي هي كبيرة بما يكفي للحفاظ على المشبك تجميد (على الأقل 2-3 حجم L). مخدر (على سبيل المثال، الأيزوفلورين، أو الكيتامين / زيلازين). غرفة التخدير. أدوات تشريح معقمة: مقص جراحي، مشرط، ملقط. مناديل الأنسجة وتنظيف زجاجة مع الكحول (الإيثانول). الإبر (25 G). 1 مل و 10 مل المحاقن. صفائح الألومنيوم التسمية (حوالي 10 × 10 سم) مع شريط لاصق. استخدام ورقة التفاف الفردية أدمغة الفئران تجميد فرضت.
    ملاحظة: دائما ارتداء قفازات واقية ونظارات حماية العين أو قناع عند التعامل مع النيتروجين السائل!
  2. ملء ديوار مع N 2liq. ومكان مجاناالمشبك زينغ في ديوار. تأكد من أن كمية N 2liq في ديوار يكفي لتكرار إجراءات تجميد المشبك (عدة لترات، وكمية من N 2liq تبخر خلال تجميد كل لقط يعتمد على حجم المشبك).
  3. تخدير الحيوانات (على سبيل المثال، من خلال الأيزوفلورين، أو عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين / زيلازين خليط). الشروع في القتل الرحيم من ثقب في القلب لمنع النزيف عند إزالة فروة الرأس وفتح الجمجمة. خطوات 1،4-1،7 أدناه وصف هذا الإجراء القياسي.
    ملاحظة: في بروتوكولات خاصة تتطلب الحفاظ على أقصى قدر من الجلوكوز والطاقة العالية الأيض، الفئران التضحية من دماغ الحيوان تخدير مع N-تجميد قمع 2liq 11 بعد التراجع من فروة الرأس. ثم، تشريح الدماغ من الجمجمة تحت متقطعة N 2liq لتقليل الأيض بعد الوفاة 12.
  4. بلل رئيس الفئران مع الكحول التنظيف. استخدام مقص جراحي إلى (ط) REMاوفه فروة الرأس، و (ب) الجمجمة مفتوحة على طول الغرز في الجمجمة.
  5. استخدام ملقط لفتح الجمجمة أبعد من ذلك، وإزالة المخ بأكمله من تحت الجمجمة مفتوحة، وتحديد المواقع رئيس رأسا على عقب. بسرعة إزالة أي آثار مرئية من الدم باستخدام مناديل الأنسجة. إذا نصفي الدماغ هي عملية الأيض ومتماثل شكليا، وأنها مريحة لاستخدام واحد من نصفي الكرة الأرضية لتحليل الأيض بعد فصله من نصف الكرة الأخرى عن طريق شق مع مشرط. إذا لزم الأمر، استخدم نصف الكرة المتبقية للدراسات الدماغ الأخرى مثل الأنسجة.
  6. بسرعة إزالة تجميد المشبك من N 2liq -تعبئة ديوار، ضع كامل أو نصف دماغ الفئران على سطح واحد داخلي، المشبك، وعلى الفور تجميد إدراج المشبك إلى N 2liq -تعبئة ديوار في حين عقد المشبك ضغط بحزم. ضمان أن الخطوات 1.3-1.6 اتخاذ أي أطول من 60 ثانية.
  7. بعد 1-2 دقيقة إزالة تجميد المشبك من ديوار، المشبك مفتوح، وتخفيف أنسجة المخ المجمدة من المشبك، والتفافالأنسجة المجمدة في ورقة الألمنيوم وصفت بشكل مناسب (انظر 1.1 أعلاه). تأكد من أن التسمية مقروءة ويبقى ثابتا في مكانه بعد ملفوفة العينة. وضع عينة بسرعة ملفوفة في N 2liq. تنفيذ الإجراء بأكمله في أسرع وقت ممكن لتجنب ذوبان أنسجة المخ المجمدة.
  8. تخزين العينات المجمدة في 2liq N أو في الثلاجة عند -80 درجة مئوية حتى استخراج المستقلب.
    ملاحظة: كلما عينة بيولوجية هي ليتم تخزينها لأكثر من سنة واحدة، والتخزين في درجة حرارة N 2liq هو أن يفضل على -80 درجة مئوية. هذا ينطبق أيضا على ما تبقى من هذا البروتوكول.

