مقالة منهجية

تقييم الفئران تمرين التحمل من دون استخدام الشبكة من الصدمة: بديل لممارسة القسري

19.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51846

⸱

أغسطس 14, 2014

 ,  , 
1Research Service, VA Puget Sound Health Care System, 2Seattle Institute for Biomedical and Clinical Research, 3Division of Gerontology and Geriatric Medicine, Department of Medicine, University of Washington, 4Geriatric Research, Education, and Clinical Center, VA Puget Sound Health Care System

في هذه المقالة

ملخص

يتم عرض طريقة لتقييم القدرة على التحمل في فئران المختبر دون استخدام شبكة الصدمات. هذه الطريقة هي صقل إنساني يمكن أن يقلل من الآثار المربكة للإجهاد على المعلمات التجريبية.

الملخص

باستخدام نماذج الماوس المختبر، والمسارات الجزيئية المسؤولة عن الفوائد الأيضية لممارسة التحمل هي بداية لتكون محددة. الأسلوب الأكثر شيوعا لتقييم ممارسة التحمل في الفئران يستخدم القسري تشغيل في حلقة مفرغة مجهزة بمحرك شبكة صدمة. يتم دفع الحيوان الذي استقال من تشغيل الحزام المتحرك مفرغة على شبكة من شأنها أن توفر صدمة القدم الكهربائية؛ هربا من التحفيز السلبي، الفئران تعود لتعمل على الحزام. ومع ذلك، سلوك التهرب والضغط النفسي بسبب استخدام جهاز الصدمة يمكن أن تتداخل مع تحديد الكميات من تشغيل التحمل، وكذلك القياسات نخلط المصل بوستيكسيرسيسي الهرمونات ومستويات خلوى. هنا، علينا أن نظهر والتحقق من صحة اتباع أسلوب دقيق لقياس القدرة على التحمل في تشغيل ساذجة C57BL / 6 الفئران المعملية في حلقة مفرغة الآلية دون اللجوء إلى استخدام شبكة صدمة. عندما يتم preacclimated الفئران إلى حلقة مفرغة، أنها تعمل طوعا مع مشية بسرعة محددة لكل مذكرات التفاهمه. يتم استبدال استخدام الشبكة صدمة من التشجيع لطيف من قبل مشغل البشري باستخدام خافض اللسان، إلى جانب الحساسية للاستعداد طوعي لتشغيل على جزء من الفأرة. يتم تعريف النهاية واضحة لقياس تشغيل الوقت للوصول الى استنفاد لكل الماوس وينعكس في علامات سلوكية استنفاد مفلطحة مثل الحالات المزاجية وصعوبة في التنفس. هذا الأسلوب هو صقل إنسانية مما يقلل أيضا من آثار الخلط الضغط على المعلمات التجريبية.

المقدمة

البدانة ومقاومة الانسولين والسكري من النوع 2 هي الاضطرابات الأيضية المترابطة التي تمارس تأثيرات عميقة على صحة كل من الولايات المتحدة والسكان في جميع أنحاء العالم 1-4. ممارسة التحمل يمكن أن تمنع، وكذلك علاج، هذه الظروف 5،6. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام تقييم سرعة المشي والتحمل اختبارات التشخيص سريريا بالنسبة للهشاشة، sarcopenia، وعواقب الاضطرابات الأخرى مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن، في مواضيع الإنسان 7.

