مقالة منهجية

في المختبر توليف التعديل مرنا للتحريض التعبير البروتين في الخلايا البشرية

DOI:

10.3791/51943

⸱

نوفمبر 13, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic, Cardiac, and Vascular Surgery, University Hospital Tuebingen

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة الفيديو، ونحن تصف التوليف في المختبر مرنا تعديل لتحريض التعبير البروتين في الخلايا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توصيل خارجي من الترميز رسول الاصطناعية RNA (مرنا) لتحريض تخليق البروتين في الخلايا المطلوبة لديه إمكانات هائلة في مجالات الطب التجديدي، بيولوجيا الخلية الأساسية، والعلاج من الأمراض، وإعادة برمجة الخلايا. هنا، نحن تصف خطوة بخطوة بروتوكول لجيل من تعديل مرنا التي تقل إمكانية تنشيط جهاز المناعة وزيادة الاستقرار، ومراقبة الجودة لإنتاج الرنا المرسال، ترنسفكأيشن من الخلايا مع مرنا والتحقق من التعبير البروتين الناجم عن التدفق الخلوي. تصل إلى 3 أيام بعد ترنسفكأيشن واحد مع EGFP مرنا، وتنتج خلايا HEK293 transfected EGFP. في هذه المقالة الفيديو، ووصف تركيب EGFP مرنا على سبيل المثال. ومع ذلك، يمكن تطبيق الإجراء لإنتاج الرنا المرسال المطلوبة الأخرى. باستخدام الاصطناعية تعديل مرنا، والخلايا يمكن أن يتسبب في التعبير عن عابر البروتينات المطلوبة، التي عادة لا تعبر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الخلايا، ونسخ من الرنا المرسال (مرنا) وترجمة التالية مرنا في البروتينات المطلوبة ضمان الأداء السليم للخلايا. اضطرابات وراثية وراثية أو مكتسبة يمكن أن يؤدي إلى تخليق كافية ومختلة من البروتينات ويسبب أمراضا خطيرة. وبالتالي، فإن النهج العلاجي الجديد للحث على إنتاج البروتينات الناقصة أو المعيبة هو تسليم خارجي من تأليفي تعديل مرنا في الخلايا، والتي رموز للبروتين المطلوب. وبالتالي، يتم تشغيلها الخلايا لتخليق البروتينات الوظيفية، والتي عادة لا يمكن أن تنتج أو أن بطبيعة الحال لا تحتاج إليها. باستخدام هذا النهج، والاضطرابات الوراثية يمكن تصحيحها عن طريق إدخال مرنا أن رموز لمعيب أو مفقود البروتين 1. ويمكن أيضا العلاج مرنا استخدامها في التطعيم لsynthetize المستضدات البروتينية، والتي يتم التعبير عنها من قبل خلايا الورم أو مسببات الأمراض. وبالتالي، مضيفة نظام المناعة يمكن تنشيط فعال للقضاء على الخلايا السرطانية أو منع infections 2،3. وعلاوة على ذلك، في السنوات الأخيرة، وقد استخدم بنجاح مرنا لتوليد الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs). لهذا الغرض، و transfected الخلايا الليفية مع من mRNAs للحث على التعبير عن برمجة عوامل 4-6 وتحويلها في iPSCs مع إمكانات هائلة في مجال الطب التجديدي.

في السابق، كان مرتبطا استخدام مرنا التقليدي مع انخفاض واستقرار قوي المناعية. وبالتالي، والتطبيقات السريرية للمن mRNAs التقليدية كانت محدودة. ومع ذلك، فإن استبدال سيتيدين ويوريدين بنسبة 5-methylcytidine وسودويوريدين داخل جزيء الرنا المرسال بواسطة Kariko وزملاؤه جعل جزيئات مرنا مستقرة في السوائل البيولوجية وخفضت بشكل كبير تنشيط جهاز المناعة 7-10، والذي يسمح الآن انطباق السريري من mRNAs المعدلة.