2. إعداد المستقلب استخراج الداخلي

  1. إعداد الخالط الأنسجة ومطابقة أنابيب الاختبار (على سبيل المثال، 10 مم القطر الداخلي، اعتمادا على القطر من رمح الخالط، عادة ما تكون مصنوعة من البلاستيك). استخدام المجانسة الكهربائية بدلا من المجانسة مدفوعة يدويا (المطاحن الأنسجة). قبلحلج vortexer والتوازن المختبر.
  2. إعداد دلو مملوء الثلج المجروش. إبقاء quantitites كافية من الميثانول، والكلوروفورم والماء على الجليد (4 مل في كل 250-350 ملغ أنسجة المخ المجمدة).
  3. إعداد الماصات نقل وقوارير.
    1. إعداد قارورة زجاج (≥20 حجم مل) مع قبعات المسمار ومكان على الجليد (واحد لكل قنينة استخراج الأنسجة). المسمار قبعات مناسبة مع تفلون حواجز مقاومة للالكلوروفورم.
    2. إعداد 5 مل الماصات البلاستيكية لتوزيع الميثانول والمياه، والماصات الزجاج أو المحاقن هاميلتون للاستغناء الكلوروفورم. إعداد الماصات البلاستيكية إضافية (5 أو 10 حجم مل) لنقل خليط من جناسة الأنسجة والميثانول.
    3. تأكد من شطف جميع الأواني الزجاجية جيدا بالماء المقطر وتجفف بعناية قبل الاستخدام لإزالة آثار الشوائب، ولا سيما فورمات NMR للكشف وخلات.
  4. ملء هاون الخزف مع N 2liq، مكان الخزف في مدقة الهاون وإعادة ملء مع 2L Nالذكاء. سوف النيتروجين تتبخر حتى درجة حرارة هاون ومدقة منخفضة بما فيه الكفاية. إبقاء كمية صغيرة من N 2liq في الهاون.

3. استخراج الأيضية

  1. إزالة عينة من أنسجة المخ المجمدة التخزين (N خزان 2liq أو الفريزر -80 درجة مئوية). ثم، ونقل على الفور عينة الأنسجة لالهاون مملوءة جزئيا مع N 2liq.
  2. استخدام N 2liq مدقة -cold لكسر أنسجة المخ إلى أجزاء أصغر المجمدة التي تناسب بسهولة في أنابيب اختبار تستخدم لتجانس الأنسجة. لمنع قطع من الأنسجة المجمدة من أن المتوقع من هاون في عملية وتفتيت النسيج في حين لا يزال يجري ملفوفة في ورقة الألمنيوم. لا طحن الأنسجة المجمدة إلى مسحوق وهذا من شأنه أن يجعل نقل إلى أنبوب اختبار أكثر صعوبة (زيادة خطر تكثيف الماء). هام: خلال الإجراء بأكمله، إضافة إلى N 2liq هاون حسب الحاجة للحفاظ على عينة عمق المجمدة.
  3. مزيج ققطع مول أنسجة المخ المجمدة تماما، تزن من 250-350 ملغ ونقل إلى أنبوب اختبار مليئة الميثانول الجليد الباردة (4 مل لأنسجة المخ 250-350 ملغ). تضاف في كل مرة قطعة من الأنسجة المجمدة، وهذه التجانس على الفور مع الخالط الأنسجة.
    ملاحظة: إكمال هذا الإجراء بأكمله بسرعة لتجنب (ط) التكثيف كبيرة من المياه على العينة التي من شأنها أن تؤدي إلى المبالغة في تقدير وزن العينة، و (ثانيا) التدفئة وذوبان الجليد من العينة. يجب أن تكون قطعة نسيج الفردية في حالة تجمد في بداية عملية التجانس.
  4. بعد تمت إضافة آخر قطعة من العينة دماغ الفئران المجمدة إلى أنبوب اختبار والمتجانس، ونقل جناسة إلى ≥20 مل قارورة زجاجية حجم، على مقربة سقف المسمار واسمحوا الوقوف على الجليد لمدة 15 دقيقة. إذا كان حجم أنبوب الاختبار ليست كبيرة بما فيه الكفاية ل≥4 مل الميثانول، واستخدام حجم أصغر الميثانول إلى التجانس جزء من أنسجة المخ المجمدة، ونقل الخليط إلىتستمر زجاج القارورة والمجانسة قطع الأنسجة المتبقية مع الميثانول النقي. تأكد من إجمالي حجم الميثانول هو 4 مل لكل 250-350 ملغ أنسجة المخ.
  5. إضافة نفس الحجم من الجليد الباردة الكلوروفورم (أي 4 مل لكل أنسجة المخ 250-350 ملغ) لجناسة، دوامة بدقة واسمحوا الوقوف على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: دائما استخدام التهوية غطاء الكيميائية عند التعامل مع المذيبات المتطايرة، وخاصة الكلوروفورم!
  6. إضافة نفس حجم الماء (أي 4 مل لكل أنسجة المخ 250-350 ملغ) لجناسة، دوامة بدقة واسمحوا الوقوف في -20 درجة مئوية خلال الليل.

