والتجريبية وبروتوكول المعلوماتية الحيوية لتحليل-RNA وما يليها من دور التعرض للضوء الكمون في النمر الآسيوي البعوض، بحمى الضنك

Summary

أصبحت تحليلات

RNA-Seq ذات أهمية متزايدة لتحديد الأسس الجزيئية للسمات التكيفية في الكائنات الحية غير النموذجية. هنا ، يتم وصف بروتوكول لتحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي بين بعوض الزاعجة الزاعجة غير المصابة بالسبات وغير السبتة ، من تربية البعوض ، إلى تسلسل الحمض النووي الريبي وتحليلات المعلوماتية الحيوية لبيانات RNA-Seq.

Abstract

يعد السبات الدوري الضوئي تكيفا مهما يسمح للأفراد بالهروب من البيئات الموسمية القاسية عبر سلسلة من التغيرات الفسيولوجية ، وأبرزها توقف النمو وانخفاض التمثيل الغذائي. يمكن أن يوفر توصيف التعبير الجيني العالمي عبر RNA-Seq رؤى مهمة حول آليات النسخ للسبات الدوري الضوئي. بعوضة النمر الآسيوية ، الزاعجة البيضاء ، هي كائن حي رائع لدراسة قواعد النسخ للسبات نظرا لسهولة تربيتها ، والسبات المستحث بسهولة ، والموارد الجينومية المتاحة. تقدم هذه المخطوطة سير عمل تجريبيا عاما لتحديد الاختلافات النسخية الناجمة عن السبات في A. albopictus. يتم توثيق تقنيات التربية ، والظروف اللازمة للحث على تطور السبات وغير السباتي ، وطرق تقدير النسبة المئوية للسبات في السكان ، واستخراج الحمض النووي الريبي وتقييم سلامة البعوض. يتوج سير العمل لمعالجة بيانات RNA-Seq من أجهزة تسلسل Illumina بقائمة من الجينات المعبر عنها تفاضليا. توضح النتائج التمثيلية أنه يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد الجينات المنظمة بشكل تفاضلي على مستوى النسخ في A. albopictus بسبب الاختلافات الدورية الضوئية. من خلال التعديلات المتواضعة ، يمكن تكييف سير العمل هذا بسهولة لدراسة قواعد النسخ للسبات أو غيرها من سمات تاريخ الحياة المهمة في البعوض الآخر.

Introduction

توفر التطورات السريعة في تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) فرصا مثيرة لاستكشاف الأسس الجزيئية لمجموعة واسعة من التكيفات البيئية المعقدة وراثيا في مجموعة واسعة من الكائنات غير النموذجية ^1-3. هذا النهج قوي للغاية لأنه يؤسس أساسا لدراسات الجينوم السكانية والوظيفية للكائنات الحية ذات التاريخ البيئي أو التطوري المثير للاهتمام و / أو الموصوف جيدا ، بالإضافة إلى الكائنات الحية ذات الاهتمام العملي ، مثل الآفات الزراعية وناقلات الأمراض. وبالتالي ، فإن تقنيات NGS تؤدي إلى تقدم سريع في مجالات البيئة ولديها القدرة على معالجة مشاكل مثل فهم الأسس الميكانيكية للاستجابات البيولوجية لتغير المناخ المعاصر السريع⁴ ، وانتشار الأنواع الغازية⁵ ، والتفاعلات بين المضيف ومسببات^{الأمراض 6،7}.

ترجع الإمكانات غير العادية لتقنيات NGS لمعالجة الأسئلة الأساسية والتطبيقية في علم البيئة وعلم الأحياء التطوري جزئيا إلى حقيقة أنه يمكن تطبيق هذه الأساليب على أي كائن حي بتكلفة معتدلة ممكنة لمعظم مختبرات البحث. علاوة على ذلك ، توفر هذه الأساليب معلومات على مستوى الجينوم دون الحاجة إلى موارد وراثية مسبقة مثل شريحة المصفوفة الدقيقة أو تسلسل الجينوم الكامل. ومع ذلك ، فإن تعظيم إنتاجية تجارب NGS يتطلب دراسة متأنية للتصميم التجريبي بما في ذلك قضايا مثل توقيت النمو وخصوصية الأنسجة لأخذ عينات الحمض النووي الريبي. علاوة على ذلك ، فإن المهارات التقنية المطلوبة لتحليل الكميات الهائلة من البيانات التي تنتجها هذه التجارب ، والتي غالبا ما تصل إلى عدة مئات من الملايين من قراءات تسلسل الحمض النووي ، كانت تمثل تحديا خاصا وحدت من التنفيذ الواسع النطاق لمناهج NGS.

