نقدم بروتوكول لاستخدام نظام القياس عن بعد الراديو لتسجيل المعلمات القلب والأوعية الدموية في الحبل الشوكي T4 الفئران مقطوع بعد ثمانية أسابيع الدماغ الجنينية الخلايا الجذعية العصبية تطعيم في موقع الآفة. القياس عن بعد هو تقنية متقدمة لتقييم وظيفة القلب والأوعية الدموية بدقة واعية تتحرك بحرية في الحبل الشوكي الفئران المصابين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ونظام القياس عن بعد راديو لمراقبة وظيفة القلب والأوعية الدموية في الحبل الشوكي مع الفئران Transection والعصبية الجذعية الجنينية الطعوم خلية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
إصابة الحبل الشوكي الصدري أو عنق الرحم عالية (SCI) يمكن أن يؤدي إلى ضعف القلب والأوعية الدموية. لمراقبة المعلمات القلب والأوعية الدموية، ونحن زرع القسطرة متصلة بجهاز إرسال لاسلكي في الشريان الفخذي من الفئران التي خضعت لtransection الحبل الشوكي T4 مع أو بدون تطعيم الخلايا الجذعية العصبية المشتقة من الدماغ الجنينية التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى مثل إدراج قنية أو الذيل صفعة والقياس عن بعد هو مفيد لمراقبة باستمرار ضغط الدم ومعدل ضربات القلب في الحيوانات تتحرك بحرية. كما أنها قادرة على الاستحواذ بيانات متعددة المدى الطويل. في الحبل الشوكي إصابة الفئران، تم تسجيل البيانات القاعدية القلب والأوعية الدموية تحت ظروف غير المقيد وأوتوماتيكية dysreflexia ردا على انتفاخ القولون والمستقيم بنجاح. بالإضافة إلى ذلك، المعلمات القلب والأوعية الدموية قبل وبعد اصابات النخاع الشوكي يمكن مقارنة في نفس الفئران إذا تم زرع جهاز إرسال قبل transection الحبل الشوكي. الحد من telemet وصفالإجراء راي هو أن غرس في الشريان الفخذي قد تؤثر على إمدادات الدم إلى hindlimb المماثل.
المقدمة
يحدث ضعف القلب والأوعية الدموية بعد إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) عند مستويات مرتفعة. ويتجلى ذلك في المختلين ضغط الدم ومعدل ضربات القلب أثناء الراحة، نقص ضغط الدم الانتصابي، ممارسة النشاط انخفاض ضغط الدم، وخلل المنعكسات اللاإرادي تتميز نوبات من ارتفاع ضغط الدم وبوساطة baroreflex بطء في الاستجابة للمؤثرات الحسية تحت مستوى الإصابة 1،2. هذه الأعراض تتداخل مع الحياة اليومية من المصابين في النخاع الشوكي. وبالتالي، فمن المهم وضع أدوات فعالة للتحقيق في التغييرات القلب والأوعية الدموية في الحيوانات مع اصابات النخاع الشوكي والعلاجات التجريبية.
للتحقيق في وظيفة القلب والأوعية الدموية في الحيوانات، وقد استخدمت عدة تقنيات لمراقبة ضغط الدم ومعدل ضربات القلب. المعلمات القلب والأوعية الدموية المركزية يمكن تسجيلها عن طريق إدخال قنية والقياس عن بعد، في حين موسع الذيل الأصفاد يمكن استخدامها لقياس ضغط الدم المحيطي 3. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، عن بعدمتري لديه الميزة الرئيسية أنه يتيح للتسجيل المستمر في التحرك بحرية الحيوانات ورصد طويل الأجل من وظيفة القلب والأوعية الدموية 4. في النماذج الحيوانية اصابات النخاع الشوكي، والتغيرات في ضغط الدم المحيطي بعد التحفيز التجريبية قد لا تكون كبيرة بما فيه الكفاية ليتم الكشف. وبناء عليه، ينبغي اختيار التقنية المناسبة مراقبة القلب للحيوانات مع اصابات النخاع الشوكي.