4. إعداد فصل المرحلة وتبخر المذيبات

  1. إعداد أجهزة الطرد المركزي الباردة (4 درجات مئوية، 13،000 XG في أقصى نصف قطر) وأنابيب الطرد المركزي. تأكد من أن الأخيرة هي ≥20 حجم مل، ومقاومة للالكلوروفورم، ويمكن أن تحمل القوى النابذة من 13،000 ز س. استخدام أنابيب زجاجية مخصصة الطرد المركزي ولكن شطف (كما كل الزجاج وير) مع الماء المقطر يكوناستخدام الصدارة (انظر 2.3).
  2. إعداد تشطف جيدا الماصات الزجاج باستور وpropipettor الاقتضاء (لمبة، دليل مضخة ماصة، ماصة المساعدات التلقائي / pipettor، الخ).
  3. إعداد أنبوبين إضافية تشطف جيدا (≥15 حجم مل) لكل عينة الدماغ، واحدة منها يجب أن تكون مقاومة للالكلوروفورم (مصنوعة من الزجاج أو التيفلون)، والآخر إلى الميثانول (مصنوعة من مقاومة للميثانول، أو الزجاج البلاستيك).
  4. إعداد جهاز تبخر المذيبات (متوفر تجاريا أو homebuilt). تأكد من أن هذا الجهاز يوفر تيار تسيطر بدقة من غاز النيتروجين الجاف التي يتم توجيهها على سطح حلا استخراج تحتوي على المذيبات المتطايرة (الميثانول، والكلوروفورم).
  5. إعداد اثنين من الصواني إضافية أو دلاء مملوءة الجليد: واحدة لنقل العينات على الجليد، وآخر لحفظ عينات الباردة أثناء عملية التبخر.
  6. إعداد مجفاد (مجفف بالتجميد) والمواد اللازمة لتجفيد: (ط) واحد 50مل أنبوب الطرد المركزي أو فراغ قارورة جولة القاع في استخراج، و (ثانيا) N 2liq لتجميد المرحلة المائية من عينات (L ≤0.3 لكل عينة). إذا تم استخدام أنبوب الطرد المركزي، أيضا بإعداد واسعة عنق الزجاجة فلتر فراغ مناسبة لمجفاد.