المسارات البيوكيميائية التي يقوم عليها آثار مفيدة من التمارين التحمل على تكوين الجسم والحساسية للانسولين هي بداية إلى توضيح، وذلك باستخدام الفئران المعدلة وراثيا أو دواء يتم عرضها تعزيز أو تخفيض القدرة على ممارسة الرياضة 8-11. ومع ذلك، فقد استخدمت العديد من هذه الدراسات المطاحن الآلية مجهزة شبكات صدمة لإجبار الفئران لتشغيل 8-11. يتم دفع الحيوان الذي استقال تشغيل بواسطةحزام متحرك مفرغة على شبكة من شأنها أن توفر صدمة القدم الكهربائية؛ هربا من التحفيز السلبي، الفئران تعود لتعمل على الحزام. هذه الإجراءات قد يعرض الضغط النفسي والسلوك وتجنب عوامل خارجية تؤثر على المعلمات التجريبية 12. أساليب أخرى لقياس التحمل، مثل الكميات النشاط المتنقلة باستخدام جهاز شعاع كسر أو الكميات من داخل قفص عجلة دوارة، يمكن مرتبك من تعديل الدورات الإيقاعية، والقلق، والتدريب غير مقصود، أو الطعام تسعى السلوك 12-16. وعلاوة على ذلك، تتطلب هذه الإجراءات السكن واحد، مصدر آخر من الضغط النفسي للفئران. ولذلك، هناك حاجة إلى القياس المباشر من ممارسة التحمل لا مرتبك بسبب الإجهاد.

لتفادي هذه المخاوف، وقد وضعت مختبرنا والتحقق من صحة طريقة لتقييم القدرة القصوى الركض ومستدامة تشغيل السرعة في غير المدربة والفئران ساذجة باستخدام بمحركات مفرغه لا EQUIpped مع شبكة صدمة. الفضاء في نهاية الحزام على التوالي، حيث تكمن شبكة صدمة عادة، ثم يصبح منبرا للفئران للراحة، ويوفر مكانا لالفئران التي ترفض تشغيل الجلوس حتى إزالتها من الجهاز. ويتم تشجيع الفئران لتشغيل من قبل مراقب البشري باستخدام التنصت أو لمس لطيف مع خافضة اللسان، إلى جانب الحساسية للاستعداد طوعي لتشغيل على جزء من الفأرة. وقد استخدم هذا الأسلوب لتحديد الاختلافات في ممارسة التحمل بين معدلة وراثيا والتحكم C57BL / 6 الفئران التي تختلف في التعبير عن العضلات المستمدة خلوى انترلوكين 15 (IL-15) 16،17. هذا الأسلوب هو صقل إنسانية أن يقلل من آثار الخلط من التعزيز السلبي الناجم عن استخدام شبكة صدمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على الإجراء الموضح هنا من قبل لجنة مؤسسي سليم رعاية الحيوان واستخدام VA بوجيه، ويتوافق مع دليل ILAR لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. إعداد التجريبية

  1. تقرر مسبقا إذا جمع الدم أو الأنسجة قريبا بعد ممارسة الرياضة أمر ضروري، وإذا كان الأمر كذلك، تحديد فترة بعد ممارسة لتوصيل مثل هذه الإجراءات. وتشمل الأمثلة تحديد ممارسة يسببها هرمون أو إطلاق خلوى في الدورة الدموية (مما يستلزم جمع الدم)، وتحديد ممارسة التعبير الناجم عن الأنواع مرنا الفائدة (يستلزم القتل الرحيم تليها جمع الأنسجة). إذا يشار آخر الفورية ممارسة جمع الدم أو الأنسجة، ويكون لهذه المواد إجراءات على اليد في غرفة الإجراء. الحصول على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية وتنفيذ وفقا للمبادئ التوجيهية التنظيمية. ليس كل التجارب تتطلب بوستيكسيرسيسي الدم أو الأنسجة collectiعلى؛ قد تكون مقارنة بسيطة تشغيل التحمل كل ما هو مطلوب.
  2. تقرر مقدما على المجموعات التجريبية والإجراءات بوستيكسيرسيسي للفئران (انظر الوصف أعلاه).
  3. وضع حلقة مفرغة على طاولة قوي في غرفة هادئة مخصصة خلال محاكمات تجري لهذا الإجراء.
  4. تعيين مفرغة للحارات الفأر في الحجم والميل المناسب للبروتوكول. يتم استخدام ميل +5 س هنا لتفادي تلف العضلات بسبب ممارسة غريب الأطوار (إطالة العضلات في نفس الوقت الذي تقلص) الذي يحدث أثناء تشغيل أسفل.
  5. وضع وسادة ماصة تحت الحزام مفرغة للقبض البراز.

