نحن هنا وصف تقنية المجهر بسيطة ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع للحصول على فيديو عالي الجودة الرقمية من ذبابة الفاكهة الكبار والظواهر متحولة اليرقات من منظور جانبي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
شراء عالية الجودة الفيديو الرقمية ذبابة الفاكهة السلوكيات اليرقات والكبار من منظور الجانبي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو نظام النموذج التجريبي قوية لدراسة وظيفة الجهاز العصبي. طفرات الجينات التي تسبب خلل في الجهاز العصبي غالبا ما تنتج اليرقات قابلة للحياة والكبار التي تحرك الظواهر المعيبة التي يصعب تصف بدقة مع النص أو تمثل تماما مع صورة فوتوغرافية واحدة. أوضاع الحالية النشر العلمي، ومع ذلك، ودعم تقديم وسائط الفيديو الرقمي كمادة تكميلية لمرافقة مخطوطة. نحن هنا وصف تقنية المجهر بسيطة ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع للحصول على فيديو عالي الجودة الرقمية لكل من ذبابة الفاكهة الظواهر اليرقات والكبار من منظور جانبي. فيديو للتنقل اليرقات والكبار من الرؤية الجانبية هو مفيد لأنه يسمح للمراقبة وتحليل الفروق الدقيقة والاختلافات في السلوكيات الشاذة قاطرة. لقد استخدمت بنجاح هذه التقنية لتصور وقياس aberranر الزحف السلوكيات في يرقات العمر الثالث، بالإضافة إلى الظواهر والسلوكيات متحولة الكبار بما في ذلك الاستمالة.
المقدمة
ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء البطن شيوعا هو نظام النموذج التجريبي قوية لدراسة وظيفة الجهاز العصبي 1-3. الحفظ التطوري للبنية ووظيفة الجهاز العصبي مع البشر، فضلا عن سهولة التلاعب الجيني ومجموعة واسعة من الأدوات الوراثية يجعل ذبابة الفاكهة الكائن العرض الأول لنموذج أمراض الاعصاب البشري 4. طفرات الجينات التي تسبب خلل في الجهاز العصبي وغالبا ما يؤدي إلى يرقات متحولة وقابلة للحياة الكبار ذبابة الفاكهة مع ضعف الحركة. وتشمل الظواهر التي لوحظت في الجهاز العصبي المسوخ معيبة معدل الحركة والتنسيق الشاذة، وحركات تشنجية في البالغين، وكذلك العجز في انكماش تحوي من الجسم الجدار العضلي، والشلل الجزئي لليرقات تخفيضها. وقد استغلت هذه الظواهر في تطوير شاشات الوراثية الإنتاجية العالية والمقايسات تنقل اليرقات متحولة 5و 6 و 7-10 الكبار ذبابة الفاكهة التي تهدف إلى قياس انخفاض تنقل وتحديد الجينات الضرورية لوظيفة الجهاز العصبي. في حين أن هذه الأساليب هي مفيدة للغاية لقياس السلوكيات قاطرة اليرقات والكبار، فشلوا في نقل المعلومات النوعية عن كل سلوك منحرف محدد. على سبيل المثال، في حين متحولة الثالثة يرقات العمر قد يحمل المعلمات تنقل المتغيرة في الفحص السلوكي، قد يكون من غير الواضح ما إذا كان هذا هو نتيجة لتغيرات في تقلصات تحوي الإيقاعي خلال دورة الزحف، نقص عام في التنسيق، أو الشلل الجزئي من الجسم الخلفي الجدار العضلي. نحن هنا وصف تقنية المجهر بسيطة ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع للحصول على فيديو عالي الجودة الرقمية من ذبابة الفاكهة الكبار والظواهر قاطرة اليرقات من منظور جانبي. الفيديو الرقمي المكتسبة من منظور جانبي يسمح الملاحظة المباشرة وتحليل الفروق الدقيقة في وكوموتيفالبريد السلوكيات من أكثر بالمعلومات الجانبية الرأي التوجه.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. نظام ستيريو المجهر
ملاحظة: على الرغم من هذا البروتوكول هو قابل للتكيف بسهولة إلى أي تقريبا نظام ستيريو المجهر بالإضافة إلى كاميرا رقمية لديها القدرة على الحصول على شريط فيديو، وتقدم تفاصيل عن النظام المستخدم في مختبرنا (جدول المواد / المعدات).
- الحصول على الفيديو الرقمي باستخدام مجهر ستيريو ثلاثي العينيات بالإضافة إلى كاميرا رقمية التجارية.
- من أجل زوجين الكاميرا الرقمية التجارية إلى ميناء ثلاثي العينيات المجهر ستيريو، وإزالة ½x C-جبل من ميناء PHOTOTUBE المجهر ستيريو واستبدالها 1X C-جبل.