تقدم دراسات RNA-Seq الحديثة حول قواعد النسخ للسبات في البعوض الغازي والمهم طبيا الزاعجة البيضاء مثالا مفيدا لبعض البروتوكولات التجريبية التي يمكن استخدامها لتطبيق تقنية NGS بنجاح لدراسة الأساس الجزيئي للتكيف البيئي المعقد في كائن حي غير نموذجي ^8-10. A. albopictus هو نوع شديد التوغل موطنه آسيا ولكنه غزا مؤخرا أمريكا الشمالية وأمريكا الجنوبية وأوروبا وأفريقيا^11،12. مثل العديد من الحشرات المعتدلة ، تعيش المجموعات المعتدلة من A. albopictus خلال فصل الشتاء عن طريق الدخول في نوع من السكون يشار إليه باسم السبات الدوري الضوئي. في A. albopictus ، يؤدي تعرض الإناث العذراء والبالغات لأطوال النهار القصيرة (الخريفية) إلى إنتاج بيض سبات يكتمل فيه التطور الجنيني ، لكن يرقة الفارات داخل مشيزة البويضة تدخل في توقف النمو الذي يجعل البويضة مقاومة للاندفاع عن تحفيز الفقس^15-17. بيض السبات أكثر مقاومة للجفاف^5،18 ويحتوي على إجمالي الدهون¹⁹ أكثر من البيض غير المصاب. وبالتالي فإن السبات الدوري الضوئي في A. albopictus هو مرونة نمطية تكيفية يتم التحكم فيها من قبل الأم وهي ضرورية للبقاء على قيد الحياة في ظروف الشتاء القاسية في البيئات المعتدلة. على الرغم من الأهمية البيئية المفهومة جيدا للسبات الدوري الضوئي في مجموعة واسعة من الحشرات^20،21 ، فإن الأساس الجزيئي لهذا التكيف الحاسم لا يتميز جيدا في أي حشرة²². في الكائنات الحية مثل A. albopictus التي تخضع لمرض سبات جنيني في مرحلة يرقات الفراات ، يظل من الصعب بشكل خاص فهم كيفية تمرير الإشارة الدورية الضوئية التي تتلقاها الأم إلى النسل وتستمر خلال مسار التطور الجنيني لإحداث توقف في مرحلة يرقات الفراتي.

يصف هذا البروتوكول تربية البعوض والتصميم التجريبي وتحليلات المعلوماتية الحيوية لتجارب NGS (تسلسل النسخ) التي يتم إجراؤها لتوضيح مكونات النسخ للسبات الدوري الضوئي في A. albopictus. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء دراسات إضافية عن السبات في A. albopictus ، ويمكن تكييفه للتحقيق في السبات في الأنواع الأخرى وثيقة الصلة مثل بعوض الإيدين الآخر الذي يخضع لسبات البيض²³ ، كما أنه أكثر صلة بشكل عام بتوظيف مناهج NGS لدراسة قواعد النسخ لأي تكيف معقد في أي حشرة.