في هذه الدراسة، تم إدخال نظام القياس عن بعد الراديوية لرصد وظيفة القلب والأوعية الدموية في الفئران البالغة بعد transection كاملة الحبل الشوكي. تلقت الفئران الطعوم من الفئران مسانج اليوم الجنينية 14 (E14) الخلايا الجذعية العصبية المشتقة من جذع الدماغ (BS-NSCs) في موقع الآفة. الفئران مع الإصابة وليس الزرع وساذجة والجرذان يصب بأذى بمثابة الضوابط. الإجراء يشمل القياس عن بعد التعقيم الارسال وزرع (الشكل 1)، وتسجيل المعلمة القاعدية القلب والأوعية الدموية، والاستجابات التي يسببها انتفاخ القولون والمستقيم وتنظيف الارسال والتخزين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وتمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوان من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC). يتم اتباع المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة لرعاية الحيوان المعملية والسلامة بشكل صارم. الحيوانات مع العمليات الجراحية وعولج بشكل كاف لتقليل الألم والانزعاج.
1. الحبل الشوكي Curgery ومسمار خلية
- الأدوات الجراحية الأوتوكلاف قبل كل عملية جراحية. استخدام حبة تعقيم الساخن (أدوات العلوم الجميلة) لإزالة مسببات الأمراض والملوثات الميكروبية من الصكوك بين الإجراءات على الحيوانات المختلفة. استخدام القفازات المعقمة الجراحية، ثوب، وستائر أثناء الجراحة. توظيف تقنية جراحية معقمة لكل عملية جراحية.
- تخدير أنثى فيشر 344 الفئران مع مجموعة (2 مل / كغ) من الكيتامين (25 ملغ / مل)، زيلازين (1.3 ملغ / مل)، وآسيبرومازين (0.25 ملغ / مل) تدار عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP).
- حلق منطقة الظهر وتنظيف البشرة بشكل متكرر مع بيتادين والايثانول.
- قطع الجلد باستخدام شفرة رقم 10 وبصراحة تشريح العضلات طبقات. استخدام مشرط لعزل فقرات، فضح فقرة T3، وإجراء استئصال الصفيحة الفقرية الظهرية باستخدام رينجرز الجميلة ذات الرؤوس.
- شق الجافية طوليا والقطع في الحبل الشوكي على مستوى T4 باستخدام مزيج من مقص قطع القزحية وmicroaspiration لخلق فجوة rostrocaudal حوالي 1 ملم بين جذوعها الحبل الشوكي.
- الانتظار حوالي 1 - 2 دقيقة حتى يتوقف النزيف تماما، ثم خياطة العضلات مع 3-0 Vycril وإغلاق الجلد مع مقاطع الجرح.
- حقن أفرز اللبن قارع الأجراس (5 مل)، البوبرينورفين (0.035 ملغ / كلغ)، والأمبيسلين (33 ملغ / كلغ) تحت الجلد مباشرة بعد الجراحة والحفاظ على الفئران في حاضنة دافئة حتى مستيقظا.
- حقن الأمبيسلين حل مرة واحدة يوميا تصل إلى 10 أيام، والبوبرينورفين مرتين يوميا لمدة 3 أيام أو حتى علامات الألم والضيق تختفي رينغر و. لا عودة حيوان للشركة من الحيوانات الأخرى حتى وتعافى مع ully.
- إفراغ المثانة يدويا مرتين في اليوم لمدة أسبوعين حتى إنشاء إفراغ المثانة رد الفعل، ومن ثم إفراغ المثانة مرة واحدة يوميا طوال بقاء إذا لزم الأمر.
- بعد أسبوعين، وإعادة تخدير الفئران-SCI كما هو موضح أعلاه وإعادة فضح-الشوكي موقع الآفة الحبل. إبقاء الجافية مغلقة للاحتفاظ الخلايا المزروعة في موقع الآفة.
- ضخ 10 ميكرولتر من محلول الخلية (3.5 × 10 5 ميكرولتر)، التي تم جمعها من كل مكان E14 GFP الأجنة الفئران المعدلة وراثيا وجزءا لا يتجزأ في الفيبرينوجين وثرومبين 5،6، في بؤرة تجويف آفة واجهة منقاري والذيلية من الآفة مع حقن متعددة المواقع، باستخدام micropipette الزجاج سحبت مع قطرها الداخلي 40 ميكرون، متصلة حقنة هاملتون.
