الاستفادة من تصميم مخصص انجذاب غلفاني غرف لدراسة الاتجاه الهجرة من خلايا البروستاتا

Summary

نقدم طريقة لتطبيق مجال كهربائي فسيولوجي على خلايا البروستاتا المهاجرة والخالدة في غرفة جلفانوتاكس المصنوعة خصيصا. باستخدام هذه الطريقة ، نوضح أن خطين من خلايا البروستاتا غير السرطانية يظهران درجات مختلفة من اتجاه الهجرة في هذا المجال.

Abstract

يخدم الحقل الكهربائي الفسيولوجية الوظائف البيولوجية محددة، مثل توجيه الهجرة خلية في تطور الجنين، ثمرة العصبية الظهارية والتئام الجروح. تطبيق حقل كهربائي الحالي مباشرة إلى الخلايا المستزرعة في المختبر يدفع الهجرة الخلية الاتجاه، أو انجذاب غلفاني. طريقة انجذاب غلفاني 2-الأبعاد نظهر هنا يتم تعديل مع العرف بولي (كلوريد الفينيل) (PVC) الكاميرات، سطح الزجاج، وأقطاب البلاتين واستخدام مرحلة الآلية التي يتم تصوير الخلايا. غرف PVC وأقطاب البلاتين يحمل منخفضة السمية الخلوية وبأسعار معقولة وقابل لاعادة الاستخدام. سطح الزجاج والمسرح المجهر الآلية تحسين جودة الصور وتسمح التعديلات المحتملة على سطح الزجاج والعلاجات للخلايا. نحن بتصوير انجذاب غلفاني اثنين من غير مكون للأورام، خطوط خلد SV40 خلية البروستاتا، pRNS-1-1 وPNT2. هذه خطوط الخلايا اثنين تظهر بسرعة هجرة مماثلة وكلا تهاجر نحوالكاثود، لكنها تظهر درجة مختلفة من اتجاهها في انجذاب غلفاني. النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق هذا البروتوكول تشير إلى أن pRNS-1-1 وخطوط الخلايا PNT2 قد يكون لها سمات مختلفة الجوهرية التي تحكم ردود المهاجرة الاتجاه بهم.

Introduction

تم الكشف عن الحقول الكهربائية المحلية في الأنسجة المختلفة، مثل الجلد ^{1، 32، 33} و الدماغ ^2. يخدم الحقل الكهربائي الفسيولوجية الوظائف البيولوجية محددة، بما في ذلك توجيه تطور الجنين ^{3، 4،} توجيه ثمرة من العمليات العصبية ⁵ و ⁶ و تعزيز الظهارية والقرنية الجرح إغلاق ^{1 و 7.} في المختبر، وتطبيق حقل كهربائي الحالي مباشرة إلى الخلايا المستزرعة يقلد الحقل الكهربائي الفسيولوجية ويستحث الهجرة الخلية الاتجاه، أو انجذاب غلفاني. وقد درست انجذاب غلفاني في الخلايا الليفية ^{8، 9} الكيراتينية الأسماك، الظهارية البشري والخلايا الكيراتينية القرنية ^10-12، الخلايا اللمفية ^13، neuroblasts ^2، والخلايا العصبية السلف ^14. عندما تتعرض لمجال التطبيقية، والغالبية العظمى من الخلايا درس تهاجر إتجاهي نحو المهبطي (-) قطب. ومع ذلك، وعدة خلايا السرطان، بما في ذلك درجة عالية من النقيليخلايا سرطان الثدي البشرية والبروستاتا البشرية خط الخلايا السرطانية PC-3M، الانتقال إلى مصعدي (+) قطب ^{15 و 16.} واقترحت عدة آليات للتوسط انجذاب غلفاني أو لتفسير قدرة الخلايا على الإحساس الحقل الكهربائي، بما في ذلك تفعيل من EGF مستقبلات ^12، قناة الصوديوم الظهارية ^17، PI3K وPTEN ^18، وإطلاق الكالسيوم أيونات ^{15 و 19.} هذه الآلية ليست مفهومة تماما حتى الآن وأنه من الممكن أن تشارك مسارات إشارات متعددة في انجذاب غلفاني.