Protocol

1. اليرقية تربية من اثنين A. المجموعات الضنك إلى سن الرشد

1. تعيين اثنين خزانات الضوئية مع الإضاءة القابلة للبرمجة في 21 درجة مئوية لمدة الأمثل السكون التعبير ¹⁶ والرطوبة النسبية حوالي 80٪.
   1. برنامج مجلس الوزراء واحد ل16L: ضوء 8D: دورة الظلام (غير السكون الذي يحفز LD الضوئية). تعيين مجلس الوزراء الثاني ل8L: 16D ضوء: دورة الظلام (السكون حمل) ^13.
   2. "أضواء على 'برنامج في نفس الوقت في كل من خزائن لمزامنة الوقت الساعة البيولوجية بين الفترات الضوئية.
2. حساب كمية من البيض اللازمة لأداء التجربة. تهدف ل300-500 بيضة في القفص. ما لا يقل عن ثلاثة تكرار أقفاص السكون وثلاثة تكرار هناك حاجة إلى أقفاص غير الكمون لتوليد RNA. هذه المجاميع إلى كاليفورنيا. 1،800-3،000 البيض في التجربة.
   1. يفقس البيض عن طريق غمر أوراق البيض في كاليفورنيا. 500 مل من H ₂ O. منزوع الأيونات
   2. إضافة <م> كاليفورنيا. 1 مل الطين المواد الغذائية التي تتكون من الكلب الأرض الغذاء والماء المالح الروبيان كما هو موضح سابقا ^24. تغطية الحاويات مع شبكة، والحفاظ على شبكة في مكان مع الشريط المطاطي.
   3. ضع في مجلس الوزراء LD الضوئية لكاليفورنيا 24 ساعة.
3. نقل اليرقات إلى 10 × 10 × 2 سم بيتري أطباق مليئة كاليفورنيا 90 مل منزوع الأيونات H ₂ O.
   1. الحفاظ كاليفورنيا 30 يرقات لكل طبق. نقل اليرقات لتنظيف الأطباق كل 48-72 ساعة، على سبيل المثال في أيام الاثنين والأربعاء، والجمعة (MWF) ^24.
   2. تغذية كاليفورنيا 1 مل الطين المواد الغذائية التي تتكون من الكلب الأرض الغذاء والماء المالح الروبيان في المياه منزوع الأيونات كل MWF كما سبق وصفها ^24.
4. انشاء 03:57 أقفاص الكبار لكل معاملة الضوئية، حيث يضم كل قفص لتكرار البيولوجي.
   1. من جانبي 9.5 L الدلاء، وقطع واحد 10-ب-14 سم حفرة، وثقب آخر مع 15 سم القطر. شركةVER الأول مع شبكة. قطع ما يقرب من طول القدم لتخزين العظام، والغراء طرف واحد في جميع أنحاء داخل حفرة أخرى.
   2. قطع نهاية سفح تخزين وإيقاف عقدة مغلقة - مفتوحة فقط عند الحاجة الوصول إلى المناطق الداخلية من القفص. لغطاء القفص، وقطع من كل من الداخلية، ولم يتبق سوى الحافة، واستبدال البلاستيك الداخلية مع شبكة ^24.
   3. لاحظ الضوئية، وتكرار العدد، قفص تاريخ البدء، وغيرها من المعلومات ذات الصلة إلى التجربة مع علامة دائمة على جانب القفص.
5. تبطن الجزء السفلي من أقفاص الكبار مع ورق الترشيح الرطب. بلل ورقة الترشيح مع ما يكفي منزوع الأيونات H ₂ O لزيادة الرطوبة المحلية في القفص، ولكن تجنب المياه الراكدة، والتي يمكن أن تحفز وضع البيض على ورقة الترشيح ^24. تحقق من ورقة الترشيح يوميا لمدة التجفيف، وإعادة الرطب عند الضرورة.
6. لإنتاج البيض كافية لمكتبة RNA، وتشمل على الأقل 100 إناث / 9.5 L كاليفورنياجنرال الكتريك، مع عدم وجود أكثر من 500 البعوض في القفص.
7. جمع MWF الشرانق وضعها في كوب صغير من H ₂ O نظيفة في كثافة لا يزيد عن 50 الشرانق في 25 مل H ₂ O. نقل كوب الشرانق إلى قفص الكبار. مكان أقفاص في مجلس الوزراء الضوئية منها - A. الضنك الشرانق وحساس ^15.
8. ضمان اليومية ان H ₂ O في أكواب غير نظيفة وواضحة، وإزالة الشرانق ميت، لأن تراكم الشرانق ميت يمكن أن يسبب النفوق الجماعي. إزالة H ₂ O أكواب بعد ظهور كل الشرانق.
9. وضع الزبيب العضوية على شبكة العليا من القفص لتوفير السكر للبالغين ظهرت. مراقبة الزبيب، وتغييرها كل 3-5 أيام لمنع تراكم العفن.

2. صيانة الكبار إلى السماح التزاوج وإنتاج البيض

1. الحفاظ على أقفاص في الرطوبة العالية (حوالي 80٪) من بطانة أسفل القفص مع ورق الترشيح رطبة، وتوفير الوصول إلى الزبيب غير متعفن، كما هو موضح أعلاه (Sectiإضافات 1.5 و 1.9).

