مقالة منهجية

الكشف عن البديل خلال الربط طلائي-الوسيطة الانتقالية

DOI:

10.3791/51845

⸱

أكتوبر 9, 2014

 ,  , 
1Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ثبت أن تنظيم التضفير البديل يساهم في الانتقال الظهاري الوسيط (EMT) ، وهو برنامج خلوي أساسي في مختلف العمليات الفسيولوجية والمرضية. نصف هنا طريقة تستخدم نموذج EMT محفز للكشف عن الربط البديل أثناء EMT.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب التضفير البديل دورا مهما في الانتقال الظهاري الوسيط (EMT) ، وهو برنامج خلوي أساسي يحدث في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية. نصف هنا استراتيجية لاكتشاف التضفير البديل أثناء EMT باستخدام نموذج EMT المحفز عن طريق التعبير عن مثبط النسخ Twist. تتم مراقبة EMT من خلال التغيرات في مورفولوجيا الخلية ، وفقدان توطين E-cadherin عند تقاطعات الخلايا الخلوية ، والتعبير المبدل لعلامات EMT ، مثل فقدان العلامات الظهارية E-cadherin و γ-catenin واكتساب علامات اللحمة المتوسطة N-cadherin و vimentin. باستخدام مجموعات التمهيدي الخاصة بالشكل المتساوي ، يتم تحليل التضفير البديل ل mRNAs المهتمة بواسطة RT-PCR الكمي. يتم التحقق من صحة إنتاج الأشكال الإسوية البروتينية المقابلة عن طريق فحوصات النشاف المناعي. طريقة الكشف عن الأشكال الإسوية لللصق الموضحة هنا مناسبة أيضا لدراسة التضفير البديل في العمليات البيولوجية الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الانتقال طلائي الوسيطة (EMT) هو برنامج التنموي الذي يدفع التشكل الجهاز وإعادة عرض الأنسجة أثناء مرحلة التطور الجنيني. عند تفعيلها بشكل غير طبيعي، EMT تعزز الانبثاث ورم وتليف الجهاز 1،2. وقد وصفت دراسات مقنعة على أهمية تنظيم النسخي خلال عملية EMT، التي تحددها عدة عوامل النسخ، مثل تويست، الحلزون، وZEB، الذي قمع التعبير عن الملتصقة بروتين تقاطع E-كادهيرين، مما أدى إلى فقدان cobble- حجر مثل مورفولوجيا الظهارية ومكاسب على شكل مغزل الوسيطة النمط الظاهري 3-8. وكشفت الدراسات الحديثة عن طريق تحليل الجينوم على نطاق من الرنا أن هناك مجموعة من الجينات التي ترتبط إما الظهارية أو الوسيطة الظواهر 9،10 أنماط الربط. العمل من مختبرنا توصيل ظيفيا الربط البديلة وEMT. من خلال دراسة سطح الخلية جزيء التصاق CD44، أثبتنا أن CD44 alternوينظم سالبة الربط بإحكام أثناء EMT، والأهم من ذلك، أن شكل الإسوي CD44 لصق التحول سببيا يسهم في EMT 11.

ويمثل الربط البديلة نموذج على نطاق واسع والحفظ من تنظيم الجينات، ما يصل إلى 95٪ من الجينات متعددة اكسون الإنسان وتقسم بدلا من 12-14. عن طريق توليد منتجات البروتين متعددة من جين واحد، يشكل الربط البديلة آلية أساسية للتنوع البروتين، مضيفا طبقة أخرى من التعقيد إلى الجينوم البشري. على هذا النحو، يمكن ديسريغولاتيون من الربط بديل يحتمل أن يؤدي إلى تأثيرات بيولوجية عميقة تسبب الأمراض التي تصيب الإنسان. في الواقع، وقد تم توثيق الربط البديلة الشاذة في أمراض لأكثر من عقد 15-25، بما في ذلك النتائج الأخيرة أن الطفرات في الجينات التي تشفر الآلات جسيم التضفير توجد عادة في متلازمات خلل التنسج النقوي 26-28. لذلك، وتطوير طرق موثوقة للكشف عن ط تقسم بدلا من ذلكsoforms هو من أهمية كبيرة في دراسة العمليات البيولوجية المختلفة بما في ذلك EMT.