2. التأقلم من الفئران إلى المطحنة

تقرر ما إذا كان "المستقرة" (أي ممارسة الرياضة) مجموعة من الفئران ضرورية، وفضح الفئران المستقرة إلى حلقة مفرغة دون تشغيل كما هو موضح في خطوات 2،1-2،5. تحديد ما إذا كان هناك حاجة 2 أو 4 مجموعات تجريبية، . على سبيل المثال، المستقرة / تمرين (2 مجموعات). ضوابط ممارسة / يمارس العلاج (2 مجموعات، لا الحيوانات المستقرة). أو، المستقرة / يمارس × التحكم / المعالجة (4 مجموعات). في "المعاملة" قد يكون التركيب الوراثي المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب، وهو نظام الدوائية، نظام غذائي خاص، أو تدخل تجريبية أخرى.

  1. السماح الماوس ليتأقلم إلى غرفة الإجراء في نقل قفص وطنه، مع زملائه في القفص، ل1 - 2 ساعة.
  2. اختيار ماوس واحدة، وسجل عدد البطاقات. وزن الماوس وسجل الوزن.
  3. تحول مكان الماوس في حلقة مفرغة دون المحرك على التأقلم ل، حوالي 5 دقائق. بدوره على السلطة، دون حزام مفرغه على التوالي، والسماح الماوس يتأقلم مع ضجيج آلة لمدة 5 دقائق أخرى.
  4. إزالة الفئران في مجموعة "المستقرة" (في حال استخدامها، وانظر الملاحظة 1) من حلقة مفرغة في هذه المرحلة وإعادتها إلى القفص أو إجراء الإجراءات بعد ممارسة وفقا للتصميم تجريبي (انظر الملاحظة 2).

ق = "jove_title"> 3. بدء اختبار تشغيل إلى استنفاد

  1. بعد التأقلم، وتحويل حزام إلى سرعة منخفضة (10 م / دقيقة) عند الحيوان تدرس الحزام وليس على المنصة.
  2. بلطف الصنبور أو رفع الخلف من الفأرة مع خافضة اللسان، واحدة إلى ثلاث مرات، لتشجيع الحيوانات مترددة في البقاء في حلقة مفرغة والتشغيل.
    ملاحظة: سيتم تشغيل معظم الفئران بسهولة، لكنها تتوقف في بعض الأحيان لفترات قصيرة. وعندما يحدث هذا، استخدم اللسان خافضة للاستفادة بلطف أو رفع الجزء الخلفي من الحيوان إلى تشجيع استئناف التشغيل. في كثير من الأحيان، لا تحتاج إلى أن يكون لمست مع اللسان خافضة الفئران. يلاحظ جنب مع اللسان خافضة القادمة تجاههم يتسبب في الفئران لتشغيل بعض أكثر.
  3. بدء الموقت المختبر مرة واحدة على الماوس يعمل في سرعة الأولية من 10 م / دقيقة.
  4. تحويل السرعة ببطء عند الفأر هو في أعلى (نهاية شاقة) من الحزام، في الزيادات من 1 م / دقيقة، حول كل 2 دقيقة.
  5. تحويل السرعة وصولا الىالإعداد السابق إذا كان الماوس يعمل بشكل متكرر في رشقات نارية قصيرة وليس بخطى ثابتة.
  6. تحديد القصوى لحقت تشغيل سرعة كل الماوس (عادة 14-17 م / دقيقة لC57BL / 6 الفئران) عن طريق ضبط السرعة ويراقب الماوس. تسجل هذه السرعة.
    ملاحظة: موقع الحيوان في حلقة مفرغة العظة المحقق لرغبة الحيوان لتشغيلها في سرعة أعلى. إذا كان الماوس في أقصى (شاقة) وحوالي نهاية لتصل الى الجدار، وانها مستعدة لتشغيلها في سرعة أعلى. إذا كان الماوس يعمل بخطى ثابتة في وسط حلقة مفرغة قد يكون في سرعته القصوى، أو قد تحتاج إلى مزيد من التعديل، وهذا يتوقف على نوعية المدى.