- خياطة طبقات العضلات وإغلاق الجلد مع مقاطع الجرح.
- أداء آخر حقن الجراحة والرعاية المثانة كما هو موضح في الخطوات 1،6-1،8.
- أسبوع واحد يكونالصدارة نضح، وضخ 0.5٪ Fluorogold (FG، 0.4 مل في الماء المقطر) داخل الصفاق إلى التسمية السابقة للعقد retrogradely الخلايا العصبية متعاطفة في النخاع الشوكي 7.
2. الارسال زرع
- نقع transmittersin 2٪ محلول غلوتارالدهيد (4 مل من 50٪ glutaraldhyde في 96 مل من الماء المقطر) لا يقل عن 1 - 2 ساعة (تصل إلى 10 ساعة) في درجة حرارة الغرفة لتعقيم.
- غسل الإرسال تماما مع عقيمة 0.9٪ المالحة 3 مرات وتخزينها في المياه المالحة حتى استخدام (لا يزيد عن 1 ساعة).
- بعد ثمانية أسابيع زرع الخلايا E14 (10 أسابيع إصابة آخر)، reanesthetize الفئران التي خضعت لSCI مع أو بدون تطعيم الخلايا والفئران السيطرة ساذجة.
- حلق منطقة البطن وhindlimbs. تنظيف البشرة مع بيتادين. وضع فأر على الطاولة الجراحية في موقف ضعيف.
- شق الجلد على البطن والفخذ الداخلي بطني على الجانب الأيمن باستخدام شفرة رقم 15.
- قطع طريق قالأنسجة الضامة ubcutaneous لفضح مجموعة من السفن الفخذ والعصبية باستخدام مقص صغير.
- فصل الشريان الفخذي من الوريد والعصب باستخدام ملقط غرامة مع نصائح منحنية.
- وضع ثلاثة خيوط الحرير تحت الشريان وجعل عقدة فضفاضة في كل خياطة.
- تطبيق 0.1 مل يدوكائين (2٪) على سطح الشريان للحصول توسع الأوعية لقسطرة لاحقة.
- تأمين السفينة بشكل أقصى مع عقدة الحرير الدائمة وكتلة مؤقت قريب من تمتد خياطة الحرير فضفاضة.
- ثقب الشريان باستخدام إبرة قياس 20 المنحنية وإدراج غيض من القسطرة مقياس البعد (8 سم طويلة) باستخدام أداة إدخال القسطرة.
- ادخال القسطرة rostrally تصل إلى 4 سم وبذلك وضع الطرف في الشريان الأبهر الصدري.
- ترسيخ القسطرة داخل السفينة عن طريق ربط خيوط الحرير حول ثلاثة الشريان الفخذي.
- جعل جيب تحت الجلد على طول الجهة بين الحافة الذيلية من القفص الصدري ورانه امتداد معظم الجمجمة من مجموعة الركبة مع مقص حادة.
- إدراج الجسم الارسال في الجيب وخياطة للأنسجة الضامة المحيطة الارسال لتجنب الحركة المفرطة.
- خياطة الجلد مع رقم 6 خيط الحرير.
- حقن أفرز اللبن قارع الأجراس (5 مل)، البوبرينورفين (0.035 ملغ / كلغ)، والأمبيسلين (33 ملغ / كلغ) تحت الجلد مباشرة بعد الجراحة والحفاظ على الفئران في حاضنة دافئة حتى مستيقظا.
3. بصل متوسط الضغط الشرياني (MAP) ومعدل ضربات القلب (HR) تسجيل
- في وقت مبكر من يوم واحد بعد زرع جهاز الإرسال، ووضع حيوان واحد على لوحة الاستقبال والارسال على تحويل. الانتظار لحوالي 10-15 دقيقة إلى روض الحيوان واستقرار المعلمات القلب والأوعية الدموية.