طريقة انجذاب غلفاني 2-الأبعاد نظهر هنا هو مفيد لتوصيف الهجرة الاتجاه من تمسكا، وخلايا متحركة، إما لمراقبة الهجرة الفردية خلية ^{10، 12، 17} أو الهجرة من ورقة من خلايا متكدسة ^{18 و 20.} يتم تعديل هذه التقنية من بنغ وجافي ^21، ونيشيمورا وآخرون. ¹⁰ مع حسب الطلب، غرف PVC واضحة، مع coversl قابلة للإزالةIPS يسمح لسهولة استرجاعها الخلية بعد انجذاب غلفاني للتحليل الثانوي، مثل التصوير المناعية مضان. السطح الزجاجي للغرف انجذاب غلفاني هو بصري متوافق، مما يسمح للتصوير في تضخم عالية ومع الخلايا fluorescently المسمى. كما يسمح التصميم التجريبي مع تعديل سطح الزجاج، مثل تغيير طلاء السطح أو رسوم. وتستخدم الفواصل مصنوعة من رقم 1 ساترة في غرف للحد من تدفق التيار فوق الخلايا. وبالتالي فإن التدفئة الجول، التي تتناسب مع مربع تدفق التيار، وليس من شأنه أن ارتفاع درجة حرارة الخلايا أثناء التجربة. الجسور أجار ربط تمنع الاتصال المباشر من الأقطاب الكهربائية مع الخلايا وتمنع تغيير درجة الحموضة متوسطة أو تركيز أيون خلال انجذاب غلفاني.

تم فحص اثنين من غير مكون للأورام البروستاتا خطوط الخلايا البشرية للاستجابة انجذاب غلفاني في هذه الدراسة. وpRNS-1-1 ²² و ²³ PNT2 كلاهما SV40 خلد، خطوط الخلايا التي تعتمد على عامل النمو معربا عن علامات الظهارية cytokeratin 5 و 8 و 18 و 19 مع التعبير منخفضة أو معدومة في البروستاتا محددة مستضد (PSA). كل من خطوط الخلايا تحافظ على مورفولوجيا المضلع من الخلايا الظهارية العادية، ولكن لوحظ اضطراب صبغي في تنميط نووي ^{22 و 24.} وعلى الرغم من pRNS-1-1 وPNT2 مشاركة سلوكيات مماثلة في معظم التجارب، إلا أنها تظهر الاختلافات في تشكيل هيكل عنيبية و انجذاب غلفاني. على مصفوفة 3-D، Matrigel، وpRNS-1-1 الخلايا تشكل هياكل جوفاء عنيبية مع شمعة تشبه البروستاتا العادية الغدة الأنسجة ^25. ومع ذلك، فإن الخلايا PNT2 تشكل الأجسام الشبه الكروية الصلبة دون التجويف أو ظهارة الاستقطاب ^26. كما تظهر الخلايا pRNS-1-1 استجابة galvanotactic أعلى من PNT2 في الدراسة الحالية. العلاقة بين تشكيل هيكل عنيبية وانجذاب غلفاني في pRNS-1-1 تشير إلى أن إشارات galvanotactic قد تلعب دورا في تنظيم العلاقات العامةostate الحركات الأنسجة الغدة ردا على الحقول الكهربائية الذاتية، ويوفر المزيد من الخصائص للتمييز بين هذه خطوط الخلايا 2.

Protocol

1. خلايا التثقيف البروستاتا

1. ثقافة pRNS-1-1 وPNT2 البروستاتا الخلايا على 100 ​​أطباق ثقافة ملم في المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع 10٪ FBS والمضادات الحيوية-مضاد فطري عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2. تحديث مستنبت كل يوم حتى تصل إلى خلايا 80٪ confluency للتجارب انجذاب غلفاني.