4. نهايات والفئران التي توقف

  1. استخدام اللسان خافضة للاستفادة بلطف أو رفع الخلف من الحيوانات التي تتوقف، لتشجيع استئناف تشغيل (انظر ملاحظة 3.2). لا إيقاف الموقت لانقطاعات مؤقتة في التشغيل.
  2. تحديد وازالتهاالبريد الفئران التي ترفض تشغيل. ملاحظة ذلك على ورقة البيانات. اعتمادا على التصميم الخاص بك التجريبية، التي ترفض الفئران يمكن اختبارها في يوم مختلف
    ملاحظة: بعض الفئران يرفض تماما للتشغيل. سيتم تشغيل هذه الفئران في رشقات نارية قصيرة، ثم تتوقف لالعريس أو "دواسة"، أي الجلوس على منصة واستخدام أرجلها الأمامية على الحزام. الموقف من هذه الفئران هي منحنية، مع كل أربعة أقدام زرعت تحت الحيوان للحفاظ على من يتم دفعها مرة أخرى إلى حلقة مفرغة من خافضة اللسان. أحيانا تصبح عدوانية تجاه الماوس اللسان خافضة عندما لا يرغبون في تشغيل، عض اللسان خافضة أو يتسلق أنها وسيلة للهروب. فمن الواضح داخل دقيقة 5 الأول من المحاكمة سواء الماوس سوف، أو لن، تشغيل. إزالة الفئران التي ترفض تشغيل من التحليل، ولكن لا نعدهم كما الفئران "المستقرة".
  3. تحديد الفئران المنهكة وإيقاف الموقت.
    ويعرف الإرهاق قبل ثلاث محطات متتالية ورفض إعادة ملاحظة:sume تشغيل على الرغم من التشجيع لطيف، بالإضافة إلى علامات جسدية استنفاد مثل صعوبة التنفس والموقف مفلطحة. الفئران على التعافي من الإرهاق في غضون 30 إلى 60 دقيقة.
  4. يسجل إجمالي المبلغ من الوقت الذي يقضيه على التوالي في جميع السرعات.
  5. اعتمادا على التصميم التجريبي، إما العودة الماوس هو قفصه، أو إجراء بوستيكسيرسيسي إجراءات فورية مثل الدم أو جمع الأنسجة حسب المبادئ التوجيهية المؤسسية.
  6. مسح حزام نظيفة مع towelette مبيد للجراثيم بعد اختبار كل فأر الفردية بحيث رائحة الماوس السابقة لا يؤثر سلوك الفئران اللاحقة اختبارها.
  7. اختبار الماوس المقبل. استخدام اللسان خافضة الطازجة لكل الماوس. الفئران الموجودة في نفس القفص ويمكن اختبار بالتتابع في نفس اليوم دون التأقلم إضافية إلى غرفة الإجراء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هذا الإجراء لقياس التحمل ممارسة تعكس بدقة الشخصى الأيض الجزيئية وسلالات مختلفة من C57BL / 6 الفئران التي تختلف في التعبير عن خلوى IL-15 16،17. الفئران المعدلة وراثيا التي بإفراط IL-15 (IL-15 TG الفئران) المعرض زيادة كبيرة المدى إلى استنفاد مرات مقارنة مع الضوابط littermate، في حين أن الفئران التي تفتقر IL-15 (IL-15 الفئران KO) معرض انخفاضا كبيرا مرات المدى قبل الوصول استنفاد (الشكل 1A). وقد أظهرت الدراسات التي نشرت أن العضلات هي تحول نحو مزيد من النمط ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الموصوفة هنا هي طريقة لتقييم التحمل تشغيل التطوعي في فئران المختبر باستخدام حلقة مفرغة بمحرك من دون استخدام شبكة صدمة. هذه الطريقة يمكن أن تكشف عن الفروق بين خطوط فرعية من C57BL / 6 الفئران التي تختلف في التعبير عن خلوى IL-15، والذي بدوره يسبب الاختلافات في التعبير عن العوامل التي تكمن وراء ممارسة التحمل 16،17. تمشيا مع مبادئ "ثلاثة R» في مختبر علم الحيوان، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم كبديل أكثر إنسانية، أو الصقل، لبروتوكولات ممارسة القسري التي تستخدم شبكة صدمة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