- سجل يستريح MAP والموارد البشرية، والتي هي مستمدة من ضغط النبض الشرياني مع نظام الحصول على البيانات المحوسب لا يقل عن 1 ساعة. جمع بيانات كل 5 ثانية.
- مراقبة وimals باستمرار وإزالة نقاط البيانات أثناء حدوث تشنجات مرئية. لكل حيوان، ومتوسط نقاط البيانات للحصول على القيم المتوسطة.
4. القولون والإنتفاخ الناجم عن خلل المنعكسات اللاإرادي
- كبح الفئران NSC-المطعمة أو السيطرة SCI في منشفة المتوفرة مع الغذاء الكريات داخل على المتلقي المرسل. عادة الفئران يمكن ان يبقى تعاوني أثناء الإجراء.
- إدراج مادة اللاتكس ذات الرؤوس بالون قسطرة في المستقيم لحوالي 2 سم وثبته على الذيل مع الشريط 8.
- تحويل جهاز الإرسال على والانتظار لمدة 10 - 15 دقيقة يسمح ضغط الدم بالعودة إلى preinsertion الأساس.
- حمل انتفاخ القولون بنسبة تضخم البالون ببطء أكثر من 10 ثانية مع 1.4 مل من الهواء لمدة 1 دقيقة، لتوليد ضغط حوالي 30 ملم زئبقي.
- MAP سجل وHR 1 دقيقة من قبل، 1 دقيقة أثناء وبعد 1 دقيقة انتفاخ القولون والمستقيم. بيانات عينة كل ثانية 3 أثناء إجراء 3 دقيقة.
- أداء 2 - 3 محاكمات لكل حيوان مع لا يقل عن 15 دقيقة الفاصل الزمني الاسترداد بين تجربتين.
- الحيوانات الجرعة الزائدة (IP) مع مزدوج مزيج التخدير جرعة المذكورة أعلاه إذا لم يكن هناك تقييم آخر. يروي الحيوانات بمحلول ملحي تليها بارافورمالدهيد 4٪.
- لكل حيوان، ومتوسط القيم قبل وأثناء انتفاخ القولون والمستقيم على التوالي؛ حساب الفرق بين خط الأساس وMAP وHR التغيرات التي يسببها انتفاخ لكل المحاكمة؛ المتوسط خلال 2 - 3 تجارب للحصول على القيم المتوسطة.
5. الارسال تنظيف
- إزالة الارسال من جسم الحيوان بعد التخدير ولكن قبل التروية. نقع على الفور في كوب مملوء بالماء المقطر حتى التنظيف. تجنب تجفيف الجهاز مقياس البعد.
- نقل مقياس البعد إلى 1٪ TERG-A-إنزيم محلول التنظيف الأنزيمية (10 جم / لتر ماء) لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- حيض غيض من الارسال القسطرة مع حادة إبرة قياس 30متصلة حقنة حيض.
- تجف بعناية الارسال باستخدام الأنسجة اللينة مطوية وتخزينه في علبة من البلاستيك الأصلي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام تقنية القياس عن بعد المذكورة أعلاه، سجلنا بنجاح المعلمات القلب والأوعية الدموية في الحيوانات إصابة الحبل الشوكي. في الحيوانات مع اصابات النخاع الشوكي وحده، MAP انخفاضا كبيرا في حين HR زادت بالمقارنة مع الحيوانات الساذجة، بما يتفق مع التقارير السابقة 9. في الحيوانات مع BS-NSC التطعيم، وMAP HR اقترب مستويات قياسها في الحيوانات ساذجة (الشكل 2). خلال انتفاخ القولون والمستقيم، كان ينظر إلى الجرذ كما dysreflexic إذا أنتجت تحفيز الضارة ارتفاعا في خريط...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقليديا، يتم إدخال السوائل تملأ قنية في الشريان وتوصيله إلى محول الضغط لتسجيل المعلمات القلب والأوعية الدموية الطرفية مثل لقطة في كل حيوان 11. لمراقبة أداء القلب والأوعية الدموية بشكل مستمر لفترة طويلة، وتستخدم أنظمة الراديو القياس عن بعد في العديد من المختبرات. هذه الأداة أكثر دقة يمكن تسجيل ضغط الدم في واعية، تتحرك بحرية الحيوانات. بالمقارنة مع السائل شغل القسطرة، يعتبر القياس تقنية أكثر تقدما لتقييم وظيفة القلب والأوعية الدموية بدقة في الحيوانات اصابات النخاع الشوكي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
