يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

باستخدام تراكب الفحص لقياس نوعيا الإنتاج الجرثومي من والحساسية للالرئوية Bacteriocins

13.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51876

⸱

سبتمبر 30, 2014

 , 
1Microbiology and Immunology, University of Michigan, 2Pediatrics and Communicable Diseases, University of Michigan

في هذه المقالة

ملخص

المنافسة في المكورات العقدية الرئوية بوساطة البكتيريا والببتيدات الصغيرة المضادة للميكروبات ذات النشاط المثبط تجاه المكورات الرئوية والأنواع الأخرى ذات الصلة. نصف هنا مقايسة تراكب بكتيرية محسنة تسمح بتوصيف نشاط البكتيريا والطيف المثبط ، والمناعة الخاصة بالبكتيريا ، والكشف عن ببتيدات استشعار النصاب المفرزة.

الملخص

المكورات العقدية الرئوية تستعمر المجتمع متعدد الميكروبات المتنوع للغاية في البلعوم الأنفي حيث يجب أن تتنافس مع الكائنات الحية المقيمة. لقد أظهرنا أن الببتيدات المضادة للميكروبات المنتجة بالبكتيريا (البكتيريا) تملي نتيجة هذه التفاعلات التنافسية. تحتوي جميع سلالات المكورات الرئوية المتسلسلة بالكامل على موضع بأكتريوسين-ل إيك peptide (blp). يقوم موضع blp بتشفير مجموعة من البكتيريا المتنوعة وجميع المكونات المحفوظة للغاية اللازمة لتنظيمها ومعالجتها وإفرازها. يعد تنوع البكتيريا الموجودة في منطقة مناعة البكتيريا (BIR) في الموضع مساهما رئيسيا في منافسة المكورات الرئوية. إلى جانب البكتيريا ، توجد جينات المناعة في BIR وهي ضرورية لحماية الخلية المنتجة من تأثيرات البكتيريوسين الخاصة بها. مقايسة التراكب هي طريقة سريعة لفحص عدد كبير من السلالات للتفاعلات التنافسية بوساطة البكتيريا. يسمح اختبار التراكب أيضا بتوصيف المناعة الخاصة بالبكتيريا ، والكشف عن ببتيدات استشعار النصاب المفرزة. يتم إجراء الفحص عن طريق التلقيح المسبق لصفيحة أجار بسلالة ليتم اختبارها لإنتاج البكتيريوسين متبوعا بتطبيق تراكب أجار ناعم يحتوي على سلالة ليتم اختبارها لحساسية البكتيريا. تشير منطقة الخلوص المحيطة بالطعنة إلى أن سلالة التراكب حساسة للبكتيريا التي تنتجها السلالة الملقحة مسبقا. إذا لم يلاحظ أي منطقة تطهير ، فإما أن سلالة التراكب محصنة ضد البكتيريا التي يتم إنتاجها أو أن السلالة الملقحة مسبقا لا تنتج البكتيريا. لتحديد ما إذا كان موضع blp يعمل في سلالة معينة ، يمكن تكييف مقايسة التراكب لتقييم إفراز فرمون الببتيد بواسطة السلالة الملقحة مسبقا. في هذه الحالة ، يتم استخدام سلسلة من أربع سلالات lacZ-reporter ذات خصوصية فرمون مختلفة في التراكب.