استخدام من mRNAs تعديل المنتجة صناعيا، ونصوص الجين المطلوب يمكن تسليمها مؤقتا في الجسم الحي 11أو في المختبر للحث على البروتين التعبير. تتم ترجمة مرنا قدم تحت الظروف الفسيولوجية من قبل الأجهزة الخلوية الترجمة. نظرا لعدم الاندماج في جينوم الخلية المضيفة مقارنة الفيروسية ناقلات العلاج الجيني، يتم منع خطر تكون الورم 12،13. وبالتالي، فإن العلاج باستخدام مرنا الاصطناعية تعديل تتحسن قبول السريرية في المستقبل.

هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لإنتاج المعدلة ومرنا (الشكل 1)، ترنسفكأيشن من الخلايا مع مرنا وتقييم تعبير البروتين في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تكبير البلازميدات المحتوية المطلوبة الترميز تسلسل الحمض النووي (CDS)

  1. قبل الدافئ المتوسطة SOC، والتي يتم تضمينها في عدة التحول، إلى درجة حرارة الغرفة و لوحات أجار LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين إلى 37 درجة مئوية. تتوازن حمام مائي إلى 42 درجة مئوية.
  2. ذوبان الجليد قارورة واحدة من المكونات كيميائيا E. القولونية على الجليد.
  3. إضافة 1-5 ميكرولتر من البلازميد (10 خريج إلى 100 ​​نانوغرام) التي تحتوي على CDS في قارورة من عنصر كيميائيا E. القولونية وتخلط بلطف. لا تخلط الخلايا بواسطة pipetting. بعد إضافة البلازميدات، خلط من خلال الاستفادة من أنبوب بلطف.
  4. احتضان الخليط على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  5. للحرارة صدمة للE. كولاي لمدة 30 ثانية في 42 درجة مئوية في حمام مائي دون أن تهتز.
  6. ضع قارورة على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  7. إضافة 250 ميكرولتر من قبل تحسنت المتوسطة SOC إلى E. القولونية والبكتيريا يهز أفقيا في 300 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة جرثومية.
  8. نشر 100 ميكرولتر و 150 ميكرولتر من مزيج التحول على لوحات أجار LB استعد مسبقا، عكس لوحات واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  9. بعد أن أصبحت المستعمرات مرئية، تلقيح مستعمرة واحدة من كل لوحة إلى ثقافة أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل LB المتوسطة مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. احتضان لهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 300 دورة في الدقيقة حتى الثقافة في أواخر السجل أو مرحلة ثابتة.
  10. عن التخزين الطويل الأمد للتحول E. القولونية، الماصة 75 ميكرولتر من الجلسرين بنسبة 100٪ في cryovial. إضافة 225 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية (ستحتوي الأسهم المجمدة الجلسرين 25٪)، تخلط جيدا وتخزينها cryovial في -80 درجة مئوية.
  11. عزل البلازميدات تحتوي على CDS المطلوبة باستخدام طقم تنقية البلازميد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  12. تحديد تركيز البلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  13. إعداد aliquots من 20 ميكرولتر وتخزينها في -20 درجة مئوية لوقت طويل.
_title "> 2. التضخيم من البلازميد وإضافة مدرجات للبولي T-الذيل بواسطة تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