شكر وتقدير

بدعم من مراجعة الاستحقاق # BX001026 من وزارة شؤون المحاربين القدامى (LSQ)، واستخدام الموارد والتسهيلات في نظام VA بوجيه ساوند الرعاية الصحية، والموارد الأساسية المعدلة وراثيا في جامعة واشنطن ناثان صدمة مركز التميز في البيولوجيا الأساسية الشيخوخة (NIA # 5P30AG-013280)، وجامعة واشنطن مركز السكري والغدد الصماء بحوث (NIH # P30 DK-17047). نشكر المقدمة سينثيا Pekow DVM وكاري L. Koszdin DVM، VA بوجيه ساوند، وتعليقات مفيدة على المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Open Rodent Treadmill Exer-3/6Columbus Instruments، Columbus OH1050RMرقم الكتالوج هذا مخصص للموديلات التي لا تحتوي على شبكة صدمة. يمكن إزالة شبكات الصدمات يدويا من الموديلات القديمة (Eco 3/6)
Sani Cloth Germicidal TowlettesPDI- Professional Disposables، Inc. ، Orangeburg ، NYعادة ما يتم طلبها من خلال منشأة محليةتحتوي على 10٪ كحول الأيزوبروبيل ؛ يمكن استخدام أي منتج مكافئ.
مثبطات اللسانأي مورد
مؤقت مختبرأي مورد
فئران IL-15 TG *JAX ، بار هاربور ، ME011002IL-15 الجين المعدل معبرا عن الأكتين البشري المعدل مع تسلسل إشارة متغير لتسهيل الإفراز.
الفئران C57BL / 6J (النوع البري) *JAX ، Bar Harbour ، ME000664التحكم في الفئران للفئران IL-15 TG
IL-15 KO *Taconic Farms ، Germantown ، NY4269-Mالفئران المتماثلة اللواقح IL-15 "بالضربة القاضية" على خلفية C57BL
/ 6 C57BL / 6NTac (النوع البري) *Taconic Farms ، Germantown ، NYB6-MControl Mouse ل IL-15 KO
* اختياري ؛ يمكن أن تكون خطوط الفئران وعلاجاتها خاصة بالتجربة بروتوكول.
محلي مورين

