يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التلاعب في الغدة الدمعية الفئران

21K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51970

⸱

نوفمبر 18, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Craniofacial and Mesenchymal Biology, Cell and Tissue Biology, University of California San Francisco

في هذه المقالة

ملخص

الغدة الدمعية (LG) هي جهاز المتفرعة التي تنتج مكونات المائية للدموع اللازمة للحفاظ على صحة العين والرؤية. نحن هنا وصف الفئران LG تشريح والثقافة فيفو السابقين تقنيات فك مسارات الإشارات المشاركة في LG التنمية.

الملخص

الغدة الدمعية (LG) تفرز الدموع المائية اللازمة للحفاظ على بنية ووظيفة القرنية، وهي النسيج الشفاف الأساسية للرؤية. في الإنسان يقيم في LG واحدة في المدار فوق نهاية الجانبية من كل عين تقديم الدموع على سطح العين خلال 5 - 3 قنوات. الماوس لديه ثلاثة أزواج من الغدد العين الرئيسية، والأكثر درس منها الغدة الدمعية exorbital (LG) الواقعة الأمامي وبطني إلى الأذن. على غرار أجهزة غدي أخرى، فإن إل جي تطور من خلال عملية التشكل المتفرعة الظهارية التي برعم الظهارية واحد داخل اللحمة المتوسطة المختصرة يخضع جولات متعددة من برعم وتشكيل لاصق لتشكيل شبكة مترابطة معقدة من عنيبات ​​إفرازية والقنوات. وقد تم توثيق هذه العملية معقدة بشكل جيد في العديد من أجهزة الظهارية أخرى مثل البنكرياس والغدة اللعابية. ومع ذلك، فقد كانت LG أقل تكتشف الكثير وآليات السيطرة على التشكل وضعيفة تحتوقفت. نعتقد أن هذا التمثيل الناقص كنظام النموذج هو نتيجة للصعوبات المرتبطة الحقائق، تشريح وزراعة وLG. وبالتالي، هنا وصفنا التقنيات لتشريح الجنينية الحصاد وبعدها LG وطرق فيفو السابقين الثقافة من الأنسجة.

المقدمة

الغدة الدمعية (LG) هي المسؤولة عن إفراز المسيل للدموع المائي الحرج لحدة البصر والصحة، والصيانة، وحماية خلايا سطح العين. النتائج LG الخلل في واحدة من اضطرابات العين الشائعة والمنهكة: مرض العين الجافة تعاني من نقص مائي، التي تتميز تهيج العين، والحساسية الخفيفة، وانخفضت الرؤية 1. في الإنسان يقيم LG في المدار فوق نهاية الجانبية للعين حيث 5 - 3 مطرح الدموع القنوات ديعة على سطح العين. الماوس لديه ثلاثة أزواج من الغدد العين الرئيسية، والأكثر درس منها الغدة الدمعية (LG) الواقعة الأمامي وبطني إلى الأذن (exorbital) بالدموع السفر إلى العين عبر القناة المفرغة واحد. على غرار أجهزة غدي أخرى، فإن إل جي تطور من خلال عملية التشكل المتفرعة الظهارية التي برعم الظهارية واحد داخل اللحمة المتوسطة المختصرة يخضع جولات متعددة من برعم وتشكيل لاصق للم شبكة مترابطة معقدة من عنيبات ​​إفرازية والقنوات (الشكل 1) 2. خلال تطوير يصبح ظهارة أوعية دموية، وكذلك بشدة معصب من قبل الأعصاب الحركية للعقدة الجناحية وإلى حد أقل من قبل الأعصاب متعاطفة من العقدة الرقبية العلوية 3. التفاعل بين كل هذه الخلايا، أي أنواع الخلايا العصبية، الظهارية، البطانية والوسيطة، ضرورية لوظيفة وصيانة الأنسجة الكبار. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية الكامنة تنسيق LG التنمية والتجدد وكذلك كيف يرشد نوع الاتصال بين الخلايا هذه العمليات لا تزال غير واضحة.