3. الدم التغذية

1. الاستعداد للإناث الدم التغذية بين يومين إلى ستة أيام بعد eclosion لضمان أن الإناث قد تعرضت لثمانية أيام على الأقل قصيرة لا لبس فيها، قبل أن يبدأ وضع البيض لنحو 100 بيضة٪ السكون ^14.
2. إعداد نظام تغذية Hemotek غشاء. قم بتوصيل وحدة التغذية في امدادات الطاقة. ضبط درجة الحرارة كل وحدة إلى 37 درجة مئوية باستخدام المسمار تعديل. استخدام مقياس الحرارة الالكتروني والتحقيق لقياس درجة حرارة وحدة التغذية أثناء المعايرة.
3. إعداد الخزان وجبة. تمتد مربع من غشاء الكولاجين التغذية خلال فتحة الخزان وجبة وضمان الحصول عليها مع يا الدائري. سحب بعناية الزوايا لإزالة التجاعيد. تقليم الغشاء الزائدة مع مقص.
   ملاحظة: غشاء الكولاجين قد لا تعمل بشكل جيد لجميع أنواع البعوض، وأنه قد يكون من الضروري محاولة عدة أنواع للعثور على غشاء الأمثل إذا كان يعمل معالأنواع الأخرى من A. الضنك. بارافيلم يعمل بشكل جيد مع بعوض الكيولكس.
   1. إذا تم تخزين الدم المجمدة، وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل قبل استخدام.
   2. عقد الخزان ذلك الغشاء لأسفل، غير معتمد، والموانئ ملء تواجه ما يصل. استخدام ماصة نقل أو حقنة لملء الخزان مع ما يقرب من 3 مل من الدم الكامل من الدجاج الذي لديه سترات الصوديوم بوصفها مضادة للتخثر. ختم ملء الموانئ مع المقابس مصنوعة من البلاستيك.
4. إرفاق أعدت الخزان إلى وحدة التغذية من قبل الشد وضعها على مسمار على لوحة نقل الحرارة على الجزء السفلي من وحدة التغذية. عكس وحدة التغذية ووضعه على أعلى القفص، جنبا غشاء أسفل، بحيث البعوض يمكن أن تغذي من خلال شبكة من القفص. حافظ على وحدة التغذية في قفص لمدة 45 دقيقة لتحقيق أقصى قدر من التغذية.

4. الحث على وضع البيض

1. أربعة إلى خمسة أيام بعد انتهاء وجبة الدم وتجهيز كل قفص مع الظلام الملونة 50 مل جحتى اصطف مع غير مقصور رقة إنبات البذور (ورقة البيض) أو بمادة منشفة غير ابيض الورق وملء منتصف الطريق مع الماء منزوع الأيونات ^9. إذا كان أكثر من 250 البعوض هي في قفص، استخدم كوبين.
   ملاحظة: للحصول على أقفاص صغيرة أو قنينة واحدة من الإناث، "ضخ القش" في حاويات وضع البيض قد يزيد وضع البيض بسبب رائحة النباتات الجرثومية ^25.

5. جمع وتخزين البيض

1. بدء جمع البيض في غضون 4-5 أيام من تغذية الدم لإنتاج البيض قمم عادة بعد حوالي خمسة أيام التغذية الدم، ومن ثم ينحسر خلال الاسبوع المقبل.
2. تختلف وتيرة جمع البيض على الضروريات من التجربة. لأغراض عامة، وجمع الأوراق البيض على جدول زمني MWF. إزالة الأوراق البيض من كل قفص واستبدالها مع ورقة جديدة. ضع أوراق إزالتها مؤخرا في أطباق بتري وتخزينها في SD مجلس الوزراء الضوئية لتجنب آثار الخلط من تخزين البيض.
3. السماح الأوراق البيض لإعادة الرئيسية الرطب لمدة 2 أيام بعد وضع البيض للسماح بتشكيل المصلي بشرة، والذي يزيد من مقاومة جفاف البيض ^26.
4. ما يقرب من 48 ساعة جمع آخر، والبيض الجافة في الهواء الطلق. تجفيف الورق مثل أنه يعرج ورطبة قليلا لمسة، ولكن ليس الرطب حتى أن ورقة مظلمة من H ₂ O أو يحفز الفقس من البيض.
   ملاحظة: "× 4" ورقة 6.5 قد يستغرق حوالي 3.5 ساعة لتجف. الحرص على عدم الإفراط في تجفيف أوراق البيض، لأن ذلك سيؤدي إلى تجفيف البيض ^27.
5. احتياطي البيض إضافية من كلا LD وSD الضوئية لتقييم حالات السكون وتفسير تأثير دور التعرض للضوء (انظر قياس الكمون، القسم 6).
6. للتخزين على المدى الطويل، والحفاظ على الأوراق البيض في 21 ° C وحوالي 80٪ الرطوبة في أطباق بتري. حافظ على أطباق بتري في حاوية تخزين تثبرور مع قارورة من الماء للحفاظ على رطوبة المحلية والتطور الجنيني يأخذ أربعة إلى خمسة أيام في 21 ° C.