هنا نقدم بروتوكول للكشف عن تغيرات في الربط البديلة باستخدام نموذج EMT محرض. أساليب لتصميم الاشعال PCR وكشف الإسوية لصق هي مناسبة ليس فقط لدراسة الربط البديلة خلال EMT، ولكن أيضا لدراسة الربط البديلة في العمليات البيولوجية الأخرى. التحقيق الربط البديلة خلال EMT الضروري من أجل فهم أفضل للآليات EMT وورم خبيث، مما يسهل وضع استراتيجيات فعالة لعلاج ورم خبيث السرطان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الثقافة خلية من EMT التعريفي

ملاحظة: EMT يمكن الناجم عن علاج TGFβ أو التعبير خارج الرحم من عوامل النسخ تويست، الحلزون، أو Zeb1 / 2 في الخلايا الظهارية. الموصوفة في هذا البروتوكول هو نظام EMT محرض عبر التعبير عن تويست-ER انصهار بروتين في الخلايا الثديية البشرية خلد الظهارية (HMLE / تويست-ER، هدية من الدكتور J يانغ، جامعة كاليفورنيا سان دييغو) 9،11،29. على 4 hydroxytamoxifen (TAM) العلاج، وانصهار بروتين تويست-ER translocates إلى النواة لدفع النسخ والنتائج في الانتقال EMT الكامل في 12-14 أيام 9،11،29. أنظمة محرض EMT إضافية، مثل HMLE / الحلزون-ER، HMLE / TGFβ، وMCF10A / TGFβ، يمكن العثور عليها في منشوراتنا السابقة 11،30.

  1. الحفاظ على خلايا HMLE / تويست-ER في المصل خالية المتوسطة الثديية نمو الخلايا الظهارية (MEGM) في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. مرور الخلايا كل 2-3 أيام عندما تصل إلى 80٪ التقاء. احتضان الخلايا مع التربسين 0.15٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق، ثم تعطيل التربسين مع 5٪ مصل العجل / DMEM. تدور باستمرار خلايا و resuspend لهم في MEGM. لوحة خلايا في طبق زراعة الأنسجة جديد في نسبة 1-4.
  2. حل TAM في الإيثانول لجعل حل 200 ميكرومتر. حماية TAM عن الضوء وتخزينها في -20 درجة مئوية. قبل الاستخدام، حديثا إضافة إلى TAM MEGM سائل الاعلام في 1: 10،000 تخفيف لجعل تركيز النهائي من 20 نانومتر TAM.
  3. لتحريض EMT، لوحة خلايا 1.6 × 10 6 HMLE / تويست-ER في طبق زراعة الأنسجة 10 سم من نسختين. خلايا الثقافة مع وسائل الإعلام 20 نانومتر TAM التي تحتوي على MEGM.
  4. لوحة الخلايا 1.6 × 10 6 HMLE / تويست-ER في طبق 10 سم من نسختين وعلاج الخلايا مع 0.01٪ من الإيثانول كعنصر تحكم غير TAM-المعاملة.
  5. بعد يومين من الحضانة، والتقاط صور تحت المجهر الضوء في 10X التكبير لتسجيل التغيرات المورفولوجية من الخلايا.
  6. نضح المتوسطة من طبق واحد التحكم أو TAM المعاملةالخلايا. غسل الخلايا مع PBS الباردة، وخلايا الحصاد بالغاء نصف لوحة في RNA تحلل العازلة لعزل الحمض النووي الريبي، والنصف الآخر في المخزن المعهد الملكي للتحليل البروتين.
  7. خلايا المرور من السيطرة أو أطباق TAM المعاملة على أيدي إعادة الطلاء 1.6 × 10 6 خلايا في طبق 10 سم من نسختين. علاج مستمر الخلايا مع 20 نانومتر TAM أو مركبة.
  8. كرر الخطوات من 5 إلى 7 مرة واحدة كل يوم حتى يوم 14، في الوقت الذي تظهر خلايا تويست-ER TAM المعاملة والوسيطة التشكل على شكل مغزل، في حين أن الخلايا السيطرة المعالجة السيارة تحافظ على مورفولوجيا الظهارية مثل الحصوه.

2. توصيف EMT

ملاحظة: يشار إلى الانتهاء من EMT من (1) خلية تغيرات شكلية من التشكل مثل الحصوه الظهارية إلى مثل الأرومة الليفية ظهور المغزل على شكل؛ (2) فقدان التعريب E-كادهيرين في تقاطعات خلية خلية. و (3) التعبير تحولت من علامات EMT، الذي يعرف عن فقدانمن علامات الظهارية وكسب علامات الوسيطة.

