في فيفو التصوير من داور محددة العصبية في إعادة عرض C. ايليجانس

ملخص

بعد التعرض لضغوط بيئية محددة ، تخضع الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans لدونة نمطية مظهرية واسعة النطاق للدخول في مرحلة الأحداث "dauer" المقاومة للإجهاد. نقدم طرقا للتحريض الخاضع للرصدة وتصوير المرونة العصبية أثناء الدوير.

الملخص

آليات السيطرة على الإجهاد الناجم عن المظهرية اللدونة في الحيوانات كثيرا ما تكون معقدة وصعبة للدراسة في الجسم الحي. والمثال الكلاسيكي من التوتر الناجم اللدونة هي المرحلة داور من C. ايليجانس. Dauers هي مرحلة اليرقات التنموية البديلة تشكلت في ظل ظروف تركيزات منخفضة من المواد الغذائية البكتيرية وتركيزات عالية من فرمون داور. عرض Dauers اللدونة التنموية والسلوكية واسعة النطاق. على سبيل المثال، مجموعة من أربعة رباعي الداخلية-شفوي (IL2Q) الخلايا العصبية تخضع لإعادة عكسها واسعة خلال تشكيل داور. الاستفادة من دخول مسارات بيئية تنظيم داور معروفة، وهي طريقة المحددة سابقا لإنتاج النفط الخام داور من فرمون على نطاق واسع الثقافات الخيطية السائلة ويتجلى. مع هذا الأسلوب، وهو تركيز 50،000 - 75،000 الديدان الخيطية / مل من ثقافة السائل كافية لإنتاج قوية للغاية داور الخام فرمون. رجولية فرمون الخام هي DETErmined من قبل الأحيائي الاستجابة للجرعة. وأخيرا، يتم وصف الأساليب المستخدمة لفي الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير من خلال تشكيل IL2Qs داور.

المقدمة

اللدونة المظهري، بما في ذلك اللدونة التنموية والسلوكية، مهم لعمليات التكيف مع الظروف البيئية المعاكسة وتعتبر قوة دافعة في التطور ^1. C. ايليجانس هو كائن نموذج كثيرا ما تستخدم للدراسات في التنمية وبيولوجيا الأعصاب. في ظل ظروف مثالية، C. ايليجانس يتطور من خلال أربع مراحل اليرقات قبل دخول المرحلة الإنجابية الكبار. ومع ذلك، في ظل ظروف انخفاض توافر الغذاء والكثافة السكانية العالية، C. ايليجانس يمكن أن يخضع لعملية التحول التنموي والدخول في معمرة ومقاومة للإجهاد مرحلة داور ^2. عرض Dauers العديد من الاختلافات الشكلية والسلوكية من غير dauers، والتي من المرجح توسط هذه المقاومة الإجهاد. كانت ....

البروتوكول

1. الخام داور إنتاج فرمون

1. تنمو OP50 E. القولونية من مستعمرة يا واحد / N عند 37 درجة مئوية في حين تهتز في 100 مل من مرق LB عند 200 دورة في الدقيقة. ملاحظة: يمكن إجراء هذا O / N ثقافة مسبقا وتخزينها في 4 درجات مئوية.
2. تنمو N2 C. ايليجانس في يونيو 15-20 سم أطباق بتري مع NGM أجار (انظر الوصفة في الجدول 1) المصنف مع 50 ميكرولتر من OP50 E. حتى البكتيريا القولونية يتم استنفاد ما يقرب من ^19.
3. جعل 5X 250 ....

النتائج

إنتاج النفط الخام النتائج داور فرمون في السائل الأصفر (الشكل 1) في آن معا الحرارة ومستقرة البارد. يتم تخزين aliquots من فرمون الخام عند -20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى دون أي خسارة واضحة في النشاط. بعد إنتاج فرمون، واحد الأحيائي الاستجابة للجرعة كافية لتقدير تقريبي للقوة. ومع ذلك، بالنسبة لمعظم التجارب من الضروري تكرار الأحيائي 2 - 3 مرات، وتأخذ في المتوسط ​​من كل تجربة. وتعطى نتائج ممثلة من اثنين من اختبارات بيولوجية فرمون في الشكل 3. من هذه البي.......