  1. ملاحظة: للحصول على قالب DNA لالنسخ في المختبر (IVT)، وCDS المصالح، هنا EGFP، يتم تضخيمه باستخدام PCR. في نفس الوقت، يتم إضافة بولي T-ذيل 120 thymidines (T) لإدراج باستخدام التمهيدي العكسي مع 120 التمديد تي. وبالتالي، فإن من mRNAs لدت حصول على بولي A-ذيل بطول محدد بعد IVT.
  2. تحضير خليط PCR كما هو مفصل في الجدول 1.
  3. خلط مزيج رد فعل تماما. ملاحظة: يمكن استخدام المنتج PCR في 4-5 ردود فعل IVT. لزيادة كمية الحمض النووي قالب لIVT، الحجم الكلي للخليط PCR يمكن زيادة. ويمكن استخدام كل منها يحتوي على 100 ميكرولتر PCR خليط عدة أنابيب PCR للحصول على عائد كاف من المنتجات PCR.
  4. وضع أنابيب PCR في thermocycler وتشغيل PCR باستخدام بروتوكول الدراجات PCR (الجدول 2).
  5. تنظيف Pرد فعل CR استخدام عدة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وأزل الحمض النووي باستخدام 20 ميكرولتر nuclease خالية من المياه.
  6. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. ملاحظة: تركيز الحمض النووي الكشف عن حوالي 300 ميكروغرام / مل. وبالتالي، يجب أن يكون المبلغ الإجمالي المتوقع ~ 6 ميكروغرام. كمية من الحمض النووي لبروتينات أخرى يمكن أن تختلف تبعا لطول CDS، وكمية من بلازميد تستخدم لPCR، ودرجة الحرارة الصلب من الاشعال، وعدد دورة.
  7. تجميد DNA في -20 درجة مئوية لمدة طويلة أو استخدامه بشكل مباشر عن IVT.

3. مراقبة الخطوة: جودة المنتج PCR

  1. تحقق من جودة المنتج PCR بواسطة هلام DNA الكهربائي.
  2. مزيج من المبلغ المطلوب من الاغاروز مع 1X TBE في قارورة. ل1٪ agarose هلام، إضافة 0.5 غرام من الاغاروز إلى 50 مل من 1X TBE.
  3. يذوب الميكروويف حتى الاغاروز. لا ندعه يغلي. تأكد من أن الاغاروز تماما في الحل.
  4. إضافة 5 ميكرولتر هلام حمض النووي وصمة عار إلى 50 مل هلام الاغاروز.
  5. صب جل في مربع agarose هلام، تعيين مشط، والانتظار حوالي 1 ساعة حتى طدت هلام.
  6. إزالة مشط ووضع هلام مربع في علبة الجل.
  7. خلط 2 ميكرولتر (200 نانوغرام) من 80-10،000 BP-DNA سلم و 200 نانوغرام من الناتج PCR مع كل 6X 2 ميكرولتر العازلة تحميل في إجمالي حجم 12 ميكرولتر.
  8. تحميل بعناية عينات من الحمض النووي في الآبار من هلام الاغاروز.
  9. باستخدام 1X TBE كما يعمل العازلة، تشغيل agarose هلام في 100 فولت لمدة 1 ساعة.
  10. تصور العصابات الحمض النووي على نظام التصوير (الشكل 2).

4. النسخ في المختبر (IVT)

  1. ملاحظة: بعد PCR، وتتضخم لإدراج بلازميد وأضاف بولي T-الذيل. خلال IVT، ونسخه من المعلومات الوراثية من الحمض النووي RNA ل. يتم استخدام النص مرنا ولدت لإنتاج البروتينات في الخلايا.
  2. تنظيف منطقة العمل والماصات مع ريبونوكلياز دحل econtamination. استخدام PCR نصائح نظيفة ومعقمة ماصة المزدوج مرشح وكثيرا ما تتغير قفازات للحد من التلوث من رد فعل ستختلط مع RNases.
  3. إعداد NTP / كاب خليط التناظرية كما هو موضح في الجدول رقم 3.
  4. خلط NTP / كاب مزيج دقيق من قبل vortexing التناظرية وتدور باستمرار لفترة وجيزة.
  5. تجميع خليط التفاعل IVT كما هو موضح في الجدول رقم 4.
  6. مزج خليط التفاعل IVT بشكل دقيق من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا. ثم الطرد المركزي أنبوب PCR لفترة وجيزة لجمع الخليط في الجزء السفلي من الأنبوب.
  7. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات في thermomixer.
    ملاحظة: فترة حضانة الأمثل يعتمد على طول إدراج والكفاءة النسخي من قالب معين. لإدراج قصيرة (<500 الإقليم الشمالي)، قد يكون وقتا أطول حضانة المفيد. ويمكن أن يتم تجربة الوقت بالطبع لتحديد فترة حضانة الأمثل لأقصى قدر من العائد. لذا، قم بإعداد ردود فعل IVT، على الامثلهه، ل 1، 2، 3، 4، 6 ساعة، والحضانة بين عشية وضحاها، وتحديد كمية مرنا. يظهر حركية النسخ في المختبر لتوليد EGFP مرنا في الشكل 3.
  8. لإزالة قالب الحمض النووي، إضافة 1 ميكرولتر من الدناز (2 U / ميكرولتر) إلى IVT خليط التفاعل، تخلط جيدا واحتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  9. تنقية خليط التفاعل باستخدام طقم تنقية RNA وفقا لتعليمات manufacturer's. أزل مرنا معدلة من الغشاء عمود الدوران مرتين مع 40 ميكرولتر nuclease خالية من المياه. ملاحظة: تركيز الحمض النووي الريبي الكشف عن حوالي 1500 ميكروغرام / مل. وبالتالي، يجب أن يكون المبلغ الإجمالي المتوقع ~ 120 ميكروغرام. كمية مرنا مركبة للبروتينات أخرى يمكن أن تختلف تبعا لطول CDS وكمية المنتج PCR تستخدم لIVT.