يتم التقاط الخلايا تغيرات شكلية بواسطة المجهر الضوئي في 10X التكبير أثناء وقت EMT الاستقراء، وصفها في القسم 1. كشف المناعي ومضان من E-كادهيرين في الخلايا تقاطعات الموضح في هذا القسم. يتم الكشف عن التعبير عن علامات EMT بواسطة immunoblotting. علامات الظهارية شيوعا هي E-كادهيرين، γ-catenin، وoccludin، وتشمل علامات الوسيطة فبرونيكتين، N-كادهيرين وvimentin. ووصف الإجراءات العامة للimmunoblotting في القسم 4.

  1. في اليوم 12 من العلاج TAM، البذور 1 × 10 5 الخلايا على كوب 12 ملم ساترة دائرية توضع في بئر من 24 لوحة جيدا.
  2. 48 ساعة بعد زرع الخلايا والمتوسطة نضح ويغسل مع برنامج تلفزيوني قبل تحسنت.
  3. إصلاح الخلايا مع قبل تحسنت بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 15 دقيقة.
  4. غسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  5. احتضان الخلايا مع 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 15دقيقة في RT.
  6. غسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  7. احتضان الخلايا في 5٪ BSA / برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة على RT لمنع غير محددة وملزمة.
  8. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية E-كادهيرين في 1:50 التخفيف في 1٪ BSA / PBS في غرفة يا مرطب / N عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: النطاق لتخفيف الأجسام المضادة الأولية عادة بين 01:50 و 1: 200، وينبغي تحديد التخفيف الأمثل لكل الأجسام المضادة تجريبيا.
  9. صب الأجسام المضادة الأولية ويغسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  10. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية فلوري المسمى في 1: 500 التخفيف لمدة 1 ساعة على RT. من هذه الخطوة على، وحماية الخلايا من الضوء.
  11. صب الضد الثانوية ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  12. خلايا صمة عار مع 0.1-1 جم / مل دابي أو هويشت لمدة 10 دقيقة.
  13. شطف الخلايا مع PBS ثلاث مرات.
  14. جبل coverslips مع قطرة من تصاعد المتوسطة، وcoverslips ختم بطلاء الأظافر.
  15. مراقبة الخلايا واتخاذصور تحت المجهر الفلورسنت 63X.

تلطيخ مع الأجسام المضادة إضافية يمكن القيام بها لتأكيد النمط الظاهري EMT. على سبيل المثال، N-كادهيرين والأكتين العضلات α السلس يمكن ملطخة ل29،31،32 الوسيطة النمط الظاهري. إعادة تنظيم هيكل هيكل الخلية يمكن رصدها من خلال تلطيخ الخلايا مع phalloidin لأكتين F-11. بالإضافة إلى ذلك، المقايسات لحركية الخلية ومقاومة خلايا الموت لا يمكن أن يؤديها لدراسة خصائص EMT 11.