وقد سمح ظهور الجنينية الثقافة فيفو السابقين تقنيات تحديد مسارات النمو والتجدد في العديد من الأجهزة المتفرعة 4. زراعة فيفو السابقين يعطي للباحث القدرة على التعامل مع الجهاز (ليالميكانيكي أو وراثية أو كيميائية) في ظل ظروف محددة بالإضافة إلى تميز الجهاز وتطوير خلية خلية التفاعل في الوقت الحقيقي. إل جي exorbital من الفأرة هي قابلة للغاية لهذه التقنية وحددت الدراسات التي أجريت مؤخرا الأنظمة التي تنظم تطوره 2،5 الإشارة. ومع ذلك، على الرغم من الحاجة إلى فهم الاشارات الجزيئية التي تقوم عليها LG التطوير والتجديد، وأنه لا يزال حاليا دراسة سلوكه، على الأرجح بسبب الصعوبات التقنية في عزل الجهاز. في هذه الورقة، ونحن تصف كيفية عزل وتنفيذ فيفو السابقين الثقافة من الفئران الجنينية LG لتحديد البرامج التنموية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الأعمال الحيوان تحت يتفق تماما مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو.

1. الفأر الجنينية الغدد الدمعية (LG): حصاد وتسليخ مجهري

  1. وفقا للإجراءات المعتمدة من الحيوانات المؤسسية لجنة أخلاقيات البحث العلمي، والموت ببطء توقيت الحوامل CD-1 (أو المعدلة وراثيا) من الإناث مع ارتفاع CO 2 الاستنشاق، تليها تأكيد خلع عنق الرحم للأجنة الحصاد في اليوم الجنينية المناسب. تعيين يوم المهبلي اكتشاف المكونات E0.
    ملاحظة: الغدد الدمعية (خطابات الضمان) يمكن حصادها من برعم واحد E14 المرحلة فصاعدا. ومع ذلك، E16 (من 5 - 10 براعم) الأجنة تعطي نتائج أكثر اتساقا للثقافة فيفو السابقين.
  2. تعقيم الخامسالجانب entral من الفأرة باستخدام الايثانول 70٪. قرصة الجلد وإجراء شق في خط الوسط مع مقص جراحي معقم. قطع طريق الجلد أو الغشاء البريتوني لفضح تجويف البطن. إزالة قرون الرحم 2 عن طريق قطع على طول مسراق الرحم على رأس كل قرن الرحم ومكان في برنامج تلفزيوني الباردة (الفوسفات مخزنة المالحة) أو DMEM سائل الاعلام F12 تستكمل مع 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.
  3. باستخدام ملقط (رقم 5)، وإزالة الأجنة من الحويصلات الأمنيوسي ووضع في طبق بتري معقمة الثانية تحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة. يجب الحرص على عدم لمس العينين أو منطقة الرأس.
  4. وضع الجنين على مجهر تشريح مع قاعدة تضوء. إذا كان الجنين هو الخطوات 1،5-1،7. إذا الأجنة> E17، قد تكون هذه الخطوات مفيدة ولكنها ليست ضرورية، لذلك انتقل إلى الخطوة 1.8.
  5. قطع الرأس عن الجذع أسفل الفك السفلي (الخطوة 1، الشكل 2) النقيبالجا مشرط معقم (# 10 شفرة). تدوير الرأس بحيث يكون الفك السفلي هو الآن على لوحة تشريح. استخدام ملقط لتحقيق الاستقرار في الرأس ومشرط لإزالة حوالي ¼ من الجانب الظهري من المخ (الخطوة 2، 1 قطع شارع، الشكل 2) - وهذا أمر مهم خاصة عندما يصلب الغضروف حول E15.
  6. توجيه رأسه بحيث يمكن أن تخترق مشرط الأنف بين العينين. اجراء خفض خلال وسط الرأس، بحيث العيون الآن على نصفين منفصلين (الخطوة 2، 2 قطع الثانية، الشكل 2).
  7. باستخدام اثنين # 5 ملقط، تأخذ نصف واحد من الرأس وإزالة الأنسجة الزائدة (راجع الخطوة 3، الشكل 2). تأكد من توجيه رئيس حتى لا يتم فقدان LG (الموجود في الركن الخلفي السفلي للعين) في هذه العملية إزالة. إزالة الشلل الزائد والغضاريف، والأنسجة الأنفية المحيطة بها، وتحت العين. منذ الغدة هي بالكاد مرئية في هذه المرحلة، وضمان العين وموجهة بشكل صحيح بعد إزالة الأنسجة الزائدة رس تجنب فقدان موقع LG.
  8. انتزاع بعناية البشرة من الخلفية، الزاوية السفلى من العين مع ملقط على حد سواء. إزالة الجلد عن طريق سحب بعناية مفتوحة مع ملقط لفضح LG. استخدام إضاءة إضافية فوق وتحت الأنسجة لمساعدة تصور LG.
    ملاحظة: LG، يمكن تمييزها من خلال مظهره كما برعم على القناة ضمن أكثر قتامة، اللحمة المتوسطة المختصرة، يجب أن تكون واضحة في هذه المرحلة.
  9. تبدأ بعناية لتشريح LG واللحمة المتوسطة المرتبطة بها (الرجوع إلى الرسم التخطيطي والصور) بعيدا عن الأنسجة المحيطة بها باستخدام ملقط، والحرص على عدم انتزاع LG أو القناة المرتبط به. مرة واحدة الغدة خالية من الأنسجة المحيطة بها، وإزالة بلطف الغدة بأكملها تجتاح ظهائر المحيطة بالعين في قاعدة القناة LG. الحرص على الحفاظ على اللحمة المتوسطة المحيطة ظهارة، والتي يمكن ملاحظتها بأنه اللحمة المتوسطة المختصرة التي invaginates في ظهارة.
    ملاحظة: بعض إزالة إضافية من TISSUه (أي شظايا العظام الصغيرة والعضلات والنسيج الضام) قد يكون ضروريا لتجنب الإشارات العوامل / النمو من الأنسجة المجاورة.
  10. للثقافة والحصاد 5 - 4 الغدد وما يرتبط بها من اللحمة المتوسطة في لوحة (ومطلي خطابات الضمان فور تشريح)؛ جمع ما لا يقل عن 14 الغدد في 100 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي العازلة تحلل لRT-PCR 6.