2. تجميع انجذاب غلفاني الغرف

1. تجميع الدوائر السفلى
   1. القضاء على انجذاب غلفاني غرفة من البلاستيك مع 2-بروبانول. تطبيق السداده الصف السيليكون البحرية حول فتحات دائرية على الجانب السفلي من الغرفة مع حقنة وإرفاق ساترة كبيرة (الشكل 1). استخدام الجانب الخلفي للقضيب من القطن لدفع أسفل ساترة وتمحو الغراء الزائد مع مسحات القطن. فتحات دائرية تسمح على المديين المتوسط ​​والتيار الكهربائي لتتدفق على الخلايا تقع بين اثنين من الخزانات المتوسطة الداخلية.
   2. قطع صغيرة ساترة لجعل 6 مم × 25 مم الفواصل مع علامة نقطة الماس.
   3. الوجه الغرفة. تطبيق 2 المشارب من الغراء السيليكون مع حقنة و / أو ملعقة معدنية لإنشاء 10 مم × 25 مم سطح القناة لمرفق الخلية بين فتحات دائرية 2 على الزجاج السفلي. الغراء 2 قطعة من الزجاج الفاصل بين فتحات دائرية 2. استخدام الجانب الخلفي من تطبيقها القطن لدفع أسفل الفواصل وتمحو الغراء الزائد مع مسحات القطن و / أو المسواك.
   4. تجف الغرفة لمدة 24 ساعة حتى يتم الشفاء الغراء السيليكون. نقع في غرفة المقطر بين عشية وضحاها بالماء لإزالة بقايا حمض الخليك من الغراء. تجفيف غرفة للاستخدام الفوري، أو تخزين غرفة لاستخدامها لاحقا في وعاء نظيف.
      
      الشكل 1: جمعية الغرفة أسفل انجذاب غلفاني. A) ومرفق ساترة كبيرة إلى أسفل غرفة نظيفة. B) Tالتعليم الجامعي يتم لصقها قطعة من الزجاج الفواصل بين فتحات دائرية 2 لإنشاء 10 مم × 25 مم قناة للخلايا لإرفاق.
2. بذر الخلايا على غرف انجذاب غلفاني
   1. إعداد تتطلب عدد من الغرف انجذاب غلفاني اللازمة للتجربة. كل سطر الخلية أو العلاج يتطلب غرفة انجذاب غلفاني واحدة. مسح غرف انجذاب غلفاني مع 2-بروبانول. غسل غرف مع العقيمة PBS 3 مرات والتحقق من تدفق السائل بين فتحات دائرية 2 في غرف.
   2. أرفق غرف في أطباق زراعة الخلايا العقيمة والسماح لهم لكي تتوازن في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. فصل الخلايا البروستاتا من طبق ثقافتهم باستخدام 5 مل 0.25٪ التربسين-EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحييد التربسين-EDTA مع 5 مل 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني.
   3. نقل الخلايا إلى 15 مل أنابيب وأجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 200 x ج، 37 ° C. نضح طاف واعادة تعليق الخلايا في 1 مل من مستنبت.
   4. يستغرق 20 μلتر من حل الخلية لتحميل إلى غرفة الفرز وحساب عدد الخلايا. ضبط تركيز الخلية إلى 8 × 10 ⁴ خلية / مل مع الثقافة المتوسطة.
   5. خذ غرف انجذاب غلفاني من C حاضنة 37 درجة. البذور 350 ميكرولتر من تعليق الخلية على كل من المجلسين.
   6. احتضان الخلايا في الدوائر بين عشية وضحاها في صحن الثقافة مع Kimwipe رطبة أو في غرفة الرطوبة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.

الشكل 2: البذر الخلايا إلى غرفة تجفف غرفة السفلى وتنظيفها وtrypsinized خلايا A) البروستاتا، عد ونقل إلى غرفة وحضنت بين عشية وضحاها B) ومرفق ساترة قصوى لختم الغرفة قبل التصوير...