3. الكشف عن طريق لصق الأشكال الإسوية QRT-PCR فحوصات

  1. التصميم التمهيدي
    ملاحظة: أزواج التمهيدي يجب أن تصمم بعناية لتضخيم الإسوية لصق متميزة. اكسون تخطي، الحدث الربط البديلة لوحظ الأكثر شيوعا، ويظهر هنا كمثال لتوضيح استراتيجية التصميم التمهيدي. يصور الشكل 1A أربعة اكسون مسبقا مرنا، مع اكسون الثالث باعتباره اكسون متغير. إدراج اكسون 3 نتيجة فيإنتاج ولصق شكل الإسوي أطول، في حين تخطي من اكسون 3 يولد أقصر لصق شكل الإسوي. الاشعال تحتاج إلى أن تكون مصممة لتمييز شكل الإسوي شملت اكسون-3-واكسون 3 تخطي شكل الإسوي، واكتشاف نص شامل لهذه مرنا.
    1. للكشف عن اكسون إدراج، تصميم بعناية التمهيدي إلى الأمام داخل اكسون متغير 3، والتمهيدي العكسي داخل اكسون التأسيسي قريب 4، والسماح لالتضخيم محددة من تضمين اكسون شكل الإسوي متغير. تأكد من عدم تصميم كل من الأمام وعكس الاشعال داخل نفس اكسون متغير من أجل تجنب المنتجات PCR تضخيمها من الحمض النووي الجيني أو ما قبل مرنا.
    2. لتضخيم تحديدا اكسون تخطي الأحداث، تصميم واحد من الاشعال تمتد تقاطع اكسون التأسيسي 2 و 4 اكسون التي لولاها يتم تدميرها عندما يتم تضمين اكسون متغير 3. تصميم التمهيدي آخر داخل اكسون التأسيسي 4. على هذا النحو، يتم إنشاء منتجات PCR فقط عندما يكون اكسون متغير 3 هو excludإد والتأسيسي وانضم اكسون 2 و 4 لاحقا اكسون معا.
    3. للكشف عن مجموع النصوص من الجين، وتصميم الاشعال في غضون سنتين الإكسونات التأسيسية 1 و 2. وهكذا، وتتضخم المنتجات PCR من جميع الأشكال الإسوية.
    4. تأكد من أن درجة حرارة انصهار (TM) لجميع الاشعال حوالي 55 ° C، وطول كل التمهيدي هو حوالي 18-22 النيوكليوتيدات، وحجم المنتجات PCR ما بين 80 و 150 زوج قاعدي.
  2. استخراج الحمض النووي الريبي: استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام إجمالي عدة عزل الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
    1. جمع الخلايا في 350 ميكرولتر عازلة RNA تحلل.
    2. إضافة 350 ميكرولتر من الايثانول 70٪ إلى المحللة وتخلط جيدا.
    3. نقل العينة إلى العمود تنقية الحمض النووي الريبي.
    4. الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 1 دقيقة وتجاهل التدفق من خلال.
    5. غسل العمود مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من غسل RNA عازلة الأول ومرتين مع RNA غسل عازلة الثاني.
    6. إزالة المتبقي غسل العازلة RNAالثاني من العمود بواسطة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 2 دقيقة.
    7. نقل عمود جديد في أنبوب 1.5 مل، وإضافة 50 ميكرولتر nuclease خالية من المياه في وسط مصفوفة العمود وأزل RNA بواسطة الطرد المركزي في أقصى سرعة.
  3. توليف [كدنا الأولى حبلا
    1. تحديد تركيز ونوعية RNA بواسطة قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية. ملاحظة: يجب أن يكون جيد RNA نوعية في 260 نانومتر / 280 نانومتر نسبة امتصاص حوالي 2.0.
    2. انشاء الناسخ العكسي (RT) ردود الفعل التي تحتوي على 250 نانوغرام RNA الكلي، 0.05 ميكروغرام الاشعال مسدوس العشوائي، 50 بمول MgCl 2، 10 بمول dNTP، 2 ميكرولتر 5 × GoScript العازلة، و1 ميكرولتر RT انزيم في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر.
    3. إجراء التفاعلات RT في 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، تليها الحضانة عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإبطال نشاط إنزيم RT.
  4. في الوقت الحقيقي PCR
    1. انشاء 20 ميكرولتر ردود الفعل التي تتكون من 10 ميكرولتر مزيج الرئيسي SYBR الأخضر،0،1-1،0 قالب [كدنا] ميكرولتر و 5 بمول إلى الأمام وعكس الاشعال.
    2. تشغيل في الوقت الحقيقي PCR مع 40 دورة من الخطوات التالية: 95 ° C تمسخ لمدة 10 ثانية، 58 ° C الصلب لمدة 10 ثانية، و 60 درجة مئوية تمديد لمدة 30 ثانية. إجراء التفاعلات PCR في ثلاث نسخ.
    3. تحقق منحنيات التفكك وتأكد من أن ذروة واحدة لوحظ لكل مجموعة التمهيدي.
    4. الحصول على القيم دورة الكمي (الكلوروكوين) عن طريق حساب القيم المشتقة الثانية من منحنيات التضخيم.
    5. حساب كمية النسبية (RQ) من المستهدف في عينات من mRNAs يسببها بالمقارنة مع عينة uninduced باستخدام "دلتا دلتا الكلوروكوين (ΔΔCq)" الطريقة كما هو موضح بالمعادلة التالية. استخدام الجينات التدبير المنزلي، مثل GAPDH أو TBP، كمرجع.

figure-protocol-1
لحساب أكثر دقة القيم النسبية من الأشكال الإسوية لصق، رانه استخدام الجينات مرجعية متعددة ينبغي النظر فيها. نتائج يمكن تحليلها باستخدام طريقة القيمة المطلقة الكمي تعديل صفها Pfaffl آخرون 33،34.