تم دعم العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة / NINDS (NS054883) ، ومؤسسة Craig H. Neilsen (280072) ، وإدارة المحاربين القدامى والمنظمة الكندية لأبحاث العمود الفقري. نشكر مركز موارد وأبحاث الفئران ، جامعة ميسوري ، كولومبيا ، ميسوري ، على توفير فئران GFP.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Fibrinogen (الفئران) | Sigma | F6755-25MG | 2 ساعة عند 37 o< / sup>C لتفكيك |
| الثرومبين (الفئران) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle في 10 ملي مولار CaCl2 |
| 1٪ Terg-A-Zyme | Sigma | Z273287 | محلول إنزيمي لتنظيف مقياس |
| بعد Fluorogold | Fluorochrome | Dissovle في الماء المقطر وتجنب الضوء | |
| Telemeter (السلطة الفلسطينية C40) | الدولي لعلوم | ||
| بعد | لعلوم | البيانات ، مصفوفة تبادل البيانات ، أجهزة الاستقبال ، جهاز التحكم المرجعي للضغط المحيط | |
| القسطرة ذات الرأس البالون | إدوارد لايف ساينسز | 111F7-P | لانتفاخ القولون والمستقيم |
المراجع
- Krassioukov, A. V., Furlan, J. C., Fehlings, M. G. Autonomic dysreflexia in acute spinal cord injury: an under-recognized clinical entity. J Neurotrauma. 20, 707-716 (2003).
- Lindan, R., Joiner, E., Freehafer, A. A., Hazel, C. Incidence and clinical features of autonomic dysreflexia in patients with spinal cord injury. Paraplegia. 18, 285-292 (1980).
- Inskip, J. A., Ramer, L. M., Ramer, M. S., Krassioukov, A. V. Autonomic assessment of animals with spinal cord injury: tools, techniques and translation. Spinal Cord. 47, 2-35 (2009).
- Mayorov, D. N., Adams, M. A., Krassioukov, A. V. Telemetric blood pressure monitoring in conscious rats before and after compression injury of spinal cord. J Neurotrauma. 18, 727-736 (2001).
- Hou, S., Tom, V. J., Graham, L., Lu, P., Blesch, A. Partial restoration of cardiovascular function by embryonic neural stem cell grafts after complete spinal cord transection. J Neurosci. 33, 17138-17149 (2013).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Akhavan, M., Hoang, T. X., Havton, L. A. Improved detection of fluorogold-labeled neurons in long-term studies. J Neurosci Methods. 152, 156-162 (2006).
- Maiorov, D. N., Fehlings, M. G., Krassioukov, A. V. Relationship between severity of spinal cord injury and abnormalities in neurogenic cardiovascular control in conscious rats. J Neurotrauma. 15, 365-374 (1998).
- Laird, A. S., Carrive, P., Waite, P. M. Cardiovascular and temperature changes in spinal cord injured rats at rest and during autonomic dysreflexia. J Physiol. 577, 539-548 (2006).
- Phillips, A. A., Krassioukov, A. V., Ainslie, P. N., Warburton, D. E. Baroreflex function after spinal cord injury. J Neurotrauma. 29, 2431-2445 (2012).
- Osborn, J. W., Taylor, R. F., Schramm, L. P. Determinants of arterial pressure after chronic spinal transection in rats. Am J Physiol. 256, 666-673 (1989).
- Rabchevsky, A. G., et al. Effects of gabapentin on muscle spasticity and both induced as well as spontaneous autonomic dysreflexia after complete spinal cord injury. Front Physiol. 3, 329(2012).
- Hou, S., Lu, P., Blesch, A. Characterization of supraspinal vasomotor pathways and autonomic dysreflexia after spinal cord injury in F344 rats. Auton Neurosci. 176, 54-63 (2013).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