المقدمة

العقدية الرئوية، وهي المستعمر المشترك للمجتمع متعدد المكروبات من البلعوم الأنفي، غير قادرة على المنافسة مع الآخرين، والمكورات الرئوية وثيقي الصلة من خلال إنتاج الببتيدات المضادة للميكروبات أنتجت البكتريا (bacteriocins). كل سلالة المكورات الرئوية التسلسل بالكامل بحثت حتى الآن يحتوي على نسخة من ب acteriocin- ل آيك ص eptide موضع، BLP. وقد تجلى إنتاج مبيد جرثومي من المكورات الرئوية إلى أن تكون مهمة في نتائج سواء في المختبر وفي الجسم الحي المنافسة 1-4. وتتأثر ديناميكية تنافسية من خلال التعبير عن bacteriocins المتنوعة جنبا إلى جنب مع البروتينات الحصانة وما شابه ذلك ردا على الببتيد فرمون محددة. يتم التحكم تحريض موضع BLP عن طريق نظام الاستشعار عن النصاب فيه فرمون الببتيد، BlpC، بربط كيناز الاستشعار، BlpH، ويبدأ شلال يشير مما أدى إلىالنسخ من موضع 5،6 BLP. هناك أربعة اختلافات أليلية من BlpC أن كل مأزق لBlpH المشابهة لها 6. للخلية من أجل البقاء آثار مبيد جرثومي الخاص بها، ونسخه الجينات التي تشفر البروتينات الحصانة وما شابه ذلك على نفس الاوبرون حيث أن كل من الجينات مبيد جرثومي. يحدث إذا قتل سلالة منافس غير قادر على upregulate موضع BLP ردا على فرمون خارجي أو، إذا كان يفتقر إلى سلالة الجين الحصانة معين المطلوبة للحماية. مجمع نقل، مطلوب BlpAB عن إفراز وتجهيز فرمون الببتيد والببتيدات مبيد جرثومي 2،4. في الآونة الأخيرة، فقد تبين أن نسبة كبيرة من سلالات المكورات الرئوية هي "الغشاشون" يعني لديهم طفرة في الجين الحفظ blpA مما يجعلها غير قادرة على إفراز الفيرمونات وbacteriocins 1،2. هذه السلالات هي قادرة على الاستجابة لBlpC خارجية المنشأ 2 يفرزها صهيلسلالات مملة السماح لإنتاج البروتينات الحصانة.

وعلى الرغم من الاستعدادات الخام من bacteriocins من supernatants يمكن إعداد من سلالات منتج باستخدام أساليب الخطوات البيوكيميائية لتحقيق النقاء، وهذا النهج ليس مفيدا لفحص مجموعات كبيرة من العزلات وإذا كان مستوى التعبير مبيد جرثومي منخفضة في مرق نمت الثقافات 2،7- 9. يستخدم الفحص تراكب كوسيلة سريعة للتحقيق في الديناميات التنافسية بين السلالات التي قد تكون موجودة في المختبر. للقيام بذلك، سلالة المكورات الرئوية هو على لوحة آغار وسمح لتنمو لتحقيق تركيزات البكتيرية محلية كافية لتحريض موضع BLP تلقيح مسبقا. ثم يتم تلقيح سلالة الثاني في حل أجار لينة المنصهر التي يتم بعد ذلك تطبيقها على سلالة تلقيح قبل لاختبار حساسية. لتقييم لنشاط موضع BLP (مستقلة عن النشاط المثبطة)، سلالات يمكن مضافين مع سلسلة من عشرالعناصر الأرضية النادرة التي سبق وصفها سلالات مراسل BlpC. شيدت هذه السلالات لاحتواء واحد من ثلاثة blpH الأليلات المختلفة التي تستجيب لالفيرومونات BlpC الثلاثة الأكثر شيوعا التي يفرزها المكورات الرئوية. سلالات مراسل لها الجين lacZ المتكاملة التي هي تحت سيطرة المروج يعتمد BlpH وتحمل الحذف في الجينات blpC يمنع التحفيز الذاتي 10،11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد منتج سلالة

  1. خط سلالة المكورات الرئوية لفحصها لإنتاج مبيد جرثومي على 5٪ الأغنام الدم الصويا زيتية لوحة أجار من -80 ° C الأسهم الفريزر.
    ملاحظة: استخدام لوحات الدم للنمو الأولي من سلالة لفحصها لتثبيط يزيد كثيرا من استنساخ للمقايسة. بالإضافة إلى ذلك، وغيرها من السلالات غير الرئوية التي تنتج bacteriocins يمكن استخدامها على الرغم من أن قد تحتاج إلى تعديل لكائن معين ظروف النمو. وقد استخدمنا العقدية الهينة وLactococcus اللبنية في مقايسة تراكب بنجاح.
  2. احتضان لوحة بين عشية وضحاها (O / N) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  3. بعد مرور فترة الحضانة من سلالة منتج، وإعداد زيتية أجار الصويا (TSA) لوحة من قبل pipetting 3،000 إلى 4،000 وحدة من الكاتلاز على لوحات تحتوي على 25 مل من TSA ونشر الحل الكاتلاز باستخدام الخرز الزجاجي معقمة. السماح لوحة جافة لمدة 10 دقيقة تحتخزانة السلامة البيولوجية.
  4. جمع كمية مرئية من البكتيريا على طرف ماصة. طعن غيض ماصة في لوحة TSA المجففة.
    ملاحظة: أكثر من سلالة واحدة منتج ويمكن طعن في لوحة واحدة TSA. من المهم أن الفضاء خارج طعنات بحيث الناتجة هالات لا تتداخل.
    1. إذا كان ذلك ممكنا، وتشمل يعرف مبيد جرثومي منتج كعنصر تحكم إيجابية والسلالة لاستخدامها في تراكب كعنصر تحكم السلبية.
      ملاحظة: الضوابط الإيجابية والسلبية هي تم نشرها سابقا ومتاحة عند الطلب 10.
  5. احتضان TSA وحة تحتوي طعنات متعددة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 6 ساعة.