ove_title "> 6. قياس الكمون الإصابة

1. استخدام أجنة محفوظة إضافية (انظر تحفيز وضع البيض، القسم 4) التي هي 7-20 يوما من العمر لقياس استجابة السكون.
2. تسجيل عدد من البيض موجودة على كل ورقة بيضة.
3. تحفيز البيض ليفقس من قبل غمر تماما أوراق البيض الفردية في طبق 90 مل بيتري مع ما يقرب من 80 مل H ₂ O. منزوع الأيونات إضافة ما يقرب من 0.25 مل الطين الغذاء.
4. بعد 24 ساعة حصر عدد الفقس الأولى يرقات العمر. وضع طبق بتري على سطح أسود لتصور اليرقات ووضع مصدر الضوء على جانب واحد من الطبق. سوف اليرقات الابتعاد عن مصدر الضوء، والسماح لرصيده واضح لليرقات الفردية. إزالة اليرقات الفردية مع ماصة في حين عد لمنع سرد اليرقات الفردية.
5. أوراق مكان البيض في طبق بيتري جديدة وإعادة الجافة. إعادة يفقس البيض بعد ~ 1 الأسبوع، ومرة ​​أخرى تتطابق البيض تحاك باستخدام الأسلوب أعلاه.
6. أوراق مكان البيض مع ش المتبقية البيض ن تحاك في أطباق بتري جديدة 90 مل مع ما يقرب من 80 مل تبيض حل ^28. تأكد من أن الأوراق البيض ومغمورة تماما في الحل تبيض وترك بين عشية وضحاها تحت غطاء الدخان لتجنب رائحة التبييض.
   ملاحظة: التبييض حل يمكن تخزينها ل~ 1 أسبوع في 4 درجات مئوية، ولكن ينبغي على خلاف ذلك أن تدلي جديدة.
7. تفقد البيض باستخدام المجهر الضوئي كما تبيض سوف مسح المشيمه والسماح التصور للأجنة والبيض من الامم المتحدة وتفقس. إذا تم أجنة البيض، فإن البيض يكون لها لون من البيض مع عيون الظهور عن اثنين من النقط السوداء الصغيرة عكس بعضها البعض على الجانب الظهري. حصر عدد من الامم المتحدة وفقست، البيض المحتوي ^13.
8. تحديد حالات السكون مع الصيغة التالية:٪ السكون = لا. البيض المحتوي الامم المتحدة التي تحاك / (رقم بيض فقس + رقم البيض من الامم المتحدة وتحاك المحتوي) × 100 ^(13).

7. استخراج الحمض النووي الريبي من البيض / pharate يرقات

ontent "> ملاحظة: استخدام Trizol في غطاء تدفق الصفحي.

1. فرشاة بيض البعوض التي تحتوي على أجنة نامية أو يرقات pharate في نقاط زمنية تنمية متميزة من الأوراق البيض إلى المطاحن الزجاج باستخدام فرشاة شعر الجمل. طحن البيض في Trizol (1 مل لكل 50-100 ملغ من الأنسجة) حتى المسحوق تماما. استخدام لا يقل عن 400 بيضة في مكتبة لانتاج RNA كافية.
   1. بدلا من ذلك، والمفاجئة البيض تجميد في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية في أنابيب microcentrifuge لمدة تصل إلى شهر قبل طحن في Trizol.
2. أداء استخراج الحمض النووي الريبي في Trizol تليها الأيزوبروبانول هطول الأمطار وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
3. علاج مقاعد البدلاء مع حل ريبونوكلياز إزالة التلوث أو غيرها من العوامل لإزالة أي nucleases المتبقية لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي.
   1. علاج الحمض النووي الريبي المستخرج مع الدناز. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، احتضان عينات الحمض النووي الريبي مع الدناز لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C. استخدام 1 & #181؛ ل الدناز لمدة تصل إلى 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في رد فعل 50 ميكرولتر. زيادة كمية الدناز إذا كان هناك أكثر من 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في رد فعل واحد.
   2. تعطيل الدناز عن طريق إضافة 5 ميكرولتر الدناز علقت تعطيل كاشف. احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، والخلط ثلاث مرات خلال فترة الحضانة (vortexing لطيف).
   3. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 1.5 دقيقة. نقل طاف تحتوي على عينات الحمض النووي الريبي المعالجة لأنابيب جديدة لخطوات لاحقة.
4. تقييم نوعية من مجموع عينات الحمض النووي الريبي عن طريق قياس التألق. إرسال العينات إلى مرفق التخصص مع أداة المناسب لهذه المهمة. ومرفق أداء على رقاقة الكهربائي للهلام لتحديد أحجام الأنواع RNA في العينة، التي تصور صبغة الفلورسنت تغرس في رقاقة. سيتم إرجاع النتائج باعتبارها رحلاني.
   1. تحديد سلامة من مجموع عينات الحمض النووي الريبي عن وجود أو عدم وجود نواتج التحلل، كما يتضح من س جودالقمم و بين 18S و5S قمم RNA الريباسي على رحلاني الناتجة (الشكل 1B).