5. علاج تنقية مرنا مع القطب الجنوبي الفوسفاتيز

  1. ملاحظة: يتم التعامل مع مرنا ولدت مع الفوسفاتيز لإزالة 5 "ثلاثيالفوسفات، والتي يمكن التعرف عليه بواسطة RIG-I، وتؤدي إلى تنشيط جهاز المناعة. وعلاوة على ذلك، فإن العلاج الفوسفاتيز يمنع إعادة التعميم في رد فعل الربط الذاتي.
  2. إضافة 9 ميكرولتر من 10X القطب الجنوبي عازلة رد فعل الفوسفاتيز إلى 79 ميكرولتر من حل مرنا النقي. وفي وقت لاحق، إضافة 2 ميكرولتر من الفوسفاتيز القطب الجنوبي (5 U / ميكرولتر) وتخلط بلطف العينة. احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. تنقية خليط التفاعل باستخدام طقم تنقية RNA وفقا لتعليمات manufacturer's. أزل مرنا معدلة من الغشاء عمود الدوران مرتين مع 50 ميكرولتر nuclease خالية من المياه.
  4. قياس تركيز مرنا تعديلها باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تحقق من أن نسبة الامتصاصية في 260 نانومتر / 280 نانومتر (A 260 / A 280) هي ≥ 1.8 ونسبة 260 / A 230 هو 2.0، مما يشير إلى النقاء.
    ملاحظة: العائد الإجمالي المتوقع يجب أن يكون حوالي 90 ميكروغرام، والذي هو sufficieالإقليم الشمالي لحوالي 36 transfections مرنا.
  5. ضبط تركيز مرنا إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر بإضافة nuclease خالية من المياه.
  6. قسامة مرنا في تعديل مأخوذة تستخدم مرة واحدة اللازمة لtransfections وتخزينها في -80 درجة مئوية. تجنب متعددة تجميد والذوبان دورات. أعدت بشكل صحيح وتخزينها مرنا مستقرة لسنوات عديدة. أثناء العمل، والحفاظ دائما مرنا تعديل على الجليد.

6. مراقبة الخطوة: جودة تجميعي مرنا التعديل

  1. تحقق من جودة مرنا تعديلها من قبل جل RNA الكهربائي.
  2. مزيج من المبلغ المطلوب من الاغاروز مع 1X TBE في قارورة. ل1٪ agarose هلام، إضافة 0.5 غرام من الاغاروز إلى 50 مل من 1X TBE.
  3. يذوب الميكروويف حتى الاغاروز. لا ندعه يغلي. تأكد من أن الاغاروز تماما في الحل.
  4. إضافة 5 ميكرولتر هلام حمض النووي وصمة عار إلى 50 مل هلام الاغاروز.
  5. صب جل في صندوق agarose هلام، تعيين مشط، والانتظار حوالي 1 ساعة حتى هلام هو سوليdified.
  6. إزالة مشط ووضع هلام مربع في علبة الجل.
  7. مزيج 3 ميكرولتر (3 ميكروغرام) من 0.5-10 كيلوبايت RNA سلم و 200 نانوغرام من توليفها تعديل مرنا مع كل 7 ميكرولتر العازلة تحميل في الحجم الإجمالي من 10 ميكرولتر. يوصف تكوين العازلة تحميل في الجدول 5.
  8. تفسد السلم والعينات مرنا عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  9. تحميل بعناية سلم وعينات مرنا على agarose هلام 1٪.
  10. أداء الكهربائي على 100 فولت لمدة 1 ساعة باستخدام 1X TBE كما يعمل العازلة.
  11. تصور السلم وشرائح مرنا على نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية وصورة باستخدام نظام التوثيق هلام (الشكل 4).