2. جعل الأسهم الجلسرين من سلالة تراكب

  1. إعداد مخزونات الجلسرين (ثقافات نمت إلى مرحلة منتصف الأسي ثم تخزينها في -80 درجة مئوية بعد إضافة الجلسرين) قبل يوم من الفحص تراكب. تطعيم 5-10 مستعمرات شارع المكورات الرئويةعين لفحصها للحساسية أو إفراز فرمون تود هيويت في المتوسط ​​0.5٪ مع مستخلص الخميرة (THY).
    ملاحظة: بناء BlpC صحفيين محرض وقد وصفت سابقا 2 و هم سلالات متاحة عند الطلب.
  2. احتضان 5-10 المستعمرات في أنابيب زجاجية مع 5 مل من THY مع الأغطية مغلقة بإحكام في 37 ° C حمام الماء دون أن تهتز.
  3. احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية حتى التوصل الى OD 620 من 0،3-0،5.
    ملاحظة: هذا سوف يستغرق حوالي 4-5 ساعة اعتمادا على السلالة المستخدمة.
    1. عكس بلطف الأنبوب عدة مرات قبل قياس OD.
  4. إذا كانت التجربة لا يمكن أن يؤديها في نفس اليوم أو سيتم استخدام سلالة عدة مرات في المستقبل، وجعل الأسهم الجلسرين واستئناف التجربة في وقت لاحق. للأسهم الجلسرين، إضافة الجلسرين على الثقافات إلى تركيز النهائي من 20٪. الثقافات قسامة إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية. ملاحظة: يمكن أن تكون عينات قtored لشهور في -80 درجة مئوية. إن لم يكن جعل الأسهم الجلسرين، واستخدام عينات للفحص مباشرة تراكب.