2. إعداد لوحات للفيفو السابقين الثقافة

ويستند هذا الإجراء على أن يعمل للغدة اللعابية تطوير 7،8.

  1. إضافة 200 ميكرولتر من DMEM F12 (تستكمل مع 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل) سائل الإعلام والثقافة مع 50 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك و 50 ميكروغرام / مل هولو-ترانسفيرين إلى 50 مم طبق قطره microwell ذات القاع الزجاجي 7.
    ملاحظة: تم اختيار DMEM F12 كما كنا في السابق وجدت أنه لتعظيم التشكل في الغدة اللعابية الجنينية.
  2. تطفو على 13 ملم البومرشح غشاء onate مع 0.1 ميكرون المسام على رأس وسائل الإعلام.
  3. خطوة اختيارية: تمييع 3-D laminin 1: 1 مع DMEM / F12 لجعل تركيز النهائي من 3 ملغ / مل (استخدم 200 ميكرولتر ماصة لخلط بلطف، الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة إذا ظهرت فقاعات). إضافة 15 ميكرولتر من هذا المخفف 3-D laminin لتصفية.
    ملاحظة: تم العثور على هذا التخفيف ليكون الأمثل للحفاظ على LG 3D في الدولة دون المساس المتفرعة الظهارية. ومع ذلك، فإنه ليس من الضروري لثقافة LG.
  4. وضع 5 - 4 LG على مرشح أو في laminin. ثقافة خطابات الضمان فيفو السابقين ل24 - 48 ساعة (الشكل 3) أو إصلاح مع PFA 4٪ لمدة 20 دقيقة لمزيد من التحليل قبل QPCR أو المناعية (الشكل 4). لتحليل QPCR من الأنسجة الغدية الجنينية، يرجى الرجوع إلى Rebustini وآخرون، 2011. لتحليل مناعي من الأنسجة الجنينية غدي يرجى الرجوع إلى الاستشهادات التالية: هوفمان وآخرون، (2002)، وشتاينبرغ ه.ر آل.، (2005).