المراجع

  1. Hill, J. A., Wyatt, H. R., Reed, G. W., Peters, J. C. Obesity and the environment: where do we go from here? Science. 299 (5608), 853-855 (2003).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (7121), 875-880 (2006).
  4. Pischon, T., Nothlings, U., Boeing, H. Obesity and cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 67 (2), 128-145 (2008).
  5. Benton, C. R., Wright, D. C., Bonen, A. PGC-1α-mediated regulation of gene expression and metabolism: Implications for nutrition and exercise prescriptions. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 33 (5), 843-862 (2008).
  6. Handschin, C., Spiegelman, B. M. The role of exercise and PGC1alpha in inflammation and chronic disease. Nature. 454 (7203), 463-469 (2008).
  7. Vasunilashorn, S., et al. Use of the Short Physical Performance Battery score to predict loss of ability to walk 400 meters: analysis from the InCHIANTI study. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (2), 223-229 (2009).
  8. Wang, Y. X., et al. Regulation of muscle fiber type and running endurance by PPARδ. PLoS Bio. 2 (10), e294(2004).
  9. LeBrasseur, N. K., et al. Myostatin inhibition enhances the effects of exercise on performance and metabolic outcomes in aged mice. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (9), 940-948 (2009).
  10. Burch, N., et al. Electric pulse stimulation of cultured murine muscle cells reproduces gene expression changes of trained mouse muscle. PLoS ONE. 5 (6), e10970(2010).
  11. Li, L., et al. Mitochondrial biogenesis and peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α (PGC-1α) deacetylation by physical activity. Diabetes. 60 (1), 157-167 (2011).
  12. Knab, A. M., et al. Repeatability of exercise behaviors in mice. Physiol. & Behavior. 98 (4), 433-440 (2009).
  13. He, Y., et al. IL-15 Receptor deletion results in circadian changes of locomotor and metabolic behavior. J. Mol. Neurosci. 41 (2), 315-321 (2010).
  14. Wu, X., Hsuchou, H., Kastin, A. J., Rood, J. C., Pan, W. Essential role of interleukin-15 receptor in normal anxiety behavior. Brain Behav. Immun. 24 (8), 1340-1346 (2010).
  15. Pistilli, E. E., et al. Loss of IL-15 receptor α alters the endurance, fatigability, and metabolic characteristics of mouse fast skeletal muscles. J. Clin. Invest. 121 (8), 3120-3132 (2011).
  16. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T. W. IL-15 overexpression promotes endurance, oxidative energy metabolism, and muscle PPARδ, SIRT1, PGC-1α, and PGC-1β expression in male mice. Endocrinology. 154 (1), 232-245 (2013).
  17. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T., Marcell, T. J. IL-15 is required for post-exercise induction of the pro-oxidative mediators PPARdelta and SIRT1. Endocrinology. , (2013).
  18. Ward, J. M., Anver, M. R., Mahler, J. F., Devor-Henneman, D. E. Chapter 13, Pathology of mice commonly used in genetic engineering (C57BL/6; 129; B6,129; and FVB/N). The Pathology of Genetically Engineered Mice. Ward, J. M., Mahler, J. F., Maronpot, R. R., Sundberg, J. P. , Iowa State University Press. Ames, IA, Chapter. 161-179 (2000).
  19. Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debate, K. A., Kleeberger, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med. Sci. Sports Exerc. 33 (12), 2053-2057 (2001).
  20. Turner, M. J., Kleeberger, S. R., Lightfoot, J. T. Influence of genetic background on daily running-wheel activity differs with aging. Physiol. Genomics. 22 (1), 76-85 (2005).
  21. Haight, T. J., van der Laan, M. J., Manini, T., Tager, I. B. Direct effects of leisure-time physical activity on walking speed. J. Nutr. Health Aging. 17 (8), 666-673 (2013).
  22. Studenski, S. Gait speed and survival in older adults. JAMA. 305 (1), 50-58 (2011).
  23. Jacobsen, K. R., Kalliokoski, O., Teilmann, A. C., Hau, J., Abelson, K. S. The effect of isoflurane anaesthesia and vasectomy on circulating corticosterone and ACTH in BALB/c mice. Gen. Comp. Endocrinol. 179 (3), 406-413 (2012).
  24. Sellers, T. L., Jaussi, A. W., Yang, H. T., Heninger, R. W., Winder, W. W. Effect of the exercise-induced increase in glucocorticoids on endurance in the rat. J. Appl. Physiol. 65 (1), 173-178 (1988).
  25. Cook, M. D., et al. Forced treadmill exercise training exacerbates inflammation and causes mortality while voluntary wheel training is protective in a mouse model of colitis. Brain Behav. Immun. 33, 46-56 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

IL 15

مقالات ذات صلة