3. تراكب الفحص

  1. قبيل تراكب التطبيق، خلط مكونات تراكب. في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، إضافة 5 مل من THY، 3،000-4،000 U من الكاتلاز، و 200 ميكرولتر من ثقافة مرق سلالة تراكب التي كانت إما نمت ذلك اليوم أو الأسهم الجلسرين من الثقافة التي تم إذابة في درجة حرارة الغرفة. إذا باستخدام سلالة المراسل، إضافة 50 ميكرولتر من X-غال (40 ملغ / مل) إلى الخليط تراكب. استخدام أنبوب مخروطي واحد لكل لوحة.
  2. تتوازن مزيج تراكب في درجة حرارة الغرفة قبل إضافة المنصهر TSA.
  3. إزالة لوحة TSA مع سلالة طعن من الحاضنة. تذوب الصلبة TSA في الميكروويف والحفاظ في 55 ° C حمام الماء حتى جاهزة للاستخدام. إضافة 3 مل من المنصهر TSA مع 1.5٪ أجار تبرد إلى 55 درجة مئوية إلى تراكب الخليط.
    1. إعداد مزيج تراكب مباشرة قبل pipetting ل، ستبدأ الخليط إلى ترسيخ جدابسرعة. ملاحظة: إذا يبدأ تراكب لترسيخ قبل الطلاء، فإن النتائج ستكون uninterpretable.
  4. مزج الخليط تراكب بواسطة pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات مع 5 مل الماصة والحرص على عدم إدخال فقاعات في الخليط. ماصة ببطء خليط تراكب مباشرة على لوحة TSA طعن. إبقاء لوحة على الفوق لبضع دقائق مما يسمح للأجار لتتصلب.
    1. لا تدوير لوحة لتوزيع الخليط تراكب، وهذا سيسحب من نمو ثقافة طعن في تراكب.
  5. وضع بعناية TSA وحة مع تراكب في الحاضنة 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ CO 2 O / N (حوالي 16-18 ساعة).
  6. مراقبة لوحات بعد نمو بين عشية وضحاها. يجب أن تظهر لوحات مبهمة من النمو من سلالة تراكب إلا في المناطق التي حدث تثبيط أو فرمون إشارات. سوف تظهر هذه كمناطق إما واضحة أو الزرقاء حول سلالة طعن، على التوالي.
    ملاحظة: على الرغم من أن قياس آثافةيمكن تحديد تظهر عناصر من القطر من المقاصة زرقاء أو التقييم الكمي، والاختلافات في القطر ويمكن أيضا أن تختلف تبعا لكمية البكتيريا التي طعن في لوحة. الفحص تراكب هو فحص نوعي، ينبغي تفسير أي تقييم كمي بحذر. يعتبر أي المقاصة واضحة بالمقارنة مع سيطرة سلبية والنشاط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هناك نوعان من النتائج المحتملة في مقايسة تراكب. يجب أن يكون من الممكن أن نرى النمو من سلالة طعن بعد الحضانة بين عشية وضحاها. في الشكل 1A، سلالة تراكب حساس لbacteriocins التي يتم إنتاجها. منطقة التخليص يمكن تصور المحيطة سلالة طعن. بالإضافة إلى ذلك، دوامات من سلالة طعن في مزيج تراكب ممكنة، ويمكن مشاهدته في الشكل 1A. في الشكل 1B، سلالة تراكب هو في مأمن من bacteriocins يجري يفرز كما لاحظ غياب هالة المحيطة طعنة. ومن الممكن أيضا أن سلال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هذا الاختبار تراكب هو وسيلة سريعة لتحديد نطاق النشاط للمنتجين مبيد جرثومي وإظهار التفاعلات التنافسية التي قد تحدث بين سلالات المكورات الرئوية. الفحص تراكب يمكن تكييفها لاستخدامها لفحص سلالات متعددة لإنتاج مبيد جرثومي على لوحة واحدة. قمنا بنجاح فحص مجموعات سلالة كبيرة مع هذا الاختبار باستخدام المكرر 48 دبوس إلى تطعيم لوحات SBA من نصف واحد من لوحة 96 جيدا. بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، يتم تحويل النمو إلى لوحة TSA باستخدام المكرر واختراق سطح أغار من لوحة مع دبابيس من المكرر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل جائزة إليزابيث إي كينيدي للأبحاث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
تريبتيكاز فول الصويا أجار مع 5٪ صياد دم الأغنامB21261Xللنمو من مزارع الفريزر
كاتالازسيجماC100-500mg4،741 وحدة لكل طبق
مرق تود هيويت + مستخلص الخميرة (THY)فيشرDF0492-17-6   ؛30 جم من THB ، 5 جم من مستخلص الخميرة ، 1 لتر ddH 2< / sub>O الأوتوكلاف
مرق الصويا Trypticase + أطباق أجار (TSA)FisherB11768 30 جم من TS ، 15 جم أجار ، 1 لتر DDH 2< / أوتوكلاف فرعي >O
5-bromo-4-chloro-3-indolyl & beta ;-D-galactopyranoside (X-gal)SigmaB4252-50MGتذوب في أطباق بتري ثنائي ميثيل فورماميد
فيشرFB0875712
الطيفيقيس OD620< / sub> للثقافات
37 & درجة ؛ C حمام
37 درجة ؛ حاضنة C مع أنبوب
5٪ 15 مل
مقياسمائي مخروطي CO2

المراجع

  1. Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
  2. Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
  3. Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
  4. Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
  5. Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
  6. Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
  7. Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751(2013).
  8. Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
  9. Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
  10. Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
  11. Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
  12. Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
  13. Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Streptococcus pneumoniae BLP TSA THY
باستخدام تراكب الفحص لقياس نوعيا الإنتاج الجرثومي من والحساسية للالرئوية Bacteriocins
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.