3. الفأرة بعد الولادة والغدد الدمعية الكبار (LG): تشريح

  1. الموت ببطء الماوس ما بعد الولادة وفقا للمعايير المناسبة جنة أخلاقيات الحيوان. لالجراء بعد الولادة يوم 8 أو أقل، الموت ببطء بقطع الرأس مع مقص العقيمة. ليوم ما بعد الولادة 8 أو السن، رش الفراء مع الايثانول 70٪.
  2. لتحديد موقع LG، وضع الماوس الوحشي الجانب حتى تشريح تحت المجهر مع إضاءة من فوق. ملاحظة: يتم يحد LG ما بعد الولادة وتعليم الكبار من خلال الشريان السباتي، والعضلات الماضغة والأدمة (انظر الشكل 5).
  3. باستخدام مقص تشريح الصغيرة، وجعل شق صغير في البشرة أفقيا من حيث يجب أن يكون موجودا في LG.
  4. باستخدام ملقط، وسحب تفتح البشرة تجاه الأذن لفضح LG.
  5. استخدام ملقط لتخفيف بلطف LG من الأنسجة المحيطة.
  6. مرة واحدة يتم تحرير LG من الأنسجة المحيطة، وإزالة بعناية LG من قبل القناة،بواسطة تجتاح حيث القناة وظهائر المحيطة بالعين الاتصال (الشكل 1).
  7. خطابات الضمان في وضع RNA العازلة تحلل لRT-PCR، أو إصلاح مع PFA 4٪ لمدة 20 دقيقة للالمناعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إل جي تطور من خلال عملية الظهارية التشكل المتفرعة. صور Brightfield من خطابات الضمان الجنينية تشريح في E14، E15، E16، E17، وP2 توضح هذا الحدث.

figure-results-1
الشكل 1. LG تطور من خلال عملية الظهارية المتفرعة التشكل. Brightfield صور من خطابات الضمان الجنينية تشريح حديثا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