3. Assembling أعلى غرف
   1. تجميع الغرفة العليا قبل التصوير. يمكن المجهر تستوعب سوى التصوير غرفة انجذاب غلفاني واحدة في وقت واحد. الاحماء 10 مل من مستنبت في 37 ° C لكل غرفة انجذاب غلفاني. نقل غرفة انجذاب غلفاني من الحاضنات إلى 37 درجة مئوية في درجات الحرارة لوحة.
   2. شطف الخلايا مع مستنبت لإزالة الخلايا غير مرتبط. ترك 400 ميكرولتر من المتوسطة في الغرفة. استخدام حقنة لتطبيق عالية الشحوم فراغ على رأس كل من الفواصل الزجاجية.
   3. إضافة ساترة صغيرة لختم الغرفة. اضغط بلطف إلى أسفل ساترة مع الجانب الخلفي للقضيب من القطن. تمحو المتوسطة الزائدة مع مسحات القطن.
   4. يجف سطح الزجاج وتطبيق عالية الشحوم فراغ لاغلاق الفجوة بين ساترة والغرفة. استخدام ملعقة معدنية لنشر الشحوم. إضافة 4 مل من مستنبت إلى الخزانات الداخلية والتحقق من تدفق السائل بين الخزانات.
4. جعل أجارالجسور
   1. قطع زوج من 2 بوصة أنابيب PVC طويلة (503/16 ID س 5/16 1/16 OD X ستريت)، والوجه وإدراجها في 100 مل دورق.
   2. قياس 200 ملغ Bacto آجار وإضافته في قارورة 50 مل مع 10 مل مستنبت لجعل 2٪ هلام أجار. الميكروويف لمدة 30 ثانية. تحميل هلام أجار إلى أنابيب بلاستيكية مع الماصة نقل. ترك الجسور أجار في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة لترسيخ آغار.
   3. إضافة 2 مل مستنبت إلى الخزانات الخارجية للغرفة انجذاب غلفاني. أدخل الجسور أجار إلى الخزانات المتوسطة الداخلية والخارجية لإجراء الحالية.

الرقم 3: تصوير الخلايا على غرفة رسم تخطيطي للتدليل على التجميع النهائي للغرفة انجذاب غلفاني. وختم الغرفة تماما مع ارتفاع الشحوم فراغ. يضاف المتوسطة رس ملء الخزانات، ويتم إدراج اثنين من الجسور أجار في الغرفة. ثم يتم تحويل غرفة انجذاب غلفاني إلى مرحلة المجهر وتعلق الأقطاب الكهربائية لتطبيق الحقل الكهربائي. ويظهر الجانبية الرأي من الغرفة انجذاب غلفاني تجميعها لإثبات أن يتدفق التيار الكهربائي على الخلايا من خلال الجسور أجار والفضاء بين غطاء زجاجي.

التصوير 3. الوقت الفاصل

1. التبديل على غرفة البيئية إلى 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ في ساعة تعميم الهواء 2 قبل التصوير.
2. التبديل على المجهر والشروع في البرمجيات الحصول على الصورة. معايرة مرحلة المجهر وحدد الهدف 10X.
3. نقل غرف انجذاب غلفاني إلى مرحلة المجهر، وتأمين الغرفة مع الشريط والتركيز على الخلايا. إدراج الأقطاب انجذاب غلفاني إلى الخزانات الخارجي مع الكاثود على الجانب الأيمن. تأمين الأسلاك والأقطاب مع الشريط.
4. التبديل على السلطة بوس لتطبيق حقل كهربائي الى قاعة المحكمة. قياس الجهد الناتج مع الفولتميتر عبر الغرفة لتصل إلى 2.5 فولت ل25 مم غرفة طويلة (100 فولت / مم). الحفاظ على قوة الميدان خلال التجربة عن طريق ضبط الانتاج الحالي.
5. تحديد 10 نقطة في جميع أنحاء الغرفة لتصوير فيلم في البرنامج لتوليد عشرة أفلام مرور الزمن. إعداد الشروط الاستحواذ على فترات 10 دقيقة لمدة 2 ساعة.
6. بدء التصوير وضبط الانتاج الحالي حسب الحاجة.
7. في نهاية التجربة، وإزالة غرفة من مرحلة وإصلاح الخلايا مع 95٪ كحول. كسر مفتوحة الغرفة بشفرة حلاقة لتنظيف وإعادة استخدامها.