5. المرحلة الانفصال وتبخر المذيبات

  1. لفصل كامل المرحلة، ونقل الأنسجة جناسة الميثانول / الكلوروفورم / المياه / الدماغ (انظر 3.6) إلى أنبوب الطرد المركزي مقاومة للالكلوروفورم (حجم ≥20 مل) وأجهزة الطرد المركزي في 13،000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
    ملاحظة: سوف تشكل مرحلتين يفصل بينهما طبقة من البروتين عجلت. تتكون (أثقل) المرحلة الدنيا من الميثانول، والكلوروفورم والدهون الذائبة، في حين أن (أخف) المرحلة العليا تتكون من الماء والميثانول والأيض للذوبان في الماء المذاب.
  2. استخدام ماصة باستور لنقل المرحلة العليا لمناسبة ≥15 مل أنبوب (مقاومة للالميثانول البلاستيك أو الزجاج). الحفاظ على طم.
  3. استخدام ماصة باستور جديدة لنقل المرحلة السفلى لأنبوب ≥15 مل المناسب (الزجاج أو التيفلون). الحفاظ على الجليد.
  4. تخزين طبقة من البروتين عجلت في -80 درجة مئوية إذا كان ذلك لاستخدامها لتحديد البروتين الكلي. أو تجاهل آخر.
  5. الحفاظ على أنبوب مع المرحلة الثلج / الميثانول (انظر 5.2) على الجليد وتتبخر الميثانول من خلال توجيه تيار النيتروجين الجاف على سطح الحل استخراج. بدلا من ذلك، بلطف النيتروجين فقاعة من خلال الحل استخراج. إنهاء عملية التبخر عندما فقاعات النيتروجين لم يعد يؤدي تخفيض حجم في الحل استخراج. في هذا الوقت، تواصل مع تجفيد (انظر 5.7)، أو تجميد والحفاظ على العينة في -80 درجة مئوية مع أنبوب مغلق (سقف المسمار أو Parafilm) لتصبح جاهزة للتجفيد.
  6. وضع أنبوب مع المرحلة الميثانول / الكلوروفورم (انظر 5.3) على الجليد وتتبخر الميثانول من خلال توجيه تيار النيتروجين الجاف على سوrface من الحل استخراج. عندما يبخر المذيب جميع، إنهاء العملية والحفاظ على العينة في -80 درجة مئوية مع أنبوب مغلق (سقف المسمار أو Parafilm) لتصبح جاهزة للتحليل NMR.
  7. إعداد المرحلة المائية لتجفيد
    1. بعد انتهاء عملية تبخر الميثانول (انظر 5.5)، ونقل العينة إلى تشطف جيدا أنبوب 50 مل الطرد المركزي (إذا كان يتم تجميد العينة، ذوبان الجليد قبل نقل). بدلا من ذلك، ونقل إلى فراغ قارورة جولة القاع.
    2. تجميد استخراج حل عن طريق تناوب أنبوب الطرد المركزي (أو مستديرة قاع القارورة) إدراجها جزئيا في N 2liq مثل أن السطح الداخلي للأنبوب أو قارورة تغطي تدريجيا من السائل المجمد. تأكد من عدم N 2liq. يمكن أن تدخل في وعاء.
    3. عندما يتم تجميد كل السائل، تغطية أنبوب مع غطاء ثقب المسمار أو غطاء للسماح للبخار من الفرار، ووضع أنبوب في زجاجة فلتر فراغ واسعة الرقبة.
    4. بدء تجفيد بعد عطاتشينغ قارورة أو زجاجة إلى مجفف التجميد.
  8. إنهاء عملية تجفيد عندما العينة جافة تماما. تبقي العينة في -80 درجة مئوية في أنبوب مغلق (مع غطاء ضيق!) حتى استخدامها لتحليل NMR.
    وهناك حاجة عادة لا تزيد عن 24 ساعة لتجفيد: ملاحظة. يمكن مجفف بالتجميد عدة عينات في وقت واحد، اعتمادا على تصميم مجفاد، وحول ما إذا كان يتم استخدام أنابيب الطرد المركزي في زجاجات واسعة الرقبة أو أسفل قوارير مستديرة.