8. RNA تسلسل

1. إرسال مجموع عينات الحمض النووي الريبي ذات جودة عالية بما فيه الكفاية (الشكل 1A) وكمية (عادة> 3 ميكروغرام في المكتبة) إلى مركز تجاري تسلسل لبناء أثرى المكتبات مرنا تقرن نهاية ومرنا التسلسل، بعد البروتوكولات القياسية.
2. في حالة استخدام حارة أكثر من واحد للتسلسل تجربة واحدة، وتقسيم المكتبات الفردية إلى مسربين لتسلسل لحساب التباين التقني فيما بين الممرات خلال التسلسل.

9. lllumina مقروءة تنظيف

ويلخص الشكل 2 الجزء المعلوماتية الحيوية من هذا البروتوكول: ملاحظة. للحصول على قائمة كاملة لجميع البرامج والموارد المستخدمة في قسم المعلوماتية الحيوية من هذا البروتوكول، والرجوع إلى الجدول 1. وفيبالإضافة إلى ذلك، الملف التكميلي 1 يحتوي على أمثلة سطر الأوامر لكل من المعلوماتية الحيوية الخطوات التالية البروتوكول.

1. استخدام ssaha2 ²⁹ (الجدول 1) لتحديد مباريات٪ هوية 95 أو أعلى لقاعدة البيانات NCBI UniVec الأساسية (الجدول 1)، A. الضنك تسلسل الرنا الريباسي (بنك الجينات # L22060.1)، ومحولات التسلسل (أمثلة مفصلة سطر الأوامر المتوفرة في ملف إضافي 1). إزالة أزواج القراءة مع المباريات باستخدام بيرل أو أداة البرمجة مماثلة، على سبيل المثال من خلال تكييف بيرل النصي المقدمة (ملف التكميلي 2).
2. نظيفة المتبقية يقرأ مع الحزمة SolexaQA ³⁰ (الجدول 1؛ التكميلي ملف 1): تقليم المناطق بنتيجة يعادل PHRED أقل من 20 باستخدام الإعدادات الافتراضية من DynamicTrim.pl.
   1. إزالة يقرأ أقصر من 25 نقطة مع LengthSort.pl على حد سواء إلى الأمام وعكس يقرأ في وقت واحد. تقييم جودة الملفات تنظيفها fastq مع FastQC (الجدول 1 ) - على وجه الخصوص، تحقق من جودة تسلسل لكل قاعدة ونقاط جودة لكل تسلسل هي أعلى من 20.

10. التطبيع الرقمية

1. أداء جولة واحدة من التطبيع الرقمي على تنظيف يقرأ باستخدام أداة الخمير ³¹ (الجدول 1؛ التكميلي ملف 1)، normalize-by-median.py على وجه التحديد (باستخدام حجم ك مير 20، تغطية قطع من 20، والعاشر = 1e10).
2. بدلا من ذلك، إذا كان الجهاز مع RAM عالية متوفرة (مئات باريه)، استخدم الثالوث النصي normalize_by_kmer_coverage.pl (الجدول 1).