4. فحص لصق الأشكال الإسوية على مستوى البروتين

  1. جمع الخلايا في 100 ميكرولتر عازلة RIPA الجليد الباردة.
  2. تعيين لست] على الجليد لمدة حوالي 10 دقيقة.
  3. الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، وجمع طاف.
  4. قياس تركيز البروتين عن طريق فحوصات برادفورد.
  5. تمييع عينات البروتين في SDS العازلة تحميل وتحميل 20-40 ميكروغرام من البروتينات إلى 10٪ الهلام SDS-PAGE.
  6. تشغيل المواد الهلامية SDS-PAGE عند 20 أمبير مقابل 1.5 ساعة.
  7. نقل البروتينات إلى غشاء PVDF في نظام نقل الرطب في 4 درجة مئوية لمدة 3 ساعة في 85 V. ضبط الوقت نقل وفقا للوزن الجزيئي للبروتينات الهدف.
  8. غشاء كتلة في 5٪ الحليب الخالي من الدسم لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة على RT.
  9. احتضان واي الغشاء[ث على الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات CO / N. النطاق لتخفيف الأجسام المضادة الأولية عادة بين 1: 200 و 1: 5،000، تحديد التخفيف الأمثل لكل الأجسام المضادة تجريبيا. التخفيف من الأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول يمكن العثور عليها في "جدول الكواشف ومعدات معينة".
    1. للكشف عن الأشكال الإسوية لصق، استخدام الأجسام المضادة المحددة التي تعترف شكل الإسوي معين. بدلا من ذلك، استخدام الأجسام المضادة التي تعترف حاتمة في المنطقة التأسيسية الترميز اكسون وكشف الإسوية لصق في وقت واحد على أساس أحجام البروتين المختلفة.
    2. في نفس الوقت، من خلال مراقبة EMT immunoblotting لعلامات EMT. استخدام E-كادهيرين، γ-catenin، وoccludin كعلامات الظهارية، وفبرونيكتين، N-كادهيرين وvimentin كعلامات الوسيطة.
  10. يغسل الغشاء ثلاث مرات مع TBS-T (50 ملي تريس، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.05٪ توين 20، ودرجة الحموضة 7.4) في فترة 5 دقيقة.
  11. احتضان الغشاء مع نملة الثانوي HRP-مترافقibody في 1: 10،000 تخفيف مدة 1 ساعة على RT.
  12. يغسل الغشاء ثلاث مرات مع TBS-T في فاصل 5 دقيقة.
  13. تصور البروتين مع نظام الكشف عن معان كيميائي وفضح غشاء لفيلم تصوير الإشعاع الذاتي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإجراءات المذكورة أعلاه توفر وسيلة قوية للكشف عن الربط البديلة خلال EMT. وتعطى نتائج ممثلة من CD44 لصق شكل الإسوي التبديل خلال الناجم تويست EMT أدناه كمثال.

