يعد الحصول على صور مجهرية إلكترونية عالية الجودة أمرا صعبا ، خاصة في حالة الخلايا النباتية ، التي تحتوي على فجوات كبيرة مملوءة بالماء ومساحات جيدة التهوية. يقلل التجميد بالضغط العالي جنبا إلى جنب والاستبدال السريع للتجميد بشكل كبير من وقت تحضير عينات النبات ل TEM مع إنتاج عينات مع الحفاظ على البنية التحتية الممتازة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
جنبا إلى جنب تجميد الضغط العالي والسريع تجميد استبدال الأنسجة النباتية للنقل المجهر الإلكتروني
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
منذ 1940s انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) وقد تم توفير علماء الأحياء مع الصور فائقة الدقة من المواد البيولوجية. ومع ذلك، وبسبب البروتوكولات شاقة وتستغرق وقتا طويلا التي تتطلب أيضا خبرة في إعداد العينات خالية من القطع الأثرية، لا يعتبر TEM تقنية سهلة الاستخدام. إعداد نموذج التقليدي للTEM تستخدم مثبتات كيميائية للحفاظ على الهياكل الخلوية. الضغط العالي التجميد هو cryofixation العينات البيولوجية تحت الضغوط العالية لإنتاج معدلات التبريد سريعة جدا، مما يحد تشكيل الجليد، والتي تضر بسلامة التركيب الدقيق الخلوية. تجميد الضغط العالي واستبدال تجميد حاليا أساليب اختيار لإنتاج أعلى مستوى من الجودة في التشكل أقسام الراتنج لTEM. هذه الأساليب تقلل من القطع الأثرية التي ترتبط عادة مع المعالجة التقليدية للTEM المقاطع رقيقة. بعد cryofixation يتم استبدال المياه المجمدة في العينة مع السائلالمذيبات العضوية في درجات حرارة منخفضة، وتسمى عملية استبدال التجميد. عادة يتم استبدال تجميد على مدى عدة أيام في مخصص، معدات مكلفة. هناك ابتكار مؤخرا يسمح للعملية أن تكتمل في ثلاث ساعات، بدلا من اليومين المعتادة. وعادة ما يعقب ذلك عدة ايام اخرى لإعداد عينة تشمل التسلل وتضمينها في راتنجات الايبوكسي قبل باجتزاء. هنا نقدم بروتوكول الجمع بين تجميد الضغط العالي واستبدال تجميد سريع تمكن مصنع تثبيت العينة التي يتعين إنجازها في غضون ساعات. يمكن بسهولة بروتوكول تكييفها للعمل مع الأنسجة أو الكائنات الحية الأخرى. الأنسجة النباتية هي التي تثير قلقا خاصا بسبب وجود فراغات الهوائية والحويصلات مملوءة بالماء التي تعيق تجميد الخالية من الجليد من المياه. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عملية التثبيت الكيميائية طويلة خاصة في النباتات بسبب جدران الخلايا إعاقة تغلغل المواد الكيميائية إلى أعماق الأنسجة. الأنسجة النباتية هي بالتالي particularly تحديا، ولكن هذا البروتوكول هو موثوق بها وينتج عينات من أعلى مستويات الجودة.
المقدمة
لدينا معرفة التركيب الدقيق خلية تأتي أساسا من المجهر الإلكتروني، والتي يمكن حلها من التفاصيل في حدود بضع نانومتر 1. على الرغم من كونها قوية جدا في قرار TEM لا تعتبر سهلة الاستخدام، وإعداد العينات يتطلب وقتا طويلا وبروتوكولات شاقة، ويتطلب بعض الخبرة من ممارس. تثبيت التقليدي للعينات والجمع بين استخدام الألدهيدات ورباعي أكسيد الأوزميوم قبل مزيد من المعالجة التي تشمل الجفاف، والتضمين في الراتنج ومن ثم باجتزاء لإنتاج المقاطع رقيقة جدا أن يتم بعد ذلك ملطخة المعادن الثقيلة. ومع ذلك، فمن المعروف أن التثبيت الكيميائي يمكن ان تنتج القطع الأثرية بما في ذلك تجميع البروتين وفقدان الدهون 1، والتغيرات في الأغشية ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: الإجراء QFS يتطلب الحذر الشديد والحذر من قبل المستخدم، ونحن تسليط الضوء على هذه احتياطات السلامة هنا كما تنبيهات وملاحظات عند الاقتضاء.