6. إعداد العينات NMR

  1. متجر المجففة ومقتطفات مجفف بالتجميد في درجة حرارة منخفضة جدا (≤-80 ° C). إعادة حل lyophilizates لإعداد عينات NMR NMR فورا قبل التجربة.
    ملاحظة: تخزين العينات في محلول و / أو درجة حرارة الغرفة القريب قد يؤدي إلى تدهور عينة!
  2. إعداد مائي 200 ملي حل عامل خالب، حمض العابرة لل1،2-cyclohexyldiaminetetraacetic (CDTA)، على النحو التالي:
    1. يضاف الماء النقي (على سبيل المثال، 20 مل) إلى أنبوب اختبار أو أنبوب الطرد المركزي، وإضافة كمية من مسحوق CDTA الضروري لتوليد ملي حل 200.
      ملاحظة: وهناك نسبة كبيرة من CDTA لا تكون قابلة للذوبان، لأن درجة الحموضة منخفضة جدا منذ أن تم استخدام الحمض من CDTA بدلا من الملح CDTA.
    2. إضافة بعناية، خطوة خطوة، وزيادة كميات من مسحوق CsOH إلى حل CDTA، ودوامة جيدا بعد كل إضافة.
      ملاحظة: سيتم CDTA ذوبان جزء زيادة مع زيادة محتوى CsOH في محلول مائي. تجنب "overtitration"، أي أقل من إضافة كمية متكافئة من CsOH إلى حل CDTA.
    3. عندما تم حل ما يقرب من جميع مسحوق CDTA، بدء قياس درجة الحموضة بعد كل إضافة CsOH vortexing لوشامل. إنهاء CsOH بالإضافة عند الوصول إلى درجة الحموضة النهائية (الجدول 1).
      ملاحظة: في هذا الوقت، سيتم حل جميع CDTA. استخدام جيم + باعتباره counterion إلى CDTA هو GENERفضل حليف على نا + أو K +. CS + هو حمض لويس لينة بسبب دائرة نصف قطرها كبير في الأيونية، بدلا من نا و+ K + التي لها أنصاف أقطار الأيونية هي أصغر والأحماض الصعبة. بالتالي، CS + أشكال المجمعات مع الفوسفات (القواعد الصلبة) أقل من القيام بسهولة ونا + K +. هذا هو مفيد ل31 P NMR الطيفي من نواتج الأيض فسفرته لcomplexation يميل إلى زيادة linewidths NMR، لا سيما في ظل ظروف بطيئة في التبادل الأيوني وسيطة.
  3. 31 P تحليل الدهون الفوسفاتية (PL) NMR، ويحل الدهون المجففة (انظر 5.6) في 700 ميكرولتر من خليط المذيبات تتألف من كلوروفورم بالديوتيريوم (اداه 3)، والميثانول والحل CDTA أعد كما هو موضح في 6.2 (5: 4: 1 نسبة حجم). نقل العينة إلى أنبوب microcentrifuge. استخدام التهجير المباشر (أو إيجابيا التشريد) micropipette مع كلوروفورم مقاومةنصائح النمل في كل الخطوات.
    ملاحظة: نضع في اعتبارنا أن تغيير أي من المعلمات التالية سوف تؤثر على مظهر (التحول الكيميائي وعرض الخط) من PL 31 P NMR الأطياف 13-17:
    (ط) نسبة حجم اداه 3: MeOH: CDTA الحل
    (ب) تستخدم إجمالي حجم المذيبات
    (ج) الرقم الهيدروجيني للعنصر مائي من المذيب
    (د) التركيز CDTA العنصر مائي من المذيب.
    ملاحظة: في العام، وصقل هذه المعلمات عينة (الجدول 1) ليست ضرورية، ويجب أن يتم تنفيذ مع الحذر الشديد إذا رغبت في حالات خاصة. تغيير نسبة حجم بين المذيبات يؤدي بسهولة في تشكيل نظام يتكون من مرحلتين بدلا من مرحلة واحدة متجانسة! تم العثور على نظام المرحلة الأولى لتكون أكثر عملية من النظام على مرحلتين في معظم التطبيقات 13،14.
  4. ل1 تحليل H NMR الأيض للذوبان في الماء، ويحل lyophilizate (انظر 5.8) في 700 ميكرولتر أكسيد الديوتيريوم (D 2 O) التي تحتوي على 3- (trimethylsilyl) البروبيونيك-2،2،3،3-D4 ملح الصوديوم حمض (TSPd 4) في نطاق millimolar (D 2 O تحتوي على 0.05٪ TSPd 4 متاح تجاريا) . نقل العينة إلى أنبوب microcentrifuge.
  5. ضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول مائي مما أدى استخراج إلى 7.3 بإضافة كميات صغيرة (حوالي 2 ميكرولتر) من كلوريد الديوتيريوم (DCL) وdeuteroxide الصوديوم (NaOD) الحلول. أولا، نبدأ مع 0.02 N DCL أو NaOD الحلول. إذا 2 أو 3 إضافات لاحقة لا تسبب تغيير درجة الحموضة كافية، مع مواصلة 0.2 N DCL أو NaOD الحلول. يجب الحرص على عدم overtitrate.
    ملاحظة: المبلغ الإجمالي من مختبر دبي المركزي أو NaOD الحل اللازمة تعتمد على كمية من أنسجة المخ المستخرج. ملاحظة هذه القيمة لدقة الكميات الأيض. في معظم الحالات يجب أن تكون وحدات تخزين مشتركة من مكتب الارتباط وأضاف NaOD حلول يذكر تقريبا (ما يقرب من 1٪ من حجم العينة NMR).
itle "> 7. أداء تجربة 31 P NMR لتحليل الدماغ الفوسفوليبيدية 13،14