11. دي نوفو الجمعية Transcriptome على

1. الحصول على حق الوصول إلى مجموعة الكمبيوتر أو الكمبيوتر مع ما يصل إلى 256 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي و 24 وحدات المعالجة المركزية، اعتمادا على حجم التجمع.
2. استخدام الثالوث ³² (الجدول 1؛ الملف التكميلي 1) لتجميع مجموعة الى contigs القراءة تطبيع رقميا. للحد مناستخدام الذاكرة، واستخدام --min_kmer_cov 2.

تقييم جمعية 12.

1. تشغيل assemblathon_stats.pl من المشروع Assemblathon2 ³³ على الانتاج contig الثالوث. هذا السيناريو يؤدي العمليات الحسابية الأساسية ذات الصلة لتقييم جودة التجميع، مثل عدد من السقالات، N50، تكوين التجمع، وأكثر من (الجدول 1؛ ملف إضافي 1).

13. الشرح من Transcriptome على تجميعها

1. أداء Blastx (الجدول 1) من التجمع ضد مجموعة البروتين المرجعية؛ للبعوض، ذبابة الفاكهة، الأنوفيلة الغامبية، بعوض الكيولكس، والزاعجة المصرية إشارات مناسبة. على وجه التحديد، تنسيق ملف FASTA البروتين مرجعية للانفجار، تليها blastx (ملف إضافي 1).

14. خريطة يقرأ إلى الجمعية عن طريق RSEM ³⁴ (الجدول 1)

1. إنشاء ملف "نسخة إلى الجينات خريطة"، الذيالعمود الأول يحتوي على معرفات الجينات المرجعية، والعمود الثاني معرفات contig. في محرر جداول البيانات، ومبادلة الأعمدة الأولى والثانية من إخراج Blastx، وكتابة هذه الأعمدة إلى ملف txt. استخدام البرنامج LINEBREAK لتحويل فواصل سطر في ملف txt مما أدى إلى تنسيق يونكس.
2. إنشاء قاعدة بيانات مرجعية من ملف FASTA Transcriptome على استخدام النصي rsem-إعداد الإسناد، المنصوص عليها في صفقة RSEM (ملف إضافي 1).
3. حساب القيم التعبير بشكل منفصل لكل مكتبة باستخدام الأمر rsem-حساب-التعبير، المنصوص عليها في صفقة RSEM (ملف إضافي 1). كما يقرأ، استخدام الملفات المقترنة fastq الناتجة عن خطوات تنظيف قراءة (الخطوة 9.2).
   1. إذا تم تقسيم RNA من تكرار البيولوجي في مسربين للتسلسل، تشمل كلا من ملفات fastq في حساب التعبير لتوليد ملف واحد.
4. تحويل نتائج التعبير من كل مكتبة لمصفوفة معالجتها بسهولة من قبل ع الآخركل من برنامج باستخدام المقدمة النصي rsem-توليد للبيانات المصفوفة، المنصوص عليها في صفقة RSEM (ملف إضافي 1).

15. تحليل التعبير التفاضلي

1. تثبيت R والمقلم (الجدول 1).
2. استخدام read.delim لتحميل النتائج RSEM من الخطوة 14.3 (ملف إضافي 1). إذا لزم الأمر، على مدار التهم إلى أقرب عدد صحيح.
   ملاحظة: يوصي دليل المقلم الحد من مجموعة البيانات إلى الجينات مع ارتفاع التعبير يكفي للكشف عن أهمية.
3. لتنسيق البيانات لالمقلم، وتوليد كائن DGEList من ملف البيانات تحميل (ملف إضافي 1). ثم، وتطبيع البيانات باستخدام TMM التطبيع (ملف إضافي 1). تقدير التفرق المشتركة وtagwise من البيانات (ملف إضافي 1).
4. تحديد الجينات وأعرب تفاضلي مع Benjamini-هوشبرج تصحيح ف قيمة <0.05 (ملف إضافي 1). رسم توزيع سجل أضعاف تغيير مقابل وفرة (ملف إضافي 1).

Results

أظهر التألق اثنين من عينات الحمض النووي الريبي تمثيلية شريطين في حوالي 2،000 الإقليم الشمالي (الشكل 1A، B). وتتألف 28S الحشرات RNA الريباسي اثنين من سلاسل عديد النوكليوتيد عقدت معا عن طريق روابط هيدروجينية، التي تتعطل بسهولة عن طريق التسخين وجيزة أو وكلاء التي تعطل روابط هيدروجينية ^35. مما أدى مكونات هما تقريبا نفس حجم 18S الريباسي الحمض النووي الريبي. أظهرت عينة الحمض النووي الريبي الثانية مستويات عالية من التدهور (الشكل 1B).