4. الكمي لانجذاب غلفاني

1. تدوير الأفلام الوقت الفاصل بين وإعادة توجيه-القطب السالب إلى الجزء العلوي من الصور. تصدير الأفلام إلى تتبع خلية البرمجيات.
2. تتبع (س، ص) موقف 10-20 خلايا في كل نقطة في الوقت من كل فيلم (الشكل 4 A، B) يدويا.، وهو نفس اتجاه المجال الكهربائي، وسيتم احتساب المسافات الهجرة والزوايا نسبة إلى اتجاه الشمال والجنوب في تتبع الخلايا البرمجيات (الشكل 4C).
   ملاحظة: يتم تحويل متوسط ​​سرعة الهجرة من المسافة إجمالي الهجرة ومجموع وقت التصوير. يتم تحويل اتجاهها من زوايا لقيمة جيب التمام. إذا تهاجر الخلايا مع الاتجاهية عشوائي، فإن متوسط ​​صافي جيب التمام تكون قريبة من الصفر. إذا كانت الخلايا تهاجر مباشرة نحو الكاثود، فإن قيمة جيب التمام يكون +1. إذا كانت الخلايا تهاجر مباشرة نحو القطب الموجب، فإن قيمة جيب التمام يكون -1.

الشكل 4: تتبع خلية لقياس الاتجاهية A) تراكب خطوط تتبع مع ​​الصور الخلية. و(س، ص) مواقف الخلايا مانواتتبع LLY في الأفلام مرور الزمن. . إذا كانت الخلايا تهاجر بشكل عشوائي، فإن متوسط ​​جيب التمام هي قريبة من الصفر ب) ومع ذلك، إذا كانت الخلايا تهاجر نحو القطب السالب أو الموجب، فإن قيمة متوسط ​​جيب التمام هي قريبة من + (الكاثود) أو - (الأنود) 1.0 C ) وتقدم الاتجاهية التي كتبها قيمة جيب التمام، والتي يتم تحويلها من زوايا الهجرة (θ). جيب التمام (θ) يساوي نسبة المسافة من (المسافة الهجرة) إلى المسافة ب (المسافة المتوقعة لاتجاه المجال الكهربائي).

3. حفظ القياسات. استيراد البيانات إلى تطبيق قاعدة بيانات لحساب النتائج مجتمعة.
4. تصدير البيانات المجمعة لمتوسط ​​سرعة الهجرة ومتوسط ​​قيمة جيب التمام إلى جدول بيانات لرسم الرسوم البيانية (الشكل 5).

Results

وقد تم التحقيق سطرين من خلايا البروستاتا (pRNS-1-1 وPNT2) مع هذا الأسلوب. خلايا في كل خطوط تهاجر بسرعة مماثلة من 1.0 +/- 0.3 ميكرون / دقيقة على مدار 2 ساعة (الشكل 5A). ومع ذلك، يكون الاتجاه إلى المجال الكهربائي هو 0.7 +/- 0.3 لpRNS-1-1 الخط، و 0.2 +/- 0.8 للخط PNT2 (الشكل 5B). تظهر النتائج وجود اختلاف كبير في انجذاب غلفاني هذه خطوط الخلايا اثنين (P <0.01، تم تتبع 100 خلية)، مما يوحي بأن لديهم مختلف آليات الإشارات الخلوية التي تؤدي إلى استجابات ...