  1. للحصول على أفضل النتائج، استخدم عالية الدقة مطياف الرنين النووي المغناطيسي متعدد النوى (≥9.4 تسلا قوة الحقل، الموافق 31 P 162 ميغاهيرتز، 400 ميغاهيرتز أو 1 ترددات الرنين H). إلى جانب لفائف 31 P، تأكد من أن 31 P NMR التحقيق يمتلك 1 H لفائف لفصل البروتون. وضع تنظيم درجة الحرارة من المسبار NMR إلى القيمة المستهدفة المطلوب (عادة 25 درجة مئوية).
    ملاحظة: مسبار درجة الحرارة قد تحتاج 10-20 دقيقة لتحقيق الاستقرار!
  2. الطرد المركزي PL استخراج الحل في أنبوب microcentrifuge (انظر 6.3) في 4 درجات مئوية و11،000 x ج لمدة 30 دقيقة لتدور أسفل مخلفات الصلبة في العينة. نقل 600 ميكرولتر من طاف لأنبوب NMR عالية الجودة (5 ملم القطر الخارجي).
  3. إعداد المناسب الجذعية إدراج المحورية شغل مائي مع 20 ملي methylenediphosphonate (MDP) حل في درجة الحموضة 7.0 ل كيميائية تحول المرجعيةوالكميات. وضع هذا إدراج في أنبوب NMR مليئة استخراج PL الحل.
  4. تناسب أنبوب NMR مع الدوار والنقل المناسب إلى المغناطيس NMR. الآن تدور العينة في 15-20 هرتز والانتظار حتى تعديل العينة إلى درجة حرارة مجموعة (حوالي 10 دقيقة).
  5. تقليل بعناية التجانس الحقل المغنطيسي عبر عينة عن طريق تعديل على محور وخارج المحور التيارات فائف الرقائق 18.
  6. تعيين المعلمات NMR الطيف لاكتساب القيم المثلى، والتي قد تختلف بوصفها وظيفة من قوة المجال المغناطيس (لنظام 9.4 T، انظر الجدول رقم 1 للقيم المعلمة مستحسن).
  7. تعيين عدد من العابرين في التجربة (= NS).
    1. تعيين NS إلى حوالي 80 (المدة الإجمالية لجمع البيانات حوالي 20 دقيقة) فقط إذا الثابتة والمتنقلة الأكثر انتشارا هي أن quantitated بدقة (فسفاتيديل (PtdCho)، فسفاتيديل إيثانولامين (PtdEtn)، إيثانولامين بلازمالوجين).
    2. تعيين NS إلى حوالي 100-200 (المدة الإجمالية دإذا الثابتة والمتنقلة أقل تركيزا أن تكون quantitated اكتساب آتا 1-2 ساعة) (ألكيل-أسيل-فسفاتيديل، فوسفتيدلينوستول، فسفاتيديل، حمض الفسفاتيديك).
    3. تعيين NS إلى حوالي 1،500-2،000 (المدة الإجمالية لجمع البيانات 7-10 ساعة، التجربة بين عشية وضحاها) إذا الثابتة والمتنقلة قليلة جدا التركيز هي أن quantitated، مثل أحادية فوسفتيدلينوستول وdiphosphates (PtdIP وPtdIP 2)، كارديوليين، lyso، الثابتة والمتنقلة ، ألكيل أسيل-فسفاتيديل إيثانولامين، وأحيانا غيرها.
  8. بعد انتهاء اكتساب الطيف، عملية خالية تسوس التحريض (ااا) باستخدام معلمات الأمثل. قيم هذه المعايير تختلف بوصفها وظيفة من قوة الحقل المغنطيسي، جودة الرقاقة، وإشارة إلى أن PL كميا.
    1. للحصول على أفضل النتائج لمجموعة كاملة من الثابتة والمتنقلة، وتكرار المعالجة باستخدام متعددة (اثنين على الأقل) إجراءات التصفية مختلفة. استخدام قرار تعزيز قوي للإشارات متداخلة بقوة، على سبيل المثال، لPtdCho وPtdEtnالمناطق.
    2. استخدام تصفية قوية (ضعيفة أو معدومة قرار تعزيز) للإشارات ضعيفة.
    3. تصفية إشارات ضعيفة جدا وواسعة دون تداخل كبير من apodization (على سبيل المثال، LB = 3 هرتز) لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، مثل PtdIP وPtdIP 2. انظر الجدول رقم 1 لتجهيز المعلمات مميزة.
  9. تحديد مساحة كل إشارة PL فيما يتعلق المنطقة تحت إشارة من مجمع المرجعية (MDP) في نفس الطيف.
  10. معايرة إشارة من مجمع المرجعية (MDP) في تجربة منفصلة، ​​وذلك باستخدام 5 ملم أنبوب NMR مليئة (ط) وهو مركب من تركيز الفوسفور معروفة، و (ب) نفس محوري إدراج الجذعية المستخدمة في التجارب P PL 31 NMR ( نرى 7.3 و 7.9).
  11. حساب تركيزات PL الفردية على أساس المناطق النسبية إشارات PL من جهة (انظر 7.9)، وحصلت على قيمة المعايرة لMDP منإدراج المحورية من جهة أخرى (انظر 7.10). تأخذ في الاعتبار أن عدد النوى الفوسفور المساهمة في إشارة معينة 31 P NMR قد تختلف بوصفها وظيفة من أصل الجزيئي لتلك الاشارة.
    ملاحظة: إشارة فسفونات MDP (المشار إليها عادة إلى 19.39 جزء من المليون) تمثل نواتين الفوسفور، كما يفعل إشارة كارديوليين الفوسفات. كل الإشارات NMR PL 31 P أخرى اكتشفت في مقتطفات الدماغ تمثل نواة الفسفور واحد لكل منهما.
  12. استخدام البرمجيات إحصاءات حسب الحاجة لمقارنة مستويات الدماغ PL بين مجموعات من الحيوانات.