Discussion

ويعرض هذا البروتوكول طرق لاكتشاف الجينات وأعرب تفاضلي بسبب photoperiodically السكون الناجم في A. الضنك. بروتوكول مهم في أنه يجمع بشكل فريد تربية البعوض وتقنيات المعلوماتية الحيوية لجعل جميع جوانب التجريبية من برنامج الفيزيولوجيا الجزيئية في متناول المستخدمين المبتدئين - ولا سيما تلك التي تركز على الاستجابة السكون دور التعرض للضوء. الأساليب القائمة، على حد علمنا، لا تقدم الكثير من التفاصيل في البروتوكول تربية - التي غالبا ما تكون ضرورية لتحديد الأخطاء فترة تربية - كما أنها...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
حاضنة - موديل 818	Thermo-Scientific	3751	120 فولت
غرفة بيئة خاضعة للرقابة	Thermax Scientific	N / A	غرفة بيئة يتم التحكم فيها تم بناؤها وفقا لمواصفات مخصصة بواسطة Thermax Scientific Products. بديل أكبر للحاضنة. http://thermmax.com/
لمبة فلورسنت باردة	فيليبس	392183	4 واط
طبق بتري 100 مم × 20 مم	ورق ترشيح فيشر	08-772-E
20.5 سم	فيشر	09-803-6J
9.5 لتر دلو	بلاستيكان	بوي المنتجات	http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
شبكة البعوض البيضاء		جوان 10173292	http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
جوارب العظام	Albahealth	23650-040	رقم المنتج 081420
الزبيب العضوي	UPC الخاص بنيومان	: أكواب 884284040255
Oviposition (بني)	فيشر ساينتفيك	03-007-52	المنتج هو في الواقع زجاجة كهرمانية سعة 125 مل رأينا الجزء العلوي منها.
المناشف الورقية المعاد تدويرها	الجيل السابع	30BPT120
وحدات Mates مجموعة Tupperware Square	Tupperware		http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
طاحونة زجاجية	Corning Incorporated	7727-2	تكسر مطاحن المناديل Tenbroeck البيض وتطلق الحمض النووي الريبي في كاشف TRI.
كاشف TRI	Sigma Aldrich	T9424	ضع كاشف TRI مل لكل 50-100 مجم من الأنسجة. تحذير &# 8212; هذا الكاشف سام.
TURBO خالية من الحمض النووي	Ambion / Life Technologies	AM1907	تولد هذه المجموعة عائدا أكبر من معالجة DNase التقليدية متبوعا بتنظيف الفينول / الكلوروفورم ، وهي أسهل في الاستخدام.
RNaseZap	Ambion / Life Technologies	AM9782	ضعه بحرية على أسطح مقاعد البدلاء وأي معدات قد تكون ملامسة لعينات الحمض النووي الريبي. المحلول قلوي / تآكل قليلا ، ويمكن أن يسبب تهيجا ويكون ضارا عند ابتلاعه.
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA	ضع ما يصل إلى 12 عينة من الحمض النووي الريبي على شريحة واحدة.
مغذي غشاء Hemotek	Hemotek	5W1	يوفر هذا النظام 5 محطات تغذية يمكن استخدامها في وقت واحد. يتضمن وحدة طاقة PS5 وسلك طاقة. 5 مغذيات FUI + خزانات الوجبات والحلقات O ؛ المقابس البلاستيكية ، غشاء تغذية الكولاجين Hemotek ؛ أداة ضبط درجة الحرارة وأداة استخراج المكونات. العنوان البريدي للشركة هو: Hemotek Ltd. الوحدة 5 محكمة الاتحاد. آلان رامسبوتوم واي. هاروود العظيم. لانكشاير ، المملكة المتحدة ؛ BB6 7FD ؛ هاتف: +44 1254 889 307.
ميزان الحرارة الرقمي والمسبار	Hemotek	MT3KFU	MicroT3 ومسبار KFU. يستخدم هذا لضبط درجة حرارة كل وحدة تغذية FUI.
دجاج كامل الدم ، غير معقم مع سترات الصوديوم	Pel-Freez Biologicals	33130-1	تجميد 500 مل من الدم وتخزينها في 20 مل من الكميات عند -80 &# 176 ؛ C لمدة تصل إلى 1 سنة. قم بإذابة الدم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.