7. إعداد الخلايا لترنسفكأيشن

  1. لوحة 2 X10 5 الخلايا (خلايا HEK293) لكل بئر من لوحة 12-جيدا.
  2. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة الخلية. ملاحظة: في يوم من ترنسفكأيشن، يجب أن الخلايا لديها REAC[هد] 80-90٪ التقاء.

8. أداء مرنا ترنسفكأيشن من الخلايا

  1. ذوبان الجليد مرنا المعدلة.
  2. توليد lipoplexes لترنسفكأيشن.
  3. إضافة 25 ميكرولتر (2.5 ميكروغرام) من تعديل مرنا و2 ميكرولتر من الدهون الموجبة كاشف ترنسفكأيشن إلى 473 ميكرولتر غروب-MEM (الحد الأدنى الضروري المتوسطة) أنا خفضت المتوسطة المصل لتوليد الخليط ترنسفكأيشن لترنسفكأيشن من بئر واحدة من لوحة 12-جيدا. زيادة في حجم وفقا لعدد من الآبار لتكون transfected. كما سيطرة سلبية، وإعداد خليط ترنسفكأيشن دون مرنا.
  4. تخلط المكونات بلطف بواسطة pipetting. احتضان الخليط ترنسفكأيشن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لتوليد lipoplexes لترنسفكأيشن.
    ملاحظة: الخليط ترنسفكأيشن لا يحتوي على المضادات الحيوية. وبالتالي، الحرص على ضمان العقم أثناء التعامل مع الخلايا.
  5. غسل الخلايا مع 500 DPBS ميكرولتر / جيد.
  6. إضافة 500 ميكرولتر ترنسفكأيشن الخليط جيدا إلى واحد من جيش التحرير الشعبى الصينى 12-جيداالشركة المصرية للاتصالات.
  7. احتضان الخلايا لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية و CO 2 5٪.
  8. نضح الخليط ترنسفكأيشن وإضافة 1 مل كامل مستنبت الخلية إلى الخلايا.
  9. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة الخلية.
  10. أداء مضان المجهري تحليل باستخدام مجهر مضان (الشكل 5). ملاحظة: للنظر في التعبير عن بروتينات أخرى في خلايا، والتي يتم إنتاجها من قبل ترنسفكأيشن مع مرنا غير EGFP الترميز مرنا، ويمكن زراعة خلايا coverslips على. ثم ترنسفكأيشن لا يمكن أن يؤديها والخلايا يمكن ملطخة الأجسام المضادة المناسبة وتحليلها بواسطة المجهر مضان.

9. تحليل تدفق Cytometric من EGFP التعبير في خلايا

  1. إزالة خلية ثقافة المتوسط ​​من الآبار، ويغسل جيدا مع كل 1 مل DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم). إضافة 500 ميكرولتر التربسين / EDTA لكل بئر لفصل الخلايا من سطح وحات ثقافة الخلية. وفي وقت لاحق، إضافة 500TNS ميكرولتر لكل بئر لإبطال نشاط التربسين.
  2. أجهزة الطرد المركزي لفصل الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 x ج في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف ولم يتبق سوى بيليه. resuspend الكرية الخلية في 150 ميكرولتر الحل تثبيت الخلية ونقل تعليق خلية في أنبوب التدفق الخلوي.
  3. تحليل نسبة الخلايا معربا عن EGFP وكثافة مضان باستخدام جيو المتوسط ​​(الوسط الهندسي من كثافة مضان) (الشكل 6).