8. أداء تجربة 1 H NMR لتحليل استقلاب الدماغ للذوبان في الماء

  1. وضع تنظيم درجة الحرارة من المسبار 1 H NMR لقيمة الهدف المطلوب (عادة 25 درجة مئوية). تصريحات انظر أيضا 7.1.
  2. أجهزة الطرد المركزي الحل المستخلص المائي في أنبوب microcentrifuge (انظر 6.5) في 4 درجات مئوية و11،000x ج لمدة 30 دقيقة لتدور أسفل مخلفات الصلبة في العينة. نقل 600 ميكرولتر من طاف لأنبوب NMR عالية الجودة (5 ملم القطر الخارجي).
  3. نقل NMR NMR أنبوب إلى المغناطيس، ووضع الرقائق NMR الطيف المعلمات لاكتساب القيم المثلى كما هو موضح في 7،4-7،6. انظر أيضا الجدول 1 للقيم المعلمة الموصى بها.
  4. تعيين عدد من العابرين في التجربة إلى حوالي NS = 32 (المدة الإجمالية من الحصول على البيانات حوالي 13 دقيقة). للحصول على نسب جيدة إشارة إلى الضجيج لإشارات ضعيفة جدا، ولا سيما في المنطقة العطرية، استخدم NS = 64 (المدة الإجمالية من الحصول على البيانات حوالي 26 دقيقة) أو أكثر.
  5. بعد انتهاء اكتساب الطيف، عملية خالية تسوس التحريض (ااا) باستخدام معلمات الأمثل. قيم هذه المعايير تختلف قليلا بوصفها وظيفة من قوة مغناطيسية المجال، جودة الرقاقة، وإشارة إلى أن المستقلب كميا.
    ملاحظة: في معظم الحالات، يكفي لمعالجة كل الطيف مرة واحدةوتوظف مجموعة من المعلمات معالجة تقديم حلا وسطا جيدا لجميع إشارات الأيض. انظر الجدول رقم 1 لتجهيز المعلمات مميزة.
  6. تحديد مساحة كل إشارة الأيض (غالبا ما تكون multiplet، وتداخل أحيانا مع singlets أو multiplets الأخرى الناجمة عن جزيئات مختلفة) فيما يتعلق المنطقة تحت إشارة من مجمع المرجعية (TSP-4 د) في نفس الطيف.
  7. حساب تركيزات المستقلب الفردية على أساس TSP-4 د تركيز (انظر 6.4). تأخذ في الاعتبار أن عدد البروتونات المساهمة في إشارة معينة 1 H NMR قد تختلف بوصفها وظيفة من أصل الجزيئي لتلك الاشارة. إشارة ثلاثي ميثيل TSP-4 د (الإشارة إلى 0.0 جزء في المليون) تمثل تسعة البروتونات.
  8. استخدام البرمجيات إحصاءات حسب الحاجة لمقارنة مستويات الأيض في المخ بين مجموعات من الحيوانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

للحصول على أفضل قرار في أطياف الرنين المغناطيسي للدماغ الأيض ومقتطفات الأنسجة الأخرى، فقد كان منذ فترة طويلة ممارسة شائعة لإزالة أو الأيونات المعدنية قناع (الأهم: أيونات ممغطس) موجودة في استخراج الحلول. وقد تحقق ذلك إما بإضافة عامل خالب مثل EDTA أو CDTA إلى استخراج 19، أو عن طريق تمرير مستخلص من خلال راتنج التبادل الأيوني مثل Chelex-100 20. النتائج المقدمة في الشكل 1 تثبت أن هذه الخطوة ليست ضرورية ل1 H NMR التحليل الطيفي إذا تم إعد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

NMR الطيفي هو وسيلة فعالة لقياس تركيزات المركبات الكيميائية في محلول بطريقة استنساخه جدا ودقيقة. ومع ذلك، للحصول على بيانات عالية الجودة من الضروري أن تلتزم قواعد معينة بشأن إعداد العينات وتحليلها. في تحديد تركيزات المستقلب بواسطة الرنين المغناطيسي الطيفي، ولا جيل ولا استقبال إشارة NMR يهيمن على خطأ الكميات، إلا شدة إشارة لوحظ اقتراب عتبة الكشف (إشارة ضعيفة بشكل خاص). في جميع الحالات الأخرى التغير البيولوجي، وتقنية إعداد العينات (كفاءة الاستخراج، والاستقرار المادي والكيميائي للمرك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