المناقشة

دراسة المرونة العصبية داور محددة وغيرها من التغيرات المورفولوجية المرتبطة داور يتطلب التحكم وتشكيل موثوق بها من dauers إما عن طريق طفرة جينية (أي داف المسوخ ج) أو عن طريق التعرض البرية من نوع الحيوانات لفرمون. في حين أن استخدام طفرة جينية للحث dauers مريحة، قد اربكت النتائج. لذلك البيانات التي تم جمعها مع داف ج الطفرات ينبغي تأكيد في وقت لاحق مع الحيوانات البرية من نوع يسببها لدخول مرحلة داور عن التعرض لداور فرمون.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
N2 C. elegans< / em> سلالة بريستول			علم الوراثة Caenorhabditis
PT2660 myIs13 [Pklp-6< / sub>:: gfp] III	عند الطلب من مختبر
PT2762 myIs14 [Pklp-6< / sub>:: gfp] V	عند الطلب من مختبر
JK2868 qIs56 [Plag-2< / sub>:: gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
أطباق بتري	Tritech Research	60 مم T3308 ، 35 مم T3501
NGM أجار	متنوعة		3 جم كلوريد الصوديوم ، 17 جم أجار ، 2.5 جم بيبتون في 975 مل H2< / sub>O معقمة مبردة إلى 55 درجة ؛ C متبوعا ب 1 مل من 5 مجم / مل من الكوليسترول في الإيثانول ، 25 مل من 1 M KPO4< / sub> عازلة (درجة الحموضة 6.0) ، 1 مل من 1 M CaCl 2< / sub> ، 1 مل من 1 M MgSO4< / sub>
S	S تتكون وسائط S المختلفة		من محلول قاعدي S (1.46 جم كلوريد الصوديوم ، 0.25 جم K2HPO4 ، 1.5 جم KH2PO4 ، 0.25 مل من 5 مجم / مل من الكوليسترول في الإيثانول و H2< / sub>O إلى 250 مل. أضف إلى المحلول القاعدي S 2.5 مل من سترات البوتاسيوم درجة الحموضة 6.0 (2 جم أحادي هيدرات حامض الستريك ، 29.4 جم ثلاثي سترات البوتاسيوم أحادي هيدرات < فرعي > ، < / فرعي > H 2< / sub >O إلى 100 مل ، معقم) ، 2.5 مل من محلول المعادن النادرة (1.86 جم EDTA ثنائي الصوديوم ، 0.69 جم FeSO4< / sub>  ؛ & 7 H2< / sub>O ، 0.2 جم MnCl2 & bull ؛ 4 H2O, 0.29 g ZnSO4  & 7 H2O, 0.025 g CuSO4  & 5 H2< / sub>O ، H2< / sub>O إلى 1 L. تعقيم وتخزينها في الظلام) ، 0.75 مل من 1 M CaCl 2< / sub> ، و 0.75 مل من 1 M MgSO4< / sub>.
لوحات فرمون داور لفحص الجرعة والاستجابة	مزيج مختلف		0.085 جم أجار نوبل ، 0.5 مل من 0.513 م كلوريد الصوديوم و 5 & مايكرو ؛ لتر من 5 مجم / مل من الكوليسترول المذاب في الإيثانول في كل من أنابيب الثقافة 6 × 15 مل. أضف ما يكفي من الفرمون الخام إلى كل أنبوب لإنشاء مجموعة من التركيزات. أضف H2O لرفع الحجم إلى 4.725 ml. يغلي فوق موقد بنسن حتى يذوب الأجار ثم يبرد إلى 55 درجة مئوية. أضف 125 ميكرو ؛ ل 1 M KPO4< / sub> عازلة (درجة الحموضة 6.0), 50 & micro; ل 0.1 م CaCl 2 < / sub > ، 50 & micro ؛ ل 0.1 م MgSO4< / sub> و 50 & micro; ل من 5 مجم / مل كبريتات الستربتومايسين لكل أنبوب. صب محتويات كل أنبوب في طبق بتري بقطر 35 مم. دع الأجار يتصلب في درجة حرارة الغرفة طوال الليل (إذا كان لفترة أطول ، احفظه في وعاء مغلق لمنع الجفاف المفرط).
حبات الغلاف المجهري 0.1 ميكرون	Polysciences Inc.	00876-15
M9 مخزن	مؤقت مختلف		مزيج 3 جم كيه< ساب >2< / فرعي > PO < sub >4 < / sub > ، 6 جم Na 2 < / sub >HPO 4 < / sub > ، 5 جم كلوريد الصوديوم ، 1 مل 1 م MgSO4< / sub> ، H2< / sub>O إلى 1 لتر. التعقيم عن طريق التعقيم

مركز شرودرشرودر وسائط