10. قياس التعبير البروتين على مر الزمن

  1. أداء مرنا ترنسفكأيشن من الخلايا في 3 آبار من لوحة 12-جيدا كما هو موضح في الخطوة 8. بالإضافة إلى ذلك، احتضان 3 آبار للخلايا HEK293 مع خليط ترنسفكأيشن بدون إضافة مرنا.
  2. قياس التعبير عن EGFP 1، 2، وبعد 3 أيام ترنسفكأيشن لتقييم مدة البروتين التعبير (الشكل 7).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام pcDNA 3.3 بلازميد يحتوي على CDS من EGFP، تأسست توليف تعديل EGFP مرنا (الشكل 1). بعد إدراج التضخيم من قبل PCR وبولي T-المخلفات، تم الكشف عن الفرقة واضحة حيث يبلغ طوله حوالي 1100 سنة مضت (الشكل 2). زيادة الوقت IVT تضاف العائد من مرنا (الشكل 3). بعد IVT، تم الكشف عن عصابة مرنا واضحة ويبلغ طوله حوالي 1100 شركة بريتيش بتروليوم، والتي تتطابق مع طول EGFP مرنا ليتم إنتاجها (الشكل 4).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العلاج مرنا لديها امكانات هائلة في مجال الطب التجديدي والعلاج من الأمراض والتلقيح. في هذا الفيديو، ونحن لشرح إنتاج، مرنا استقرت تعديل لتحريض التعبير البروتين في الخلايا. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن أن تتولد مرنا المطلوبة الأخرى. توليف في المختبر المعدلة مرنا يسمح ترنسفكأيشن من الخلايا مع من mRNAs المطلوب للحث على التعبير عن البروتينات المستهدفة. وبالتالي، يتم التعبير عن البروتين المطلوب عابر تحت الظروف الفسيولوجية حتى مرنا تسليمها خارجيا هو المتدهورة تماما.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعلن المؤلفون أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل الصناديق الاجتماعية الأوروبية في بادن-فورتمبيرغ، ألمانيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Cell culture< / strong>
DMEM ، ارتفاع الجلوكوزPAAE15-009
FBSLife Technologies10500
Penicillin / Streptomycin   ؛PAAP11-010100x
L-glutamine   ؛PAAM11-004200 ملي مولار
DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم  PAAE15-002
0.04٪ تريبسين / 0.03٪ EDTA PromocellC-41020
TNSPromocellC-41120تحييد التربسين ، 0.05٪ مثبط التربسين في 0.1٪ BSA
HEK-293 خلاياATCCCRL-1573
المواد الاستهلاكية< / قوية >
ألواح زراعة الأنسجة ، 12-well قارورة ثقافة الخلية Corning3512
(75 سم2) Corning430641
أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة خالية من DNase و RNase سعة 1.5 مل ؛Eppendorf0030 121.589Safe-Lock ، Biopur
15 ml أنابيب مخروطية الشكل   ؛Greiner Bio-One188271
PCR نظيفة ومعقمة epT.I.P.S. أطراف ماصة مزدوجة الفلتر Eppendorf10 & micro; ل: 022491202 ؛ 100 وميكرو ؛ ل: 022491237 ؛ 1,000 & ميكرو; ل: 022491253
Cryovialgreiner bio-one122279-128Cryo.s 
14 مل أنبوب دائري من مادة البولي بروبيلين للثقافة البكتيرية   ؛BD Falcon352059
تضخيم وتنقية البلازميد < / strong>
pcDNA 3.3_eGFP Plasmid   ؛Addgene26822
طلقة واحدة Top10 مكون كيميائيا الإشريكية القولونية InvitrogenC4040-10
ماء معقم (أمبوا)Fresenius Kabi1636071
LB متوسط (Luria / Miller)  Carl RothX968.1يذوب 25 جم L-1 < / sup> في ماء معقم.
LB agar (Luria/Miller) Carl RothX969.1يذوب 40 جم L-1 < / sup> في ماء معقم.
محلول أمبيسيلين الجاهزسيجما ألدريتشA5354100 مجم / مل  
GlycerolSigma AldrichG2025
QIAprep Spin Miniprep Kit  Qiagen27104
< قوي > إنتاج المرنا المرسال < / قوي >
HotStar HiFidelity Polymerase Kit   ؛Qiagen202602
QIAquick PCR Purification Kit  كياجين28106
ميجاسكريبت T7 كيت لايف تكنولوجيزAM1334
5-ميثيل سيتيدين-5 حاد ؛ -ثلاثي الفوسفات   ؛TrilinkN10145-Methyl-CTP