براعة للثقافة والتلاعب LG فيفو السابقين يوفر مزايا هامة لدراسة تطورها. وهذا يشمل السرعة التي يستطيع الباحث لاختبار الفرضيات والعديد من الاضطرابات التي يمكن القيام بها لتقييم مدى الظهارية، الخلايا العصبية، والخلايا البطانية mesencyhmal تتفاعل لتشكيل الجهاز. ومع ذلك، هناك عدد من المحاذير عند استخدام هذا النموذج. أولا، بحكم عزلتها لم تعد مرتبطة الغدة إلى الأوعية الدموية الطرفية أو الجهاز العصبي، والتي قد تؤثر على مسارات الإشارات التي يجري اختبارها إذا كانوا يعملون جنبا إلى ج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن نعترف التمويل المقدم من برنامج UCSF تخصيص الموارد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEM / F12 بدون HEPESSH3027101البنسلين الاستربتومايسين الحراري العلمي
P0781ألبومين سيجما-ألدريتش
من مصل الأبقارA9576سيجما ألدريتش
بارافورمالدهيد 16٪ محلول15710المجهر الإلكترونيالمخفف إلى 4٪ في 1x PBS
فوسفات مخزن محلول ملحي 10xBP665-1فيشر Scientific
Phosphate Buffered Saline 1xمحضر من 10x مخزون
holo-Transferrin bovineT1283Sigma-Aldrich25 & nbsp ؛ مجم / مل محلول مخزون في الماء. تجميد الحصص ذات الاستخدام الواحد عند -20   ؛ °C. أضف إلى وسائط DMEM / F12 إلى تركيز نهائي قدره 50   ؛ مو جم / مل.
حمض الأسكوربيك (فيتامين ج)A4544سيجما ألدريتش25   ؛ مجم / مل محلول مخزون في الماء. تجميد الحصص ذات الاستخدام الواحد عند -20   ؛ °C. أضف إلى وسائط DMEM / F12 إلى تركيز نهائي قدره 50   ؛ مو جم / مل.
أطباق BioLite 100 مم المعالجة بزراعةالأنسجة 130182Thermo Scientificغير المعالجة بزراعة الأنسجة.
مجهر ستيريو مع وحدة إضاءة فرعيةStemi 2000Carl Zeissيمكن استخدام أي مجهر تشريح ستيريو يحتوي على قاعدة ضوئية مرسلة.
قاعدة إضاءة المرحلة الفرعية لمجهر ستيريوTLB 4000أدوات التشخيص ، Inc.
فالكون 35  يمكن أيضا استخدام أطباق معالجة زراعة الأنسجة353001Corningغير المعالجة بزراعة الأنسجة.
أطباق قاع زجاجية غير مطلية مقاس 50 ممP50G-1.5-14-FMatTek Corporation
مجهر مضان واسعالنطاق Axio Observer Z1Carl Zeissيمكن استخدام أي مجهر مضان (مجهر تشريح مستقيم أو مقلوب أو ستيريو) لمراقبة تعبير GFP بتكبير منخفض باستخدام كاميرا رقمية متصلة.
المجهر متحد البؤرTCS SP5Leica Microsystemsالفحص المجهري متحد البؤر ضروري لرؤية هياكل الخلايا التفصيلية. يمكن استخدام أي مجهر متحد البؤر.
ملقط سويسري دقيق ، # 5 (11.2  سم)17-305XIntegra LifeSciences Corporationمطلوبة نصائح دقيقة لإزالة اللحمة المتوسطة من الظهارة. يمكن أيضا استخدام إبر التنغستن.
ملقط طرف قياسي من دومونت ، # 5 (11   ؛ سم)91150-20أدوات العلوم الدقيقة (الولايات المتحدة الأمريكية) ، Inc.مثالي لحصاد الغدد من الأجنة.
مقابض سكين جراحية بلاستيكية قابلة لإعادة الاستخدام ، النمط رقم 3.4-30Integra LifeSciences Corporation
شفرات جراحية معقمة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، رقم 104-310Integra LifeSciences Corporation
RNAqueous-Micro Total RNA IsolationAM1931Life Technologies
Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I3446-005-01Trevigen6 مجم / مل مخزون مخفف 1: 1 مع DMEM / F12
Crl / CD1 (ICR) يتم حصاد أجنة الفئرانفي مختبرات نهر تشارلزفي اليوم 14 (مع تحديد يوم اكتشاف القابس على أنه اليوم 0).
الأغشية المحفورة بالماء Nucleopore Track ، 0.1 & nbsp ؛ مو م حجم المسام ، 13   ؛ مم110405Whatman
الحامل في توقيت توقيت Pax6-Cre ، الفئران GFPTg (Pax-Cre ، GFP) 1Pgrمختبر جاكسونالفئران الاختيارية لتعلم كيفية تحديد موقع LG.
محلول علوم يمكن أيضا استخدام أطباق أطباق Kit

المراجع

  1. Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403(2014).
  2. Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development. Development. 127, Cambridge, England. 2563-2572 (2000).
  3. Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).
  4. Nigam, S. K. Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs. Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).
  5. Qu, X., et al. Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development. Development. 139, Cambridge, England. 2730-2739 (2012).
  6. Rebustini, I. T., et al. MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis. Developmental cell. 17, 482-493 (2009).
  7. Hoffman, M. P., et al. Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms. Development. 129, 24-5778 (2002).
  8. Steinberg, Z., et al. FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis. Development. 132, Cambridge, England. 1223-1234 (2005).
  9. Knox, S. M., et al. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, Science. New York, N.Y. 1645-1647 (2010).
  10. Magenheim, J., et al. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, Cambridge, England. 4743-4752 (2011).
  11. Jaskoll, T., et al. FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis. BMC developmental biology. 5, 11(2005).
  12. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).
  13. Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الزراعة خارج الجسم الحيالتشريح الجنينيالتشكل التفرعي الظهاريالمجهر الفلوري المناعيمثبطات الجزيئات الصغيرةعوامل النموالنموذج الفأريتثبيت الأنسجةالبروتينات التنموية
التلاعب في الغدة الدمعية الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.