1.Preparation لتشغيل HPF
- قبل البدء في إعداد العينات، تشغيل الثلاجة الضغط العالي باتباع تعليمات الشركة الصانعة.
ملاحظة: وحدة HPF المستخدمة في هذا البروتوكول هو وحدة مدمجة Wohlwend 02 (الشكل 1A)، ويستغرق حوالي ساعة واحدة إلى واحد ونصف الداخلي البدء قبل ان يفوت HPF يمكن أن تبدأ.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وقد تم الحصول على النتائج المقدمة أدناه باستخدام الاتفاق Wohlwend 02 لHPF (الشكل 1A). واحد الميزة الرئيسية لهذا الصك هو سهولة استخدام ناقلات العينة وحامليها. عند استخدام الأدوات الأخرى، يوصي ماكدونالد أن اثنين من المستخدمين يجب تنفيذ إعداد العينات وHPF، واحدة إعداد العينات في حين أن الآخر لا تجميد ونقل إلى FS cryovials 9. ومع ذلك، فإن Wohlwend العينات الناقلين وحامل من السهل بما فيه الكفاية لمستخدم واحد لمعالجة مستقل (الشكل 2A، B، E، F و G).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نجاح بروتوكول المقدمة هنا يعتمد بشكل كبير على المستخدم. أولا، يتعين إعداد متقدمة لضمان توفير جميع المواد اللازمة متوفرة وبكميات كافية لإكمال كامل المدى HPF-QFS. ثانيا، يجب على المستخدم العمل بسرعة، والانتقال من خطوة إلى خطوة بطريقة فعالة أن يقلل معالجة عينة، وبالتالي التقليل من تغييرات على الدولة الأم من الأنسجة. مرة واحدة يتم تجميد العينات وقبل أن تكون المجففة فمن الضروري أن يتم الاحتفاظ البارد، لذلك يجب توخي الحذر لتجنب أي معالجة التي يمكن أن تصل حرارة العينة عن غير قصد، على سبي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تحظى بتقدير كبير من اللطف وكرم الدكتور كينت ماكدونالد من جامعة كاليفورنيا في بيركلي. نشكر لمراجع المجهول اقتراحات مفيدة جدا. ويدعم المختبر بورتش سميث صناديق البدء من جامعة تينيسي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| آلة التجميد ذات الضغط العالي Wohlwend HPF Compact 02 | Technotrade International، Inc | HPF02 | مع راسم الذبذبات المتكامل لعرض منحنيات التجميد والضغط ؛ الكمبيوتر الشخصي (غير المدرج) مطلوب للعرض من معلمات التجميد |
| حامل لناقلات DN 3 × 0.5 مم الألومنيوم Apecimen | Technotrade International، Inc | 290 | |
| ناقلات العينات ، P = 1,000 ، DN 3 × 0.5 الألومنيوم ، النوع A | Technotrade International، Inc | 241-200 | |
| ناقلات العينات ، P = 1,000 ، DN 3 × 0.5 الألومنيوم ، النوع B | Technotrade International، Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20.5 L ، MVE Millennium 2000 XC20 | الرسم البياني | ||
| خميرة | كلما كان ذلك أفضل ، لتجنب الإنتاج المفرط للغاز (CO2< / sub>) | ||
| اللقطات | |||
| مسجل بيانات مزدوج الحرارة EL-USB-TC | OMEGA ENGINEERING, INC. | OM-EL-USB-TC | البطارية البديلة التي تم شراؤها بشكل منفصل |
| مسبار درجة الحرارة | علوم المجهر الإلكتروني | 34505 | |
| كتلة سخان 12/13 مم | |||
| شاكر دوار | فيشر ساینتفيك | 11-402-10 | |
| لكمة الأوراق - Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| شمع الأسنان الوردي | علوم المجهر الإلكتروني | 72660 | |
| قوارير مبردة 2 مل | علوم المجهر الإلكتروني | 61802-02 | |
| مجفف | |||
| الميثانول | |||
| الجاف | |||
| النيتروجين | |||
| الأسيتون | |||
| ملقط | عدة أزواج |
المراجع
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
- Studer, D., Hennecke, H., Muller, M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