Pseudouridine-5 ´ ;-triphosphate   ;TrilinkN1019Pseudo-UTP
3 ´ ؛ -< em > O < / em > Me-m < sup> 7 < / sup>G (5 & حاد ؛)PPP (5 &حاد ؛)هيكل غطاء الحمض النووي الريبي G التناظرية   ؛نيو إنجلاند بيولابزS1411L
RiboLock RNase مثبطحراري علميEO038140 U/µ ؛ l 
TURBO DNaseLife TechnologiesAM13342 U/µ ل (من مجموعة MEGAscript T7)
فوسفاتيز أنتاركتيكا   ؛مجموعة New England BiolabsMO289S
RNeasy miniq Qiagen74104
RNaseZap solution Life TechnologiesAM9780
transfection< / strong>
Lipofectamine 2000 كاشف الشفاف   ؛Invitrogen11668-019كاشف تعداء الدهون الموجبة
Opti-MEM I Reduced Serum Media Invitrogen11058-021الوسط الأساسي المحسن (MEM) الذي يسمح بتقليل مكملات مصل الأبقار الجنيني (FBS)  
<قوي> هلام الرحلان الكهربائي < / قوي> Agarose
Sigma-AldrichA9539
هلام الحمض النووي المبلور صبغةالبيوتيوم4100310،000x في الماء   ؛
peqGOLD Range Mix DNA-Ladder Peqlab25-2210
<قوي>تحليلات قياس التدفق الخلوي< / قوي>
CellFIX (1x) BDBiosciences34018110x مركز   ؛
<قوي> التمهيدي لإدراج تضخيم وبولي (T) الذيل PCR< / قوي >
التمهيدي الأمامي (HPLC-grade) 10 & micro ؛ MElla Biotech5 & حاد ؛ -TTGGACCCTCGTAC
AGAAGCTAATACG-3 حاد ؛
التمهيدي العكسي (HPLC-grade) 10 & micro; MElla Biotech5 & - T 120 < / sub > - CTTCCTACT
CAGGCTTTATTCAA
AGACCA-3 & acute ؛
Equipment< / strong>
Cell حاضنةBinderCO2< / sub> (5٪) و O2< / sub> (20٪)  
عداد خلية CASY Sch & auml; منضدة عمل معقمة لنظام
 BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH
حاضنة بكتيرية Incutec
حمام
ScanDrop مقياس الطيف الضوئي Analyzetic Jena
PCR thermocycler المركزي الدقيق Eppendorf
Vortexpeqlab
Thermomixerجهاز Eppendorf
Gel للرحلان الكهربائي   ؛Bio-Rad
Gel نظام بيو
FACScan  مجهر BD Biosciences
Fluorescence  نيكون
مجهر التباين الطور زييس
محلول الحد الأدنى من الرفاهيةمائيجهاز الطرد نظام توثيق راد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bangel-Ruland, N., et al. CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis "gene therapy". The journal of gene medicine. , (2013).
  2. Benteyn, D., et al. Design of an Optimized Wilms" Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo. Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134(2013).
  3. Petsch, B., et al. Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection. Nature. 30, 1210-1216 (2012).
  4. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature protocols. 8, 568-582 (2013).
  5. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).
  6. Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors. Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).
  7. Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).
  8. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23, 165-175 (2005).
  9. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).
  10. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).
  11. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).
  12. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).
  13. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).
  14. Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of biological engineering. 8, 8(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HEK293

مقالات ذات صلة