Discussion

وقد تم تحليل استجابة انجذاب غلفاني الخلية مؤشرا وظيفي مهم لكثير من المهاجرة الخلوية أو نمو عمليات ^{27، 28،} وهنا نستخدم غرفة مصنوعة خصيصا مع سطح الزجاج لتصوير اثنين من خطوط الخلايا البروستاتا. هذه خطوط الخلايا أظهرت درجات مختلفة من انجذاب غلفاني، ونحن التكهن بأن توطين داخل الخلايا أو تفعيل البروتينات التوسط انجذاب غلفاني قد تدخلت خلال عملية توليد خطوط الخلايا الخالدة، مما أسفر عن الفرق الذي لوحظ في الاستجابة انجذاب غلفاني.

Materials

Cells< / strong>
pRNS-1-1 خلايا			Lee, et al.< / em> (1994)
خلايا البروستاتا PNT2	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon, et al.< / em> (1995)<
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	الاحماء حتى 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام
مصل الأبقار الجنيني - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10٪ في PBS ، تسخين حتى 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام
مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x)	تضيف Life Technologies	15240	5 مل إلى 500 مل متوسط
2-بروبانول	VWR	BDH1133-5GL
PBS	-		137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد الصوديوم ، 4.3 ملي Na 2< / sub>HPO4< / sub> و 1.5 ملي مولار KH2< / sub>PO4< / sub> في 1,000 مل من H2< / sub> O ، درجة الحموضة إلى 7.4 والتعقيم ، التسخين حتى 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام
0.25٪ Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056	الاحماء حتى 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام ، عالج الخلايا لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة ؛ C
<قوي>جهاز Galvanotaxis< / قوي >
غرف Galvanotaxis	Precision Plastics Inc ، CA		مصممة خصيصا (1/4 "× 2" × 3.5 بوصة) ، غرف PVC غير سامة وواضحة. يرجى الاتصال بالمؤلفين للحصول على مواصفات التصميم.
أقطاب Galvanotaxis أقطاب	UCD متجر		من البلاتين ملفوفة مع أسلاك مرنة
صندوق طاقة Galvanotaxis	هندسة الركيزة ، خرج طاقة التيار المستمر المصمم		خصيصا مع زجاج
غطاء مجهر الفولتميتر ، كبير ، 45 × 50 مم ، رقم 1.5	فيشر	12-544-F
زجاج ، صغير ، 25 × 25 مم ، رقم 1	ThermoScientific	3307
علامة نقطة الماس	ThermoScientific	750
سدادة السيليكون من الدرجة البحرية ، واضحة	3M	051135-08019
شحم عالي الفراغ	داو كورنينج	2021846-0807
6 مل حقنة	فيشر Scientific	05-561-64
حقنة Nichiryo ، 1.5 مل	Nichiryo	SG-M
قضيب القطن	منتجات بورتيان الطبية	806-WC
كيوتبس	جونسون آند أمبير جونسون	729389
Nalgene 180 أنابيب PVC	Nalgene	8000-9030	503/16 ID × 5/16 OD × 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	يجعل محلول أجار 2٪
Razor Blade	Personna	74-0001
المعدات والبرمجيات< / قوي>
منضدة الطرد المركزي	Eppendorf	5810R	تعمل مع A-4-62 دوار
عداد السيلومتر التلقائي T4	Nexcelom	غرف
	Nexcelom	CHT4-SD100-002	تحميل 20 &# 956 ؛ ل حلول الخلايا لحساب
لوحة الاحترار بدرجة حرارة الثقافة	Bel-Art Scienceware	370150000	للحفاظ على غرف galvanotaxis عند 37 درجة ؛ ج
مجهر Eclipse TE-2000 مع المرحلة الآلية والغرفة البيئية	نيكون
خطة فلور 10X / 0.30 الموضوعية لين	كاميرا نيكون
ريتيجا EX CCD	Qimaging		كامارا CCD المبردة ، أحادية اللون ، هواء مضغوط 12 بت
مع 5٪ CO2< / sub>	Airgas		طلب خاص
Volocity 6.3	PerkinElmer		Image الحصول على برنامج
Improvision: OpenLab 5.5.2	برنامج تتبع خلية PerkinElmer		ومخصص لقياس زوايا الترحيل
FileMaker Pro Advanced ، 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 لنظام التشغيل Mac	Microsoft