تميزت EMT الناجم عن تطور في الخلايا HMLE / تويست-ER من الانتقال من رصف حجر مثل النمط الظاهري الظهارية إلى النمط الظاهري أرومي ليفي ممدود (الشكل 2A)، وغياب علامات الظهارية E-كادهيرين، γ-catenin وoccludin و upregulation من علامات الوسيطة فبرون...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإجراء الموضح هنا يمكن الكشف عن الربط البديلة في نموذج EMT محرض. على هذا النحو، التغيرات الديناميكية للصق شكل الإسوي التعبير يمكن التقاط طوال الوقت من EMT. هذا الأسلوب له مزايا على استخدام epithelial- مختلفة أو خطوط الخلايا التي تمثل الوسيطة للمقارنة بين الربط البديلة لخلفيات وراثية مختلفة عن خطوط الخلايا ذات الصلة للأمم المتحدة يمكن أن تؤثر على نحو غير ملائم الربط البديلة. ومع ذلك، فإن الحث الناجح لEMT يجب أكدت بعناية باستخدام مختلف علامات EMT قبل أي استنتاجات بشأن التغييرات في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يعرب عن تقديرهم ل Wensheng Liu للمساعدة التي لا تقدر بثمن في تصوير الخلايا. تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (R01 CA182467) ، وجمعية السرطان الأمريكية (RSG-09-252-01-RMC) ، ومؤسسة لين سيج ، ومؤسسة A Sister's Hope.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4-هيدروكسي تاموكسيفينسيجماH7904اصنع محلول مخزون عن طريق إذابة 4-هيدروكسي تاموكسيفين في الإيثانول إلى 200 &# 956 ؛ M. حافظ على المحلول عند -20 &# 176 ؛ C محمي من الضوء.
E.Z.N.A. طقم عزل الحمض النووي الريبي الكليأوميغا Bio-TekR6731مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي
GoScript نظام النسخ العكسيProScript كاشف PromegaA5001لمقايسة qRT-PCR
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6002كاشف لمقايسة qRT-PCR
LightCycler 480 نظام PCR في الوقت الحقيقيمعدات روشلمقايسة qRT-PCR
الجسم المضاد CD44R & D SystemsBBA101: 1,000 التخفيف
E-cadherin الأجسام المضادةتقنية إشارات الخلية40651: 2,500 تخفيف للنشاف المناعي ؛ 1:50 تخفيف للتألق المناعي
& جاما ؛ -Cateninالأجسام المضادة خلية الإشارات23091: 1,000 التخفيف
الأجسام المضادة أوكلودينسانتا كروز التكنولوجيا الحيوية Inc.sc-55621: 500 التخفيف
الفيبرونيكتين الأجسام المضادةBD مختبرات نقل التنبيغ6100771: 5،000 التخفيف
N-cadherin الأجسام المضادةBD مختبرات نقل التنبيغ6109201: 2،000 تخفيف
الأجسام المضادة VimentinNeoMarkersMS-129-p11: 500 التخفيف
GAPDH الأجسام المضادةMillipore CorporationMAB3741: 10،000 التخفيف
Amasham ECL كاشف الكشف عن النشاف الغربيGE Health Life ScienceRPN2209نظام التلألؤ الكيميائي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
  2. Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 14, 818-829 (2008).
  3. Yang, J., et al. a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 117, 927-939 (2004).
  4. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).
  5. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).
  6. Comijn, J., et al. The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion. Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).
  7. Bolos, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).
  8. Eger, A., et al. DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells. Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).
  9. Shapiro, I. M., et al. An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype. PLoS Genet. 7, e1002218(2011).
  10. Warzecha, C. C., et al. An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition. EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).
  11. Brown, R. L., et al. CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression. J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).
  12. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  13. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  14. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).
  15. Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene. Cell. 47, 277-284 (1986).
  16. Krangel, M. S. Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway. J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).
  17. Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse. Nature. 306, 756-760 (1983).
  18. Barbaux, S., et al. Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome. Nat Genet. 17, 467-470 (1997).
  19. Charlet, B. N., et al. Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol Cell. 10, 45-53 (2002).
  20. Hutton, M., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature. 393, 702-705 (1998).
  21. Kohsaka, T., et al. Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome. Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).
  22. Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy. Science. 280, 737-741 (1998).
  23. Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet. 29, 40-47 (2001).
  24. Spillantini, M. G., et al. Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).
  25. Wang, J., et al. Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation. Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).
  26. Graubert, T. A., et al. Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 44, 53-57 (2012).
  27. Papaemmanuil, E., et al. Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts. N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).
  28. Yoshida, K., et al. Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia. Nature. 478, 64-69 (2011).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, 704-715 (2008).
  30. Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition. J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).
  31. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).
  32. Zavadil, J., Bottinger, E. P. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions. Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).
  33. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45(2001).
  34. Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biol. 8, R19(2007).
  35. Boutz, P. L., et al. A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons. Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).
  36. Salomonis, N., et al. Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).
  37. Calarco, J. A., et al. Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein. Cell. 138, 898-910 (2009).
  38. Grabowski, P. Alternative splicing takes shape during neuronal development. Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).
  39. Seol, D. W., Billiar, T. R. A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis. J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).
  40. Srinivasula, S. M., et al. Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis. Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).
  41. Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications. Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).
  42. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37, 331-340 (2005).
  43. Cheng, C., Sharp, P. A. Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion. Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD44 Twist

مقالات ذات صلة