الدعم من قبل المركز الوطني للبحوث العلمية (CNRS و UMR 6612 و 7339) معترف به بامتنان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
IsofluraneVirbacVetfluraneمخدر للحيوانات
مبخر IsofluraneOhmedaIsotec 3أحدث نموذج متاح: Isotec 4
مشرط ، مقص ، ملقط ، مشابكهارفارد جهاز
فيشر Scientific		متنوعة
مختلف		المعدات الجراحية للحيوانات
أداة تجميدالمشبك محلية الصنعن / أملقط مع ألواح الألومنيوم ، يتم إدخالها
في النيتروجين السائل لتبريد
DewarNalgene4150-4000
سائل هواء النيتروجينالسائل N / A
غاز النيتروجينسائل الهواءN / A
مبخر النيتروجينOrganomation AssociatesN-EVAP 111يمكن استبداله بجهاز محلي
الصنع MortarSigma-AldrichZ247472
مدقةSigma-AldrichZ247510
مالطנס الأنسجةKinematicaPolytronمع أنابيب اختبار تركيب عمود الخالط
مقياس إلكترونيSartoriusn / a
ميثانولسيجما-ألدريتشM3641
كلوروفورمسيجما ألدريتش366910
أنابيب الطرد المركزي الزجاجيةKimble45500-15 ، 45500-30Kimax 15 مل ، أنبوب 30 مل
أنابيب الطرد المركزيالدقيق Kimble45150-2Kimax 2 ml أنبوب ؛ يجب استبدال أنبوب "Eppendorf" إذا كان متوافقا مع ماصات البوليسترين الدوارة للطرد
المركزي CostarCorningStripettes5 و 10 مل
DeuterochloroformSigma-Aldrich43191599.96٪ deuterated
أكسيد الديوتيريومسيجما ألدريتش42345999.96٪ ديوتيريد
كلوريد الديوتيريومألفا إيسار4240620٪ في أكسيد الديوتيريوم
ديوتروكسيد الصوديومسيجما ألدريتش16448830٪ في أكسيد الديوتيريوم
مجففالليوتيريوم كريستألفا 1-2
أجهزة الطرد المركزي الباردةHeraeusMegafuge 16R
مقياس الأس الهيدروجينيEutech CyberneticsCyberscan
CDTASigma-AldrichD0922
هيدروكسيد السيزيومSigma-Aldrich516988
أنابيب الرنين المغناطيسيWilmad528-PP
NMR الجذعية إدراج متحد المحورSigma-AldrichZ278513بواسطة Wilmad
ماصات الرنين المغناطيسيالنووي Sigma-AldrichZ255688
PipettesEppendorfResearchمع نصائح للأحجام من 0.5 إلى 1,000 مو ؛ ل
Pipet-AidDrummondXP
مطياف NMRBrukerAVANCE 400بما في ذلك المسبار والملحقات الأخرى
برنامج الرنين المغناطيسيالنووي BrukerTopSpin 1.3الإصدار الأحدث المتاح: Topspin 3.2
المركبات القياسية القابلة للذوبان في الماءSigma-Aldrichالمركبات
للفوسفوليبيدAvanti Polar Lipids
Doosan Serdary
Sigma-Aldrich		مختلف
مختلف
مصادر مختلفة		للبلازمالوجينات ، ولكن قد تكون < ؛ 70 - 80٪ نقاء
الميثيلين ديفوسفوناتسيجما ألدريتشM9508
TSP-d4سيجما ألدريتش269913
النووي القياسية المختلفة

المراجع

  1. Manger, P. R., et al. Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction. Front Neuroanat. 2, 5(2008).
  2. Buxbaum, J. D., et al. Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features. Mol Autism. 3, 1(2012).
  3. Papaioannou, V., Behringer, R. R. Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).
  4. Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).
  5. Mallolas, J., et al. A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke. The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).
  6. Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).
  7. Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model. PLoS ONE. 2, e157(2007).
  8. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. Methodologies for Metabolomics. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  9. Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E. Metabolomics in drug target discovery. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 235-246 (2011).
  10. Wishart, D. S. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  11. Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats. Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).
  12. Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel. NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).
  13. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution. Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).
  14. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation. Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).
  15. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Methodologies for Metabolomics. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  16. Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study. PLoS ONE. 8, e56101(2013).
  17. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy. Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).
  18. Pearson, G. A. Shimming an NMR magnet. , University of Iowa. Iowa City. (1991).
  19. Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. Biophysical tools for biologists. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).
  20. Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats. Stroke. 20, 633-640 (1989).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحليل Metabolomic من دماغ الفئران بواسطة عالية الدقة النووية الرنين المغناطيسي الطيفي مقتطفات من الأنسجة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.