- جبل مقرنة كاميرا رقمية (43 ملم موضوع) إلى 1X C-جبل.
- جبل حلقتين خطوة إلى أسفل، 58 مم إلى 48 مم، و 48 مم إلى 43 مم، إلى مقرنة الكاميرا لسد اتصال من مقرنة الكاميرا الرقمية لمجموعة عدسة محول للكاميرا الرقمية.
- تركيب كاميرا رقمية لعدة محول العدسة.
- الحصول على الفيديو مع التكبير المجهر وزوم بصري من مجموعة الكاميرات الرقمية لتكبير مجتمعة حوالي 12X (30 لقطة في الثانية، 640 × 480 بكسل). ملاحظة: يجب أن يتم تعويض التكبير المجهر ستيريو وفقا لإعادة تشكيلها حديثا 1X C-جبل من ميناء ثلاثي العينيات.
2. التصوير ذبابة الفاكهة يرقات الطور الثالث
- الشريط علامة دائمة على لوحة سوداء من مرحلة المجهر ستيريو بالإضافة إلى كاميرا رقمية حتى يتسنى للجانب الغطاء علامة تحتل ما يقرب من ⅓ إلى ¼ الحقل الرأسي للرأي لوحظ في رصد الكاميرا LCD. استخدام قمم علامة كمرحلة لأداء التصوير اليرقات لأنها تأتي في مجموعة متنوعة من الألوان التي يمكن استخدامها لرمز اللون والتفريق بين الأنماط الجينية لليرقات التي يجري تصويرها.
- ترسيم مجال الرؤية لاحظ في الشاشة LCD الكاميرا الرقمية على سطح أعلى علامة مع نقطة غرامةعلامة.
- اختر يرقة الطور الثالث إلى الصورة. وكانت معايير اختيار يرقات العمر الثالث طول الجسم، وظهور من مصدر الغذاء خلال مرحلة اليرقات من دورة الحياة، فإن وجود الفتحات التنفسية الأمامية والخلفية، وهيكل السنانير الفك السفلي من الفم الجهاز 11. ضمان اليرقة نظيفة قبل غسله جيدا في الماء.
- إلقاء الضوء على مرحلة أعلى علامة دائمة من فوق مع الضوء من نظام الإضاءة الألياف البصرية. ضبط زاوية ضوء الحادث لتوفير الإضاءة المثلى.
- تركيز المجهر على حافة أعلى علامة دائمة. ستبدأ بالحصول على الفيديو الرقمي.
- وضع اليرقة على جانب الغطاء علامة حوالي 75 درجة بعيدا عن المحور الرأسي، خارج مجال الرؤية، مع الأمامي من اليرقة التوجه نحو مجال الرؤية (الشكل 1). ملاحظة: تنسيب اليرقة على جانب الغطاء علامة يسمح للكاميرا لتسجيل حركة من الالبريد يرقة من منظور جانبي. فهو يساعد على الحفاظ على يرقة رطبة بالماء حتى لا تسقط على جانب الغطاء علامة. يجب توخي العناية، ومع ذلك، لعدم استخدام الكثير من المياه وكميات مفرطة ستلتزم اليرقة حيث يزحف عبر الحقل.
- كزة بلطف وهمز اليرقة مع الفرشاة الصغيرة لإكراه على الزحف عبر مجال الرؤية. التريث اليرقات نادرا ما تتعاون وغالبا ما يجب أن عاد إلى نقطة البداية عدة مرات قبل أن الزحف مباشرة عبر الحقل.
- سجل حوالي 10-15 دقيقة من دون انقطاع لقطات الفيديو الرقمية والمحاصيل، وإزالة جميع اللقطات التي لا داعي لها بعد الاستحواذ مع برامج تحرير الفيديو الرقمي.
3. التصوير الكبار ذبابة الفاكهة
- وضع بالغ واحد ذبابة الفاكهة في التخلص منها 1.5 مل الطيفية البوليسترين كوفيت.
ملاحظة: CO 2 تخدير الكبار ذبابة الفاكهة فورا قبل behavبروتوكول تحليل ioral يمكن بخرق النتائج 12. فمن المستحسن أن الكبار ذبابة الفاكهة أن تعطى فترة 24 ساعة للتعافي من CO 2 تخدير قبل تنفيذ في اختبار السلوكي 13. - المكونات نهاية كفيت مع كرة القطن الصغيرة. ضمان معبأة الكرة القطن ضيق بما فيه الكفاية لاحتلال الفضاء قبعة كبيرة وتحصر الطاير إلى المقصورة انخفاض حجم كفيت.
- وضع كفيت على لوحة بيضاء مرحلة المجهر ستيريو ومحاذاة بشكل صحيح مقصورة انخفاض حجم كفيت مع مجال الرؤية لاحظ في الشاشة LCD الكاميرا الرقمية.
- تضيء كفيت من فوق مع الضوء من نظام الإضاءة الألياف البصرية. ضبط زاوية ضوء الحادث لتوفير الإضاءة المثلى.
- تركيز المجهر وستبدأ بالحصول على الفيديو الرقمي.
- سجل حوالي 30-45 دقيقة من دون انقطاع لقطات الفيديو الرقمية والمحاصيل، وإزالة جميع لا لزوم لهالقطات ما بعد الاستحواذ مع برامج تحرير الفيديو الرقمي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لقد استخدمت بنجاح هذه التقنية لاكتساب وتحديد النمط الظاهري السلوكية اليرقات المرتبطة بفقدان ظيفة الجين stathmin (الشكل 2) 14. الجين يشفر بروتين stathmin التنظيمي أنيبيب أن جدران تويولين dimers من برك من تويولين القابلة للذوبان، ويربط الأنابيب الدقيقة ويشجع على التفكيك 15،16. مطلوب وظيفة Stathmin للحفاظ على سلامة الأنابيب الدقيقة في محاور عصبية من الأعصاب الطرفية 14. تعطل النشاط stathmin في ذبابة الفاكهة ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
قوة ذبابة الفاكهة السوداء 'ق كنظام نموذج لدراسة وظيفة الجهاز العصبي تنبع إلى حد كبير من التقارب من أدوات قوية الجينية المتاحة ومجموعة واسعة من المقايسات سلوكية قوية المتقدمة. هنا نقدم تقنية المجهر بسيطة ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع للحصول على فيديو عالي الجودة الرقمية من ذبابة الفاكهة الكبار والظواهر قاطرة اليرقات من منظور جانبي. وقد استخدمنا بنجاح هذا النهج لتوصيف وقياس شدة الشلل الخلفي "ذيل الوجه" الظواهر التي لوحظت في الطور اليرقي الثالث المس...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وقد أعلن الباحثون أن لا وجود المصالح المتنافسة.
شكر وتقدير
الكتاب نود أن نعترف الكسندرا أوبي للحصول على المساعدة الفنية والدعم، جيمس بارتون لتوفير السرد الفيديو، ورامونا Flatz وJoellen سويني لتظهر في شريط الفيديو المصاحب. وأيد هذا العمل من قبل صندوق موردوك MJ الخيرية (منحة رقم 2012205 لJED).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مجهر Stereozoom ثلاثي العينيات | شركة أوليمبوس | SZ6145TR | ½ تمت إزالة C-mount واستبداله بمقرنة الكاميرا الرقمية 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| (خيط 43 مم) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 مم إلى 48 مم الحلقة النزوح | B& | Video GBSDR5848 | |
| 48 مم إلى 43 مم حلقة التنحي | B& H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit ل Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 مل بوليستيرين كوفيت طيفي | دينفيل Scientific | U8650-4 |
المراجع
- Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. Drosophila neurobiology: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Frank, C. A., et al. New approaches for studying synaptic development, function, and plasticity using Drosophila as a model system. J Neurosci. 33, 17560-17568 (2013).
- Mudher, A., Newman, T. Drosophila : a toolbox for the study of neurodegenerative disease. , Taylor & Francis Group. (2008).
- Bilen, J., Bonini, N. M. Drosophila as a model for human neurodegenerative disease. Annu Rev Genet. 39, 153-171 (2005).
- Jakubowski, B. R., Longoria, R. A., Shubeita, G. T. A high throughput and sensitive method correlates neuronal disorder genotypes to Drosophila larvae crawling phenotypes. Fly (Austin). 6, 303-308 (2012).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants). Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 16053-16058 (2003).
- Jahn, T. R., et al. Detection of early locomotor abnormalities in a Drosophila model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 197, 186-189 (2011).
- Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. PLoS ONE. 7, e37250(2012).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (24), (2009).
- Colomb, J., Reiter, L., Blaszkiewicz, J., Wessnitzer, J., Brembs, B. Open source tracking and analysis of adult Drosophila locomotion in Buridan's paradigm with and without visual targets. PLoS ONE. 7, e42247(2012).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. (1965).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics.. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Duncan, J. E., Lytle, N. K., Zuniga, A., Goldstein, L. S. The Microtubule Regulatory Protein Stathmin Is Required to Maintain the Integrity of Axonal Microtubules in Drosophila. 8, e683244(2013).
- Belmont, L. D., Mitchison, T. J. Identification of a protein that interacts with tubulin dimers and increases the catastrophe rate of microtubules. Cell. 84, 623-631 (1996).
- Cassimeris, L. The oncoprotein 18/stathmin family of microtubule destabilizers. Curr Opin Cell Biol. 14, 18